Methodenartikel

Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52850

⸱

27 juni 2015

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

In dit artikel

Samenvatting

Veranderingen in de intracellulaire calciumniveaus in de podocyten zijn een van de belangrijkste middelen om de filtratiefunctie van glomeruli te beheersen. Hier leggen we een high-throughput benadering uit die detectie van real-time calciumverwerking en activiteit van enkele ionkanalen in de podocyten van de vers geïsoleerde glomeruli mogelijk maakt.

Samenvatting

Podocyten (epitheelcellen van het nierglomerulus) staan erom bekend dat ze de glomerulaire permeabiliteit reguleren en de glomerulaire structuur behouden; een sleutelrol voor deze cellen in de pathogenese van verschillende nieraandoeningen is vastgesteld, aangezien podocytenschade leidt tot proteïnurie en effacetie van de voetprocessen. Eerder werd gemeld dat verschillende endogene agentia een dramatische overbelasting van de intracellulaire Ca2+concentratie in podocyten kunnen veroorzaken, leidend tot albuminurie, en dit gebeurt waarschijnlijk via calciumgeleidende ionenkanalen. Daarom leek het belangrijk om calciumverwerking in de podocyten te bestuderen, zowel onder normale omstandigheden als in verschillende pathologische toestanden. De beschikbare experimentele benaderingen zijn echter enigszins beperkt gebleven tot gekweekte en getransfecteerde cellen. Hoewel ze een goed basismodel vertegenwoordigen voor dergelijke studies, worden ze in essentie uit de oorspronkelijke omgeving van het glomerulus geëxtraheerd. Hier beschrijven we de methodologie om podocyten te bestuderen als onderdeel van het vers geïsoleerde gehele glomerulus. Deze voorbereiding behoudt het functionele potentieel van de podocyten, die nog steeds aan de haarvaten zijn bevestigd; daarom blijven podocyten in de omgeving die de belangrijkste delen van het glomerulaire filtratieapparaat behoudt. Het huidige manuscript gaat dieper in op twee experimentele benaderingen die 1) realtime detectie van veranderingen in calciumconcentratie mogelijk maken met behulp van ratiometrische confocale fluorescentiemicroscopie, en 2) het opnemen van de activiteit van enkele ionenkanalen in de podocyten van de vers geïsoleerde glomeruli. Deze methodologieën benutten de voordelen van de oorspronkelijke omgeving van het glomerulus die onderzoekers in staat stellen acute veranderingen in de intracellulaire calciumverwerking in reactie op toepassingen van verschillende agentia op te lossen, basale calciumconcentraties binnen de cellen te meten (bijvoorbeeld om de ziekteprogressie te evalueren) en calciumgeleiding op het niveau van enkele ionenkanalen te beoordelen en te manipuleren.

Inleiding

Nieren handhaven homeostatische balans voor diverse stoffen en reguleren bloedvolume op een manier die totaal bloeddruk bepaald. Verstoringen in de renale filtratie, reabsorptie of secretie leiden of begeleiden pathologische toestanden, gaande van hyper- of hypotensie tot eind nierziekte die uiteindelijk nodig niertransplantatie. De renale filtereenheid (glomerulus) bestaat uit drie lagen - de capillaire endotheel, basaalmembraan en een eencellige laag van epitheelcellen - podocytes, die een belangrijke rol in de handhaving van het spleetvormige diafragma integriteit en functie 1 zijn. Disfunctie in de permselectief glomerulaire filter veroorzaakt urine verlies van macromoleculen, zoals proteïnurie. Verschillende middelen kunnen de structuur van de podocytes en hun voeten processen die de integriteit van de glomeruli filtratie barrière bepalen beïnvloeden.

De podocytes zijn betrokken bij het onderhoud van de Glomeruli filtratie functie. Vastgesteld is dat incorrect calciumhuishouding van de podocyte leidt tot celbeschadiging en speelt een belangrijke rol bij de progressie van verschillende vormen van nefropathie 2,3. Daarom is ontwikkeling van een model waarmee directe meting van intracellulaire calciumconcentratie veranderingen instrumentele voor onderzoek podocyte functie zijn. Geïsoleerde glomeruli werden eerder gebruikt in een groot aantal studies, waaronder het meten van albumine reflectiecoëfficiënt verandert 4 en evaluatie van de integrale cellulaire stromingen in de whole-cell elektrofysiologische patch-clamp metingen 5,6. In dit artikel beschrijven we het protocol dat de onderzoeker mogelijk maakt om intracellulaire calciumconcentratie verandert in reactie op verzoeken van farmacologische middelen te meten, schatten basale niveaus van calcium in de cellen, en beoordeelt afzonderlijke calciumkanalen activiteit. Ratometric calciumconcentratie metingen en patch-clamp electrophysiology werden gebruikt om veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie in het podocyte en kanaalactiviteit respectievelijk bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Animal gebruik en welzijn moeten zich houden aan de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren volgende protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) beoordeeld en goedgekeurd.

