Methodenartikel

Visualisatie van Chondrocyte Intercalatie en Directional Proliferatie via Zebrabow Klonale Cell Analysis in het Embryonale Meckel's Kraakbeen

DOI:

10.3791/52935

⸱

21 oktober 2015

 ,  ,  , 
1Massachusetts General Hospital, Center for Regenerative Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel organisatie van craniofaciale botten is al lang de hypothese, maar niet direct zichtbaar. Multispectrale cell labeling en in vivo levende beeldvorming maakt visualisatie van de dynamische cel gedrag in de zebravis onderkaak. Hier hebben we detail het protocol te manipuleren Zebrabow transgene vis en direct waar te nemen cel intercalatie en morfologische veranderingen van chondrocyten in de Meckel's kraakbeen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ontwikkeling van de gewervelde craniofaciale structuren vereist een nauwkeurige afstemming van de cel migratie, proliferatie, adhesie en differentiatie. Patroonvorming van de Meckel's kraakbeen, een eerste faryngeale boog derivaat, omvat de migratie van craniale neurale (CNC), cellen en de progressieve partitionering, proliferatie en de organisatie van gedifferentieerde chondrocyten. Verschillende studies hebben CNC migratie beschreven in onderkaak morfogenese, maar de details van hoe de chondrocyten organisatie bereiken in de groei en uitbreiding van Meckel kraakbeen blijft onduidelijk. De sox10 beperkte en chemisch geïnduceerde Cre-recombinase gemedieerde recombinatie genereert permutaties van verschillende fluorescerende eiwitten (RFP, YFP en CFP), waardoor een multi-spectrale kenmerken van stamcellen en hun nageslacht, als gevolg van verschillende klonale populaties. Via confocale time-lapse fotografie is het mogelijk om de chondrocyten observeren behaviof tijdens de ontwikkeling van de zebravis Meckel kraakbeen.

Multispectrale cel etikettering kunnen wetenschappers uitbreiding van de Meckel's chondrocyten tonen. Tijdens de uitbreiding fase van het Meckel's kraakbeen, waarbij de onderkaak voorafschaduwing, chondrocyten intercaleren verlenging effect als ze stapelen in een georganiseerde eencellige gelaagde rij. Mislukking van deze georganiseerde intercalerend proces cel uitbreiding bemiddelen biedt de cellulaire mechanistische verklaring voor hypoplastic onderkaak die we waarnemen in de onderkaak misvormingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Craniofaciale ontwikkeling vereist complexe moleculaire, cellulaire en weefsel interacties naar cel proliferatie, migratie en differentiatie 1,2, 3 rijden. Dit strak gereguleerd en complex proces is onderworpen aan genetische en omgevingsfactoren storingen, zodat craniofaciale misvormingen behoren tot de meest voorkomende geboorte misvormingen 1-9. Terwijl chirurgische ingrepen blijft de steunpilaar van de behandeling van craniofaciale afwijkingen, het begrijpen van de ontwikkeling basis is essentieel voor toekomstige therapieën te innoveren. Daarom is het bestuderen van de morfogenese en de mechanismen van de convergentie en extensie en cellen integratie verschaft nieuwe inzichten in de vorming van het craniofaciale skelet 1.

Craniale neurale lijst migreren en bevolken de eerste faryngeale boog, vormen dan gepaarde onderkaak processen die zich uitstrekken tot de Meckel's kraakbeen, waarbij de onderkaak voorafschaduwing vormen. Morfogenese of de Meckel's kraakbeen vereist chondrocyten organisatie via gerichte proliferatie, cel polarisatie en differentiatie 1,10. De ingewikkeldheid van chondrocyte organisatie in de groei en uitbreiding van Meckel kraakbeen blijft onduidelijk. Inzicht in de dynamische cel gedrag is van cruciaal belang voor het begrijpen van aangeboren afwijkingen van invloed zijn onderkaak grootte, zoals hypoplastic onderkaak fenotypes 11.

