Ferric-Chloride geïnduceerde trombose Muis Model op halsslagader en Mesenterium Vessel

Samenvatting

Het hierin beschreven model voor FeCl₃ geïnduceerde trombose bij muizen wordt hier beschreven. Er wordt een methode gepresenteerd om trombusgroei te bewaken door middel van intravitale microscopieobservatie op een mesenterisch vat en door bloedstroommeting in de halsslagader.

Samenvatting

Ernstige trombose en de daaruit voortvloeiende ischemische gevolgen zoals myocardinfarct, longembolie en beroerte zijn wereldwijd grote gezondheidsproblemen. De ferrichloride-blessure is nu een goed gevestigde techniek om snel en nauwkeurig de vorming van trombi te induceren in blootgestelde aders of slagaders van kleine en grote diameter. Dit model heeft een sleutelrol gespeeld in de studie van de pathofysiologie van trombose, in de ontdekking en validatie van nieuwe antitrombotische geneesmiddelen en in het begrijpen van de werkingsmechanismen van deze nieuwe middelen. Hier wordt de implementatie van deze techniek op een mesenteriaal vat en halsslagader bij muizen gepresenteerd. De methode beschrijft hoe circulerende leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden gelabeld met een fluorescerende kleurstof en hoe deze, door middel van intravitale microscopie op het blootgestelde mesenterium, hun accumulatie kunnen worden waargenomen aan de beschadigde vaatwand, wat leidt tot de vorming van een trombus. Op de halsslagader wordt de occlusie veroorzaakt door de stolselvorming gemeten door de bloedstroom te monitoren met een Doppler-sonde.

Inleiding

Het onderzoek van de bij de ontwikkeling van trombose en de evaluatie van de effectiviteit van anti-trombotische geneesmiddelen mechanismen vereist gevestigde experimentele diermodellen. Grote diermodellen waren de eersten die worden gebruikt als zij grote schepen meer op mensen dan knaagdieren ^1. Echter, hoge kosten, de grotere vereiste voorzieningen en de moeilijkheid genetisch manipuleren zijn belangrijke nadelen aan het gebruik en grote dieren zijn thans beperkt tot late preklinische studies eenmaal voorproeven op knaagdieren eindresultaten ² gegeven. Met brede beschikbaarheid van transgene en knockout stammen en hun kleine grootte die de hoeveelheid antitrombotische geneesmiddelen nodig voor in vivo onderzoek minimaliseert worden muizen voornamelijk gebruikt voor trombose onderzoek. Daarom zijn verscheidene modellen van trombotische aandoeningen ontwikkeld bij muizen ^3.

Vele gevestigde trombose modellen verstoren de intimeen laag van de vaatwand, gevolgd door blootstelling van de sub endotheliale extracellulaire matrix om de bloedstroom induceren van de vorming van bloedstolsels ^4. De trombi kan van blootstelling van collageen waarvan bloedplaatjes activering triggers of / en de blootstelling van weefselfactor waarvan de stollingscascade ⁵ activeert. Verschillende technieken worden vervolgens gebruikt om de oorspronkelijke vaatschade bereiken. Pierangeli et al. Ontwikkelden een mechanische verstoring model met een microchirurgie tool op de dijader ^6. Kikushi et al. Beschreef een model dat bestaat uit de toediening van een foto reactieve verbinding (Rose Bengal) dat zich ophoopt in de lipide bilaag van endotheliale cellen gevolgd door de specifieke excitatie van de vaatwand plaats met groen licht (540 nm) ^7. De schade kan ook veroorzaakt worden door een korte hoge intensiteit pulse laser belichting ^8. Een andere techniek allereerst vastgesteld aan de halsslagader van rattenbestaat in de topicale toepassing van ferrichloride _(FeCl3) ^9. In dit geval, het vaartuig erosie resultaten uit die door _FeCl3 vrije radicalen die lipideperoxidatie en vernietiging van endotheelcellen ¹⁰ veroorzaakt. De schade induceert de expressie van verschillende adhesiemoleculen triggering bloedplaatjesadhesie en aggregatie en leukocyten rekrutering. Het is aangetoond dat leucocyten, met name neutrofielen, spelen een cruciale rol bij de activatie van de bloedcoagulatie cascade die leidt tot trombose ^11. Deze methode is bijzonder geschikt voor de stollingscascade te reproduceren; onderzoekers moeten in gedachten houden dat, in dit muismodel, trombose wordt meestal veroorzaakt bij gezonde vaten terwijl trombose bij mensen voornamelijk plaatsvindt in zieke bv houden. atherosclerotische vaten.

