Een protocol om veranderingen in DNA-schadeniveaus en DNA-reparatievermogen te evalueren die kunnen worden geïnduceerd door chronische in vivo lage dosis bestraling in muis miltlymfocyten, door gemeten gefosforyleerd histon H2AX, een marker voor DNA-dubbelstrengsbreuken, met behulp van flowcytometrie wordt gepresenteerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het meten van DNA-schade en herstel in Mouse Splenocyten Na Chronische
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lage dosis straling blootstelling kan een verscheidenheid van biologische effecten die verschillen in hoeveelheid en kwaliteit van de door hoge stralingsdoses effecten veroorzaken. Het aanpakken van vraagstukken in verband met de veiligheid van het milieu, het werk en de volksgezondheid in een goede en wetenschappelijk verantwoorde manier sterk afhankelijk is van het vermogen om de biologische effecten van een lage dosis verontreinigende stoffen, zoals ioniserende straling en chemische stoffen nauwkeurig te meten. DNA-schade en herstel zijn de belangrijkste vroege indicatoren van de gezondheidsrisico's als gevolg van hun mogelijke gevolgen op lange termijn, zoals kanker. Hier beschrijven we een protocol om het effect van chronische in vivo blootstelling aan lage doseringen γ- en β-straling op DNA schade en herstel bij muizen miltcellen bestuderen. Met behulp van een algemeen bekend merker DNA double-strand breaks, gefosforyleerd histon H2AX genoemd γH2AX, laten we zien hoe het gebruikt kan worden om niet alleen de mate van DNA-schade te evalueren, maar ook veranderingenin de DNA-reparatie capaciteit potentieel geproduceerd door lage dosis in vivo blootstelling. Flowcytometrie maakt een snelle, nauwkeurige en betrouwbare meting van immunofluorescently gelabeld γH2AX in een groot aantal monsters. DNA double-strand break repair kan worden geëvalueerd door het blootstellen geëxtraheerd splenocyten een uitdagende dosering van 2 Gy tot voldoende produceren van DNA breuken te herstellen activeren en door het meten van de geïnduceerde (1 uur na bestraling) en resterend DNA schade (24 hrs post-bestraling). Residuele DNA schade indicatief onvolledige reparatie en het risico van langdurige genomische instabiliteit en kanker zijn. In combinatie met andere tests en eindpunten die gemakkelijk kan worden gemeten zoals in vivo studies (bijvoorbeeld chromosoomafwijkingen, micronuclei frequenties in beenmerg reticulocyten, genexpressie, enz.), Deze benadering maakt een nauwkeurige en contextuele evaluatie van de biologische effecten van laag niveau stressoren.
Inleiding
Aanzienlijke controverse over de mogelijke schadelijke effecten van een lage of zeer lage doses ioniserende straling en angst publiek van de straling, gedreven door beelden van de Hiroshima en Nagasaki atomaire bombardementen en van zeldzame kerncentrale ongelukken (verergerd door de massamedia), heeft geleid tot een zeer strikte regelgeving en normen die potentieel wetenschappelijk verantwoord zijn niet stralingsbescherming. In de laatste drie decennia praktijk blijken zowel het ontbreken van schadelijke en de aanwezigheid van potentieel gunstige biologische effecten geïnduceerd door een lage dosis straling 1-4 gedocumenteerd. De belangrijkste gezondheids....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muis handling en behandeling procedures moeten zich houden aan de regels uiteengezet door de wetgever en / of dierlijke zorgprogramma's en goedgekeurd door een plaatselijke dier zorg commissie. Alle methoden beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care met toestemming van de plaatselijke dier zorg commissie.
LET OP: Alle werkzaamheden met radioactiviteit (waaronder, maar niet beperkt tot het behandelen van tritium, externe γ-straling, het hanteren van radioactief dierlijke weefsels, beddengoed afval) moeten zich houden aan de regels uiteengezet door de wetgever en / of stralingsbescherming autorit....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 2 toont voorbeelden van flowcytometrie grafieken verwacht splenocyten bereid volgens de hieronder beschreven werkwijze. De cellen worden eerst gated gebaseerd op de scatterplot (figuur 2A en 2D, elektronische volume is gelijk aan voorwaartse verstrooiing). FL3 / propidiumjodide histogrammen (figuur 2B en 2E) bevestigen normale celcyclus distributie. Gemiddelde γH2AX signaal berekend volge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De in dit document protocol is nuttig voor het uitvoeren van grootschalige muizen in vivo studies die de genotoxische effecten van lage niveaus van verschillende chemische en fysische agentia, zoals ioniserende straling. Onze unieke specifieke pathogeenvrije dier faciliteit uitgerust met een GammaBeam 150 bestraler en een 30 meter lange bestraling hal laat uitvoeren levenslange studies met lage of zeer lage dosering bestralingen op honderden of zelfs duizenden muizen. Kleinere doorstralingsinstallaties voor chr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen bekende concurrerende financiële belangen zijn.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de bijdrage van onze collega's Sandrine Roch-Lefevre en Eric Gregoire van het Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Parijs, Frankrijk) graag erkennen. Dit werk werd ondersteund door het wetenschaps- en technologieprogramma van de regering van Canada bij Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Canada), de CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Canada), de Canadian Nuclear Safety Commission en door het Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Parijs, Frankrijk).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| HTO: getritieerd water, [3H] | lokaal verkregen uit een kernreactor | voorraadactiviteit 3,7 GBq/mL; kan worden vervangen door HTO van Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organisch gebonden tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organisch gebonden tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organisch gebonden tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| getritieerd water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | vervanging voor HTO van lokale oorsprong |
| GammaBeam 150 bestralingsapparatuur | Atomic Energy of Canada Limited | lokaal vervaardigd | kan worden vervangen door een andere bron van gammastraling met voldoende lage activiteit |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 met L-Glutamine en HEPES 500mL |
| foetaal bovien serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antilichaam, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 geit anti-muis antilichaam | Life Technologies (voorheen Invitrogen) | A21121 | |
| propidium jodium | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml flessen Absolute Ethanol |
| 1,5 ml buisjes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifugebuisjes |
| 15 ml buisjes | Fisher Scientific | 05-539-5 | steriele polypropyleen centrifugebuizen |
| vloeibare stikstof | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm ongekapte glazen buisjes | Fisher Scientific | K60B1496126 | wegwerpbare borosilicaatglazen buisjes met vlak uiteinde |
| T25 kolven | VWR | CA15708-120 | nunc weefselkweekkolf 25ml (leveranciersnr. 156340) |
| schaar | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner schaar 12 cm scherp/scherp |
| tang, recht | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken tang 13 cm, recht |
| tang, gebogen | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern tang 12 cm, gebogen |
| 60 mm petrischalen | VWR | CA25382-100 | BD Falcon weefselkweekschaal 60 x 15 mm |
| celzeevers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon celzeevers 50/doos |
| PBS recept: 1 tablet opgelost in 200 ml gedeïoniseerd water, pH aanpassen naar 7,4 indien nodig. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Fosfaat Buffered Saline Tabletten |
| TBS recept: om 10x voorraad te maken | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Natriumchloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Kaliumchloride |
| Oplossen in 1 L gedeïoniseerd water, pH aanpassen naar 7,4 |
Referenties
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