Zebravis embryo's bieden vele ontwikkelings-en genetische voordelen voor de gedetailleerde studie van Meckel's kraakbeen morfogenese. Hun genetische traceerbaarheid, transparantie, ex vivo en snelle ontwikkeling zijn krachtige voordelen goed uitlenen voor observatie van de cel beweging en organisatie door het live-imaging 6. Met behulp van lineage tracing hulpmiddelen, zoals sox10: kaede transgene lijn, hebben wij en anderen de neurale oorsprong van de embryonale craniofaciale skelet 1,5 afgebakend. Using de sox10: ERT2-Cre met de Ubi: Zebrabow-M transgene lijn, is het nu mogelijk om de details van cellulaire bewegingen verkennen tijdens craniofaciale ontwikkeling. De Zebrabow-M, is een transgene lijn ontworpen met de ubiquitine promotor die de expressie van verschillende fluoroforen, elk geflankeerd door Lox plaatsen 8. De Zebrabow-M standaard fluorofoor is Rood, uiten RFP. Na inductie van Cre expressie, de Zebrabow-M te construeren recombineert en cellen brengen een combinatie van verschillende fluoroforen (RFP, GVB en YFP) het creëren van multi-spectrale expressie in het embryo. Alle dochtercellen die scheiden van de gemerkte cellen na de recombinatie gebeurtenis worden daarna klonaal gemerkt, zodat celpopulaties die voortkomen uit verschillende naast elkaar geplaatste progenitors klonaal gelabeld. Door deze klonen cel labeling, kunnen cellen proliferatie en migratie klonale resolutie volgen (figuur 1 en 2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd alle procedures in het kader van het protocol nummer # 2010N000106. Dit is in overeenstemming met de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC) richtlijnen.

1. reagentia en materialen Voorbereiding

  1. Bereid 1 liter 50X E3 embryo medium (zie tabel 1) en zet 1 l 1X E3 embryo medium (zie tabel 2).
  2. Bereid E3 embryo medium met N-fenylthioureum (PTU) door toevoeging van 30 mg PTU tot 1 l 1X E3. Roer O / N dat de PTU volledig is opgelost. Slaan bij RT.
  3. Aan pronase oplossing te bereiden, verdun 150 gl pronase (0,5 mg / ml) met 15 ml 1X E3. Deze hoeveelheid is voldoende voor 1 petrischaal. Onmiddellijk gebruiken.
  4. Bereid methylcelluloseoplossing.
    1. Bereid E3-tricaïne oplossing door het mengen van 75 ml van 0,2% tricaïne met 25 ml1X E3. Kook in 75 ml E3-tricaïne oplossing 3 gram methylcellulose.
    2. Deel uitmaken van de uiteindelijke volume tot 100 ml met E3-tricaïne oplossing. De uiteindelijke methylcellulose oplossing viskeus en ondoorschijnend gelige tint. Opslag: RT beschermd tegen het licht.
  5. Tamoxifen voorraad en inductie oplossing
    1. Bereid 5mM tamoxifen voorraad oplossing door het oplossen-4 hydroxytamoxifen in 100% ethanol. Winkel stock bij -80 ° C.
    2. Bereid verse verdunning van tamoxifen op de wens concentratie in 1X E3 tot de inductie oplossing te verkrijgen. LET OP! Gelieve veiligheidsinformatieblad raadplegen voor gebruik.
  6. Bereid 1 liter 0,2% tricaïne volgens Tabel 3.
  7. Verkrijgen confocale glijbanen. Lijm vier dekglaasje (18 x 18) samen om een ​​blok te vormen plaats dan 2 blokken op een 24 x 60 dekglaasje 2 cm uit elkaar om de montage van het embryo in het midden laten.

2. Embryo Voorbereiding

  1. Transgene lijnen.
    NB: Zebrabow-M was een gulle gift van Alex Schier het laboratorium.
  2. sox10: ERT2-Cre
    OPMERKING: Genereer de targeting vector pDestTol2- sox10: ERT2-Cre behulp van standaard moleculair klonen methoden en handel verkregen recombinatie klonen technologie.
    1. Combineer 5 'binnenkomst kloon (pENTR5'- sox10p) met 7.2Kb van de sox10 promotor, een Gateway midden kloon (pME-ERT2-Cre), en een 3 "binnenkomst kloon (pENTR3'-polyA) in een LR reactie met lens bestemming vector pDestTol2- α-crystalline: YFP.
    2. Zuiveren construct pDestTol2- sox10: ERT2-Cre. Co-injecteren van de gezuiverde construct (100 ng / ul) met Tol2 transposase mRNA (50 ng / ul) in WT embryo (F0) aan de fase van één cel.
    3. Screen F0 volwassen oprichters voor kiem-lijn transmissie gebaseerd op sterke gele fluorescentie in F1 embryo's.
  3. sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
    1. Outcross de Zebrabow-Mlijn (2.1.1) met de sox10: ERT2-Cre transgene lijn.
    2. Selecteer embryo's vertonen een sterke alomtegenwoordige RFP expressie en YFP lens marker en groeien ze tot volwassenen.