Aangezien dit model is zeer eenvoudig te implementeren en is ook effectief bij muizen, is nu de meest gebruikte trombose model voor kleine dieren in vivo studies. Bovendien biedt deze techniek de mogelijkheid om de vorming van trombi in diverse vaten veroorzaken. Target schepen kunnen slagaders of aders van grote diameter (carotis, dijbeen, vena cava) of kleine diameter (mesenterium, cremaster) ^12-14. Meer recent werd ook gebruikt op het proximale cerebralis media een model van beroerte ¹⁵ ontwikkelen. De trombose formatie kan direct worden waargenomen door het opklaren na fluorescerende etikettering van bloedplaatjes en leukocyten of gevolgd door het meten van de bloedstroom daling met een temperatuur sonde of een Doppler sonde ^12,16,17. Diverse parameters zoals de occlusietijd, trombusvorming tijd of trombus grootte kan vervolgens worden onderzocht. De fysiologische verschillen tussen de vaten onderzochte resulteren in aanzienlijke verschillen in de trombi verkregen. Daarom onderzoekers selecteert gewoonlijk het doelvat volgens de parameters die ze willen measure en / of de ziekte instelling die ze willen onderzoeken. Kenmerkend het model de halsslagader relevanter voor onderzoek naar atherotrombose betrekking tot myocardinfarct of beroerte, terwijl studies naar de vena cava relevanter voor onderzoek naar diepe veneuze trombose. De toegankelijkheid van de verschillende vaten bepaalt ook de methode voor groei trombus te meten. Bijvoorbeeld, de mesenteriale vaten eenvoudig kunnen worden geopend waardoor dit model geschikt voor intravitale microscopische observatie en het bestuderen van de dynamica van trombusvorming. De halsslagader is minder toegankelijk, maar groter waardoor de bloedstroom metingen en bieden een uitstekend model om occlusieve trombose te bestuderen.

Het ferrichloride geïnduceerde trombose model heeft enorme vooruitgang die in het begrijpen van deze pathologie. Het is gebruikt in veel studies gericht op de rol van de von Willebrand factor in trombosevorming ^18,19. Gecombineerd met genetische modicatie technieken heeft het mogelijk gemaakt een groot aantal specifieke gen betrokken bij trombotische aandoeningen. Lamrani et al. bijvoorbeeld gebleken dat een knock-in van het JAK2 ^V617F gen is gekoppeld aan een versnellende vorming van instabiele stolsel ^20. Zhang et al. Hebben de fysiologische gevolgen van de bloedplaatjes P2Y12 receptor onderzocht en aangetoond dat transgene muizen overexpressie specifiek deze receptor in bloedplaatjes alleen weergegeven een snelle en stabiele trombusvorming in mesenterica verwond met _FeCl3 ^21. De cruciale rol van weefsel-type plasminogeen activator (tPA) en urokinase-type plasminogeen activator (uPA) in fibrine degradatie leidt is onderzocht bij deze methode ^22. Verder biedt dit model ook een eenvoudige en nauwkeurige manier testen van de fibrinolytische capaciteit van vele nieuwe geneesmiddelen in vivo. Zo hebben Wang et al. Dit model th tweedehandse preklinische validatie van een nieuw recombinant plasminogeenactivator gericht tegen geactiveerde plaatjes ^23. Deze methode staat ook de validatie van therapeutische eiwitten geïsoleerd uit het speeksel van teken, vampier vleermuizen en muggen of uit het gif van slangen met een specifieke identificatie van de doelgroep ^24-27. Deze voorbeelden demonstreren de veelzijdigheid van het ferrichloride model. In dit artikel richten we ons op twee methoden en studie ijzerchloride geïnduceerde trombose op twee verschillende type drukvat; mesenterische vat en halsslagader.

Protocol

Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de Alfred Medical Research en Opleiding Precinct Animal Ethics Committee (E / 1534/2015 / B). Alle chirurgische manipulaties werden uitgevoerd onder volledige narcose en de dieren hebben geen pijn ervaren in elk stadium. Alle experimenten worden beschreven, zijn niet-herstel.