1. Nier Flush

  1. Gebruik 8-12 weken oude mannelijke ratten (beoogd is een stam Sprague Dawley, maar andere stammen van verschillende leeftijd en geslacht kunnen worden gebruikt met geschikte wijzigingen).
  2. Verdoven het dier volgens de procedure toegestane IACUC protocol; monitoren diepte van de anesthesie en inspecteer het dier. De gedetailleerde beschrijving van de ingreep wordt uitgevoerd in 1,3-1,8 ligt in Ilatovskaya et al 7.
  3. Na een goede verdoving, plaats het dier op een temperatuur-gecontroleerde chirurgische tafel, maak een middellijn incisie van de buik (tot 3 centimeter in lengte), en ontdek de vena cava en de aorta.
  4. Plaats ligatuur rond de coeliakie en superieure mesenteriale slagaders en de buikaorta boven die; niet ligeren.
  5. Blunt ontleden de abdominale aorta onder de nierslagaders en plaats twee ligaturen rond het, maar niet ligeren, vervolgens klem de aorta boven de ligaturen en bind de onderste draad.
  6. Katheteriseren de aorta met een polyethyleen PE50 buis (bevestigd aan een injectiespuit pomp gevuld met PBS) onder de klem en bevestig de katheter met de tweede ligatuur; Verwijder de klem, zet de pomp, en ligeren van de aorta en mesenterische met coeliakie slagaders. Maak snel incisie in nierader om de druk te verlichten.
  7. Giet de aorta met de vooraf gekoelde PBS gedurende 2 of 3 minuten bij een snelheid van 6 ml / min.
  8. Stop perfusie, accijnzen en decapsulate 7 de nieren, en leg ze op ijs in de PBS-oplossing. Euthanaseren van de dieren volgens het protocol door IACUC goedgekeurd.

2. Isolatie van de Rat glomeruli

  1. Bereid 30 ml verse oplossing van 5% BSA in RPMI 1640.
  2. Met behulp van een scheermesje en schaar,isoleren van de cortex van beide nieren, en vervolgens gehakt tot een homogene massa. Deze procedure is eerder 7 beschreven.
  3. Duw het weefsel fijngehakt in de vorige stap door een 100 mesh roestvrijstalen zeef (vooraf geweekt in 5% BSA / RPMI-oplossing) met een spatel. Verzamel de doorstroom en door zwaartekracht kan de doorstroom door een 140 mesh zeef.
  4. Filtreer de doorstroom vanuit het 140 mesh zeef met een geweekte 200 mesh zeef, het filtraat weg en spoel de bovenkant van de zeef met 10-15 ml van de geprepareerde BSA / RPMI oplossing voor de glomeruli die sediment te verzamelen de zeef.
  5. Zet de BSA / RPMI bevattende glomeruli op ijs in een 15 ml buisje en laat de glomeruli sediment op de bodem van de buis gedurende maximaal 20 minuten. De glomeruli concentreren op de bodem van de buis duidelijk zichtbaar. Verwijder de overtollige oplossing, laat ongeveer 2 ml in de buis.