3. Embryo Collection

  1. Het opzetten van verschillende paren sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M transgene zebravis 05:00-6:00 op dag 1.
  2. De volgende dag, trekken de verdelers in de ochtend en het verzamelen van de eieren rond het middaguur.
  3. Overbrengen naar een petrischaal en voeg 15 ml pronase oplossing van het embryo dechorionate.
  4. Incubeer de embryo's 1 tot 5 min tot ongeveer 60% van de embryo's zijn dechorionated. Stop de reactie door decanteren van de pronase oplossing en was de embryo's 3-4 keer met verse E3 medium.
  5. Incubeer de dechorionated embryo's in E3 bij RT O / N en laat ze ontwikkelen om de 10 somieten stadium te bereiken. Incubeer 50-60 embryo's per koppeling van verschillende ontwikkelingsstoornissen groei te voorkomen.

4. Behandeling

  1. Controleer ontwikkelingsstadium van de embryo's 'onder een lichte veld microscoop om ervoor te zorgen dat ze zijn in de 10 somieten podium.
  2. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een rood fluorescent eiwit (RFP) filter, isoleer het heldere rode embryo.
  3. Ga verder met de inductie van de Cre-recombinatie door toevoeging van 10 uM hydroxytamoxifen oplossing van het petrischaaltje incuberen van geïsoleerde embryo's bij 28,5 ° C gedurende 3 uur.
  4. Giet het tamoxifen-oplossing en was de embryo's een paar keer met de E3.
    LET OP! tamoxifen de oplossing in een speciaal biologisch afval container weggooien.
  5. Incubeer de embryo's bij 28,5 ° CO / N.
  6. Wanneer de embryo's zijn ongeveer 28-29 somieten fase (ongeveer 24 uur na de bevruchting), incubeer de embryo's bij 28,5 ° C in de E3-PTE oplossing hiernamaals.
    OPMERKING: PTU hier gebruikt om de vorming van melanoforen remmen in de ontwikkeling van embryo. Deze behandeling is nodig omvoorkomen dat de vervorming van het signaal van de fluorescentie door auto-TL melanoforen.
  7. Incubeer de embryo's bij 28,5 ° C

5. Embryo Selection

  1. Om de volle craniofaciale structuren te visualiseren, selecteert de embryo's in 4 dagen na de bevruchting van de intensiteit van het rode signaal en Cre expressie merker positiviteit (geel in de retina).
  2. Verdoven de embryo's met E3 / 0,015% tricaïne oplossing. Verdoving wordt bevestigd wanneer geen actieve bewegingen of vin de activiteit wordt waargenomen wanneer zachtjes porren het embryo.

6. Montage van de Embryo in Methycellulose

  1. Overdracht van de geselecteerde embryo voor beeldvorming in een petrischaaltje met een druppel methylcellulose en voorzichtig balsemen het embryo met methylcellulose.
  2. Op een schone confocale dia, plaats een druppel verse methylcellulose en monteer je embryo in de drop met een microloader tip. Positie embryo dorsaal nemen voorzichtigheid niet aan te rakenhet embryo rechtstreeks.
  3. Bedek de gemonteerde embryo met een 25 x 25 dekglaasje en de positie van de embryo stel indien nodig door het manipuleren van het dekglaasje.
  4. Het embryo is nu klaar om de afbeelding.