1. Voorbereiding

1. Snijd dunne banden van filter papier (1 mm x 2 mm).
2. Vers bereiden 2 oplossingen ferrichloride van 4% (w / v) en 6% (w / v) verdund in gedeïoniseerd water. Bereid rhodamine 6G-oplossing 0,3% in PBS, gefiltreerd door 0,22 urn.
3. Snijd een klein stukje (5 mm x 1 cm) van het witte plastic van de spuit wrapper.

2. Mesenterium arteriole Trombusvorming Waargenomen door Intravitale Microscopie

1. Weeg een 10-12 weken oude mannelijke C57BL / 6 wildtype muis en dus verdoven met een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg), maar intraperitoneale injectie. Bewaken van de diepte van de anesthesie door respons tot teen, staart en / of de huid knijpen, reactiviteit van het hoornvlies en oogleden knijpen, en de afwezigheid van snorharen beweging. Eventueel Injecteer tweede dosis ketamine (50 mg / kg) verdoving van het dier te handhaven. Breng vet zalf op de ogen tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Plaats de muis in een petrischaaltje geplaatst op een verwarmingselement aangepast tot 37 ° C.
   OPMERKING: Hoewel IP injectie kan pijn veroorzaken voor de dieren, de duur van deze ongemakken minimale (minder dan 3 seconden) zijn. Pijn en ongemak van injecties wordt beperkt door middel van ervaren en bekwaam personeel en geschikte naalden (25 G). Na alle procedures, euthanize alle dieren met behulp van een overdosis van ketamine en xylazine, gevolgd door cervicale dislocatie.
2. Voer een abdominale incisie van ongeveer 3 cm in de huid en knip het buikvlies.
3. Plaats de muis in de zijkant van het huisdierri schotel voorzichtig exterioriseren de darmen en voorzichtig uit het mesenterium met 2 wattenstaafjes een geschikt vat op het oppervlak van de petrischaal te brengen. Goed droog met een delicate wisser.
   OPMERKING: Om de beweging van de mesenteriale vaten te beperken, kan Papaverine worden gebruikt om darm peristaltiek remmen.
4. Week de staart van de muis in warm water om de vaten verwijden en injecteer 30 gl Rhodamine 6G (0,3%) in de staartader van de muis met een 29 G spuit leukocyten en bloedplaatjes label.
5. Plaats de petrischaal onder een omgekeerde microscoop en focus op de gekozen arteriole met de heldere veld kanaal.
6. Dompel een band filtreerpapier met 6% (w / v) ijzer (III) chloride en het filterpapier toegepast op de arteriole twee tang; de eerste die de filter papier, de tweede om voorzichtig op het op het gebied van belang vast te houden. Let trombusvorming in de eerste 10 seconden na het afzetten van het filterpapier.
   LET OP: Het is heel commop het midden microvasculatuur en de precisie van de afzetting van het filterpapier en de zacht druk verwonden Daarom moeten deze kwestie te beperken.
7. Observeer trombusvorming door fluorescentiemicroscopie (TRITC channel: piek excitatie 557 nm, piek emissie 576 nm), door het filter papier. Let op de circulerende leukocyten en bloedplaatjes die de Rhodamine 6G en hun aggregatie in de trombus hebben genomen is dus gemakkelijk te identificeren.
8. Neem het filterpapier na 1 minuut blootstelling aan ijzer (III) chloride en verder om de vorming van de trombus te controleren. Was het schip met PBS.
9. Observeer en noteer de dynamische vorming van de trombus benadrukt met de etikettering van bloedplaatjes en leukocyten met Rhodamine 6G. Leg de beelden en meten van de grootte van de trombus. De hierin gepresenteerde beelden werden verkregen met een omgekeerde intravitale microscoop, maar een objectieve 4X, in de TRITC fluorescentiekanaal.
10. Fadat alle procedures, inslapen het dier met behulp van een overdosis van ketamine en xylazine, gevolgd door cervicale dislocatie.