3. Single-channel Patch-clamp Elelektrofysiologie

  1. Bereid 5 x 5 mm dekglas chips door het bekleden ze met MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-lysine, en laten drogen. Gebruik ongeveer 30 ul van 0,01% steriel gefiltreerd oplossing in water per couvert glas.
  2. Warmen de experimentele oplossingen voor RT en vul de patch-clamp kamer en pipet. Voor de bewaking TRPC kanalen, gebruik dan een bad oplossing, in mm: 126 NaCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glucose, pH 7,4; pipet: 126 NaCl, 1,5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glucose; pH 7,4.
    1. Remmers Naar de pipet oplossing om de activiteit van endogene kanalen, die niet relevant voor de studie (aanbevolen zijn blok zijn: 100 uM nifluminezuur of DIDS (Ca 2 + -geactiveerde Cl blok - kanalen), 10 mM TEA (het inhiberen grote-conductance Ca 2 + - afhankelijke K + kanaal), 10 nM iberiotoxin (de Ca 2+ -geactiveerde K + kanalen te blokkeren), 10 uM nicardipine (voor N-type Ca blokkeren2+ kanalen)) direct voor de patch-clamp experiment.
  3. Meng de glomeruli bevattende oplossing en vervolgens ongeveer 50 ui te passen op de poly-ʟ-lysine beklede dekglaasjes chips. Laat de glomeruli worden toegevoegd van ongeveer 5 min.
  4. Beweeg de glazen chips met glomeruli om de patch-clamp kamer pre-gevuld met het bad oplossing; perfuseren de kamer met een snelheid van 3 ml / min gedurende 1 minuut om het verwijderen van de losse glomeruli waarborgen.
  5. Voer een conventionele patch-clamp experiment in een cel-bevestigd-modus 7. Met een glazen pipet (7-10 MQ pipette resistentie) een hoge weerstand afdichting tussen een pipet en een podocyte membraan door toepassing van zachte zuigkracht (een pipet bevestigd aan een podocyte op het oppervlak van de geïsoleerde glomerulus wordt getoond in figuur 2, op links).
  6. Voor de cel bevestigd metingen, low-pass de stroming bij 300 Hz met een acht-polige Bessel-filter.
  7. Use geïsoleerd glomeruli in patch-clamp experimenten voor maximaal 4 - 6 uur. Houd de voorraad glomeruli fractie op ijs.

4. Ratiometrische confocale Fluorescentie metingen van de intracellulaire calciumconcentratie in de podocytes

  1. Plaats 500 pi van de glomeruli fractie (beschreven in 2.5) in 0,5 ml conische buis en voeg calcium kleurstoffen Fura Rood, AM en Fluo-4, AM. Gebruik 2 mM en 1 mM voorraad concentratie van Fura rood, AM en Fluo-4, AM, respectievelijk (opslag bij -20 ° C, opgelost in DMSO) en gebruik 2,5 pi van elke kleurstof een 500 pl glomeruli fractie. Onmiddellijk na toevoeging van de kleurstoffen omvatten de buis met aluminiumfolie.
  2. Plaats de buisjes op een roterende schudder gedurende ten minste 20 min tot 1 uur bij KT.
    Opmerking: Farmacologische middelen kunnen in deze stap worden toegevoegd.
  3. Bereid dekglaasjes, bedek ze met poly-ʟ-lysine en laat het drogen met behulp van verhitte plaat set tot 70 ° C.
  4. Zodra het laden van calcium kleurstoffen complete Breng 100 pi van de glomeruli bevattende oplossing van het poly-ʟ-lysine beklede dekglaasjes en laat ze zich aan de oppervlakte gedurende 5 min. Monteer de glomeruli bevestigd dekglaasjes in een imaging kamer en perfuseren met het bad-oplossing (bevattende (in mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, pH 7,35) met een snelheid van 3 ml / min te verwijderen de losse glomeruli en de resterende kleurstoffen.
  5. Stel de confocale laserscanning microscoop een 488 nm excitatie golflengte en emissiefilters (525/25 en 650/25 nm voor Fluo-4 en Fura rood, respectievelijk). Stel de imaging software op een gewenste frequentie en resolutie.
  6. Vind de glomeruli in helderveld en zet vervolgens de detectie van de fluorescentie-signaal. De intensiteit van de laser voor elke kleurstof verzadiging van het signaal te voorkomen. Kies het brandvlak met podocytes die direct op de ruit bevestigd. Dit minimaliseert het effect wordt veroorzaakt door samentrekking van een glomerulus in reactie op geneesmiddelentoepassing. Double-check dat de glomerulus van keuze goed is bevestigd aan het glas;
  7. Start beeldvorming van de focal plane keuze (neem 512 x 512 beelden met de op 4 sec frequentie snel Ca 2+ voorbijgaande veranderingen te visualiseren. Gebruik een 60X / NA 1.4 of soortgelijke objectief hoge resolutie afbeelding voor), drugs van belang toe te passen, en noteer de respons.
    1. Selecteer de gewenste focal plane (zo dicht mogelijk bij het oppervlak van het glas mogelijk te beeldvorming van podocytes garanderen op het oppervlak van de glomerulus). Controleer de intensiteit van de fluorescentie van de Fluo4 en FuraRed kanalen, en zorg ervoor dat de glomerulus duidelijk is te zien in helderveld.
    2. Start imaging. Voor het aanbrengen van enige drugs, opnemen ten minste 1 min van de baseline fluorescentie om ervoor te zorgen dat het signaal stabiel is (er zijn geen plotselinge pieken of vervagen van het signaal).
    3. Breng de gewenste geneesmiddelen met behulp van een micropipet; wees voorzichtig en zorgen voor de drug was in staat om goed te verspreiden en bereiken de glomerUlus. Meng het bad oplossing voorzichtig indien nodig, het toezicht op de geselecteerde focal plane en controleren dat het niet uit te gaan van de focus als gevolg van de drug toepassing.
    4. Noteer de veranderingen in fluorescentie-intensiteit voor Fluo4 en FuraRed signalen. Zorg ervoor dat de opname is lang genoeg, door te wachten tot het signaal het plateau niveau bereikt of een piek bereikt en keert vervolgens terug naar de uitgangswaarde. Voer oplossing wijziging of aanvulling van enige andere medicijnen als dat nodig is.
    5. Stop de opname en sla het bestand in het eigen formaat van de software.