7. Analyse van fluorescentie microscopie

  1. Gebruik de 20x droge objectief (numerieke lensopening 0,75; pinhole grootte 2,0 micrometer) voor het richten van de embryo.
  2. Druk op de knop L100 op de microscoop en selecteer de kanalen in de software.
  3. Selecteer de confocale setup-knop en klik op 'auto' en selecteer de volgende kanalen voor het sluiten van het venster: Ch1: GVB, Ch2: GFP, Ch3: RFP of mCherry
  4. Zet Ch2 en Ch3 voordat u op de knop 'verwijder interlock'. Klik op 'play' om te beginnen met scannen.
  5. Focus op de structuur van de rente, die het best wordt gedaan door te beginnen met ½ frame / sec en hoogspanning (HV) 150 en dan dienovereenkomstig aanpassen van de instellingen tot de gewenste beeldkwaliteit is achieved. De RFP zou helderder dan andere kleuren zijn, dus de HV te passen. Verander de Z-positie om zowel YFP en RFP positieve cellen te vinden.
  6. Eenmaal ingesteld met de instellingen, vangen het imago van uw embryo. Sla uw afbeelding in de confocale imaging software formaat en TIFF-formaat voor het verwerken in elk split kanaal.
  7. Next, voor GVB beeldvorming, zet Ch2 en Ch3 en zet Ch1. De instellingen als in stap 5 opnieuw aan te passen zonder dat het focusgebied te veranderen.
    OPMERKING: GVB kan echt moeilijk op te sporen zijn als gevolg van de achtergrond signaal in blauw kanaal dat kan worden omzeild door het aanpassen van de pinhole grootte. Een grotere pinhole formaat maakt betere detectie van de fluorescentie door het verminderen van de signaal / ruis-verhouding. Toch zal een grotere pinhole confocale effect te verminderen, afbreuk te doen aan de beeldkwaliteit. Daarom is een zorgvuldige aanpassing van de instellingen waarbij de gewenste beeldkwaliteit en intensiteit te verkrijgen.
  8. Leg het beeld en opslaan in de beide formaat (confocale software en TIFF) voor beeldverwerking. Beelden kunnen vervolgens worden verwerkt met behulp van gemeenschappelijke beeldverwerking software om lagen samen te voegen en te verbeteren kleurinstellingen zoals beschreven door Pan en 8 collega's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditionele kraakbeen visualisatie door hele berg Alcian blauwe vlekken is van onschatbare waarde in het observeren van de ontwikkeling van Meckel's kraakbeen en vaak gebruikt voor de uiteindelijke cellulaire organisatie 12 (figuur 1A) visualiseren geweest. Om verder te analyseren de ontwikkeling van chondrocyten overwerk, lineage tracing met sox10: Kaede transgene lijnen heeft ons in staat om celmigratie, convergentie en extensie studie in levende embryo 2,12

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alcian blauw en photoconvertible transgene lijnen zoals boven beschreven aanvulling elkaar om het complexe proces van kraakbeen- en botvorming te definiëren. Echter, live cellulaire migratie en organisatie tijdens de organogenese is al lang de hypothese en indirect aangetoond, maar nooit gevisualiseerd. Zebrabow-M transgene lijn in combinatie met een kraakbeen specifieke Cre kan tegelijkertijd live-observatie van al deze verschillende gebeurtenissen die betrokken zijn bij de vorming van bot en kraakbeen. Deze techniek m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Alex Schier voor vriendelijk delen van de Zebrabow-M transgene lijn, Geoffrey Burns voor de pDEST vector en Renee Ethier-Daigle voor een uitstekende verzorging van de vis faciliteit en lijnen.

FINANCIERING:

We zijn dankbaar voor de genereuze financiering steun van NIDCR RO3DE024490 en Shriners Hospitals for Children (ECL) en post-doctorale opleiding beurzen van Shriners Hospitals for Children (LR en YK).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PronaseRoche Life Sciences10165921001Bereid 500 μl stock-aliquots voor op 50 mg/ml
MethylcelluloseSigma-AldrichM0262
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7619
TricaineSigma-AldrichE10521
4-HydoxyTamoxifenSigma-AldrichT176
24 x 60 coverslipsFisher Scientific12-548-5P
18 x 18 coverslipsFisher Scientific12-540A
25 x 25 coverslipsFisher Scientific12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning KitLife technologies K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Life TechnologiesK2400-20
pENTR3'-pATol2Kit302
pDESTGift van Geoffrey Burns labs
Bright field microscope 
Fluorescent microscope 
Confocal microscope
Image processing software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
  2. Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
  3. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  4. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
  5. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525(2013).
  6. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
  7. Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
  8. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  9. Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
  10. Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726(2014).
  11. Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
  12. Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
  13. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zebrabow Clonal AnalysisConfocal Time LapseSOX10 ERT2 CreTamoxifen InductionCranial Neural CrestMultispectral LabelingZebrafish Embryos

Gerelateerde artikelen