3. halsslagader Trombusvorming Afgaande van Blood Flow snelheidsmeting

1. Weeg een 10-12 weken oude mannelijke C57BL / 6 muis en dienovereenkomstig verdoven met een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) wel intraperitoneale injectie. Breng vet zalf op de ogen tot droog voorkomen terwijl onder narcose.
2. Bevestig de muis onder een operationele microscoop met plakband op benen, op een verwarmingselement aangepast tot 37 ° C.
3. Maak een kleine kussen uit een ruitenwisser en plak het onder de kop van de muis om het hoofd lichtjes verheffen. Gebruik een draad lus met een tang op de snuit naar beneden trekken (gebruik boventanden). Hierdoor wordt het gebied van de halsslagader blootleggen gemakkelijke toegang.
4. Voer een 5 mm diepe snede van de huid direct onder de kaak, tot aan het borstbeen.
5. Ontleden de fascia en isoleren van een fragment van de linker of rechter carotis communis boven de bifurcatie.
6. Zorgvuldig introduceren pincet in-tussen de slagader en het lef om ze te scheiden. Laat de zenuw loopt dicht bij de slagader niet storen en raak te veel van de halsslagader als het schade aan het schip kan veroorzaakt. Isoleer een doorsnede van ten minste 5 mm van de slagader.
7. Droog het gebied van de slagader juist met wissers te voorkomen dat er vloeistof hindert de _FeCl3.
8. Zet de kleine witte plastic stuk onder het geïsoleerde deel van de gemeenschappelijke carotis zodat de _FeCl3 niet genieten in de omliggende weefsels. Hiervoor gebruikt u een tweede tang om het stuk om de eerste langzaam de plastic papier onder de slagader te brengen en schuif.
9. Dompel een stuk filtreerpapier met 4% (w / v) en 6% (w / v) ferrichloride en plaats het rondom de slagader.
10. Na 3 min blootstelling, haal de filter papier, spoelen met PBS en droog het gebied wet ruitenwissers.
11. Plaats de Doppler flow sonde rond het schip in de gewonde gebied en start de opname van de veranderingen in de flow. In de gezonde halsslagader van volwassen muizen, de stroom gewoonlijk ongeveer 1 ml / min. Let op! contact van de probe met ferrichloride wordt de probe beschadigen zodat geen contact kan worden vermeden. De hierin gepresenteerde gegevens werden verkregen met een Transonic System Inc. Flow meter, TS420 perivasculaire module voorzien van een Nano Doppler sonde 0,5 PBS.
    OPMERKING: De concentratie van ferrichloride kan de kinetiek van trombusvorming resulteert in verschillende occlusie tijd wijzigen. Aldus werd een blootstelling aan 6% (w / v) ferrichloride wordt een sneller occlusie dan blootstelling aan 4% (w / v) ferrichloride.
12. Naar aanleiding van alle procedures, euthanaseren alle dieren met behulp van een overdosis van ketamine en xylazine, gevolgd door cervicale dislocatie en zorgvuldig reinigen van de Doppler sonde.

Resultaten

De fluorescentie microscopie intravitale observatie van het mesenterium wordt de accumulatie van Rhodamine 6G tonen gelabelde bloedplaatjes en leukocyten langs de vatwand verwond door _FeCl3. De geleidelijke vorming van een gedeeltelijk thrombus wordt bewaakt in een 200 urn mesenterium vat (Figuur 1). Een trombus langzaam weergegeven en is duidelijk herkenbaar na de eerste minuut van blootstelling aan _FeCl3 (figuur 1, t = 60 sec). 40 sec na verwijdering van het filt...

Discussie

De ijzerchloride geïnduceerde trombose model is een uitstekend research tool. Zoals getoond in deze studie, is het uiterst eenvoudig te implementeren en bij gebruik in combinatie met intravitale microscopie of Doppler flowmeter, biedt een goede real-time monitoring van trombusvorming. De belichtingstijd en de concentratie van _FeCl3 aanpassen, maar biedt ook de mogelijkheid om hetzij niet-occlusief of occlusieve trombi produceren.

Deze werkwijze heeft ook een aantal beperkingen. In...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Whatman-chromatografiepapier	GE Healthcare	3030917
IJzer (III) chloride 40% (w/v)	VWR	24212.298
Rhodamine 6G	Sigma	R4127
Omgekeerd microscoop	Olympus	IX81
Digitale zwart-witcamera	Olympus	XM10
Doppler-flowmeter	Transonic	TS420
Nano-doppler flow sonde	Transonic	0.5 PBS
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazin (Rampun)	Bayer	75313
Petrischaal	Sarstedt	82.1472
Insulinspuit (29 G)	BD Ultra-Fine	326103
Wattenstaafjes	BSN medical	211827A
Dynek dysilk hechtdraad	Dynek Pty Ltd	CS30100
Dulbecco's fosfaatbufferoplossing (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
Verwarmingskussen	Kirchner	T60