5. Image Analysis voor het Calcium Metingen

  1. Voer beeldanalyse met de ImageJ geopende software uitgerust met de ND Utility plugin die het mogelijk maakt het importeren van afbeeldingen in de moedertaal ND2 formaat.
  2. Importeer de beeldsequentie; Zorg ervoor om de kanalen te splitsen en gebruik een HyperStack grijstinten-modus.
  3. Volg de Analyze → Extra → ROI manager pad in de ImageJ software om open een ROI manager venster. Selecteer verschillende regio's van belang (podocytes) met behulp van een ovale selectie-instrument en de "toevoegen (t)" functie in de ROI Manager. Zoals de laatste ROI, selecteer het gebied op de achtergrond; sla de geselecteerde ROI (Meer → Opslaan).
  4. Markeer het venster met de gekozen voor analyses kanaal. Gebruik de Meer → Multi Measure functie in de ROI Manager, markeer de "één rij per slice" box aan de dialoog die naar buiten komt, en klik op OK. De resultaten zullen in het formaat dat kan worden ingesteld in het venster Resultaten worden getoond: het aangaan van de menuoptie Resultaten → Set Metingen, selecteer "Mean grijswaarde" en bereken de pixel intensiteit waarden voor elk ROI, die zal worden weergegeven in de Resultaten venster in aparte kolommen voor elke ROI.
  5. Kopieer het ROI gemeten intensiteitswaarden voor elk kanaal (Fluo-4 en Fura rood) in voorkeur software voor gegevensanalyse; subtract achtergrond intensiteitswaarden van elk DATeen punt.
  6. Voor elk tijdstip berekent de verhouding van intensiteiten van de Fluo-4 tot Fura Red kanalen. Plot scatter / line point-time wijzigingen van Ca 2+ transient voor elke ROI. Bereken Mean / SE waarden voor geselecteerde glomeruli.
    Opmerking: Time kolom moet worden ingesteld op basis van imaging frequentie geselecteerd op 4,5.

6. Intracellulaire calciumconcentratie Berekeningen met Fluo-4 fluorescentiesignaal

  1. Neem een ​​monster van de glomeruli en het uitvoeren van de experimentele protocol tot stap 4.7. Na registratie van de achtergrondfluorescentie voeg Ionomycin (eindconcentratie in het bad kamer moet 10 urn) aan de badoplossing en opnemen fluorescentie-intensiteit verhogen. Zodra de intensiteit bereikt zijn maximum en het verval begint, voeg MnCl 2 (eindconcentratie moet 5 mM) aan de fluorescentie 8 doven.
  2. Analyseer de verkregen data 6.1. Kopieer de Fluo-4 signaal ROI intensiteit waarden verkregen volgenshet op 5.1 beschreven protocol - 5.5 door voorkeursuitvoeringsvorm analysesoftware.
  3. Bereken intracellulaire calciumconcentratie (in nM) in podocyte overeenkomt met het ROI met een formule:
    figure-protocol-1
    waarin Kd een vooraf bepaalde dissociatieconstante voor Fluo-4 (345 nM), F is de intensiteit van het tijdstip dat u berekent de calcium concentratie (baseline) en F min en Fmax de intensiteitswaarden van het punt van de maximale belasting calcium (na ionomycine toepassing) en na doven van de fluorescentie (met MnCl 2) respectievelijk (zie figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier geadresseerd we het probleem van het meten van acute veranderingen in het calciumgehalte in het podocytes. Figuur 1 toont een schematische weergave van de experimentele protocol ontworpen om hoge resolutie levende fluorescentie confocale beeldvorming en één ionkanaalactiviteit opnamen verrichten de podocytes van de vers geïsoleerde knaagdieren glomeruli. Kort nadat de rat verdoofd, de nieren moet worden gespoeld met PBS om ze te verwijderen van bloed. Vervolgens worden de nieren uitgesneden en ontk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven benadering maakt voor de analyse van calciumhuishouding door podocytes van het knaagdier glomeruli. Deze techniek maakt het mogelijk de toepassing van de patch-clamp single channel elektrofysiologie en fluorescentie ratiometrische confocale beeldvorming. Echter, beide werkwijzen afzonderlijk worden gebruikt, als zodanig. De voorgestelde protocol heeft een aantal relatief eenvoudige stappen, waaronder 1) de nieren spoelen; 2) het isoleren van de glomeruli door differentiële zeven; 3) het uitvoeren van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag naar Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) en Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) bedanken voor de uitstekende technische hulp bij microscopie experimenten. Gregory Blass is erkend voor kritische revisie van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health subsidie ​​HL108880 en American Diabetes Association verlenen 1-15-BS-172 (AS), en de Ben J. Lipps Research Fellowship van de American Society of Nephrology (DVI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fluo4 AMLife TechnologiesF14217500 µl in DMSO
FuraRed AMLife TechnologiesF-3020
Poly-ʟ-lysineSigma-AldrichP4707
PluroniczuurSigma-AldrichF-68oplossing
IonomycineSigma-AldrichI3909-1ML
BuizenrotatorMiltenyi Biotec GmbH130-090-753Duitsland
Nikon confocale microscoop (omgekeerd)NikonNikon A1RLaser-excitatie 488 nm. Emissiefilters 500-550 nm en 570-620 nm
ObjectiefNikonPlan Apo 60x/NA 1.4 Oil
DekglasThermo Scientific6661B52
HoogvacuümvetDow CorningSiliconenverbinding
SoftwareNikonNikon NIS-Elements
Registratie-/perfusiekamerWarner InstrumentsRC-26
Patch-clamp versterkerMolecular DevicesMultiClamp 700B
GegevensacquisitiesysteemMolecular DevicesDigidata 1440AAxon Digidata® Systeem
LaagdoorlaatfilterWarner InstrumentsLPF-88-pool Bessel
Borosilicaatglas capillairesWorld Precision Instruments1B150F-4
Micropipet-pullerSutter Instrument CoP-97Flaming/Brown-type micropipet-puller
MicroforgeNarishigeMF-830Japan
Gemotoriseerde micromanipulatorSutter Instrument CoMP-225
Omgekeerde microscoopNikonEclipse Ti
Microvibratie-isolatietafelTMCuitgerust met Faraday-kooi
Multikanaalventiel-perfusiesysteemAutoMake ScientificValve Bank II
Registratie-/perfusiekamerWarner InstrumentsRC-26
SoftwareMolecular DevicespClamp 10.2
NicardipineSigma-AldrichN7510
IberiotoxineSigmaI5904-5UG
NifluminezuurSigma-AldrichN0630
DIDSSigma-AldrichD3514-25MG
TEA-chlorideTocrisT2265
RPMI 1640Life Technologies11835030zonder antibiotica
BSASigma-AldrichA832730% albumine-oplossing
Temperatuurgecontroleerde operatietafelMCW corevoor knaagdieren
Stalen zeven:#100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200Fisher Sci50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270Fisher Sci50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400Fisher Sci50-871-320
mesh 200Sigma-Aldrichs4145zeef voor CD-1
Binoculaire microscoopNikonEclipse TS100
Binoculaire microscoopNikonSMZ745
Op spuitenpompen gebaseerd perfusiesysteemHarvard Apparatus
Polyethyleen buisjesSigma-AldrichPE50
Isofluraan anesthesiefigure-materials-1 VetEquip, Inc.911103
Overige basisreagentiaSigma-Aldrich

Referenties

  1. Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
  2. Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
  3. Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
  4. Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
  5. Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
  6. Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
  7. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
  8. Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
  9. Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
  10. Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
  11. Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771(2009).
  12. Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
  13. Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
  14. Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
  15. Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
  16. Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
  17. Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
  18. Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
  19. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
  20. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
  21. Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
  22. Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
  23. Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Calcium imaging van podocytenisolatie van glomeruliconfocale microscopiepatchclamp elektrofysiologieladen met fluorescerende kleurstoffenmeting van calciumconcentratieionkanaalactiviteitrenale epitheelcellen

Gerelateerde artikelen