Een vereenvoudigd systeem voor het evalueren van de Cel Mechanosensing en Durotaxis In Vitro

Samenvatting

Veel zoogdiercellen migreren bij voorkeur naar een stijvere matrix of substraat via durotaxie. Het doel van dit protocol is om een eenvoudig in vitro systeem te bieden dat kan worden gebruikt om cel durotaxie gedragingen te bestuderen en te manipuleren door het opnemen van polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten van gedefinieerde stijfheid, in combinatie met glazen dekglasjes.

Samenvatting

De samenstelling en de mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix sterk uiteen weefseltypen. Dit bindweefsel stroma diversiteit grote invloed cel gedrag normaal en pathologische processen, waaronder proliferatie, differentiatie, hechting signalering en directionele migratie te reguleren. In dit verband, het aangeboren vermogen van bepaalde celtypen migreren naar een stijver of minder compatibele matrix substraat wordt genoemd durotaxis. Dit fenomeen speelt een belangrijke rol tijdens de embryonale ontwikkeling, wondgenezing en kankercel invasie. We beschrijven hier een eenvoudige test om durotaxis studie, in vitro, met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten. Bereiding van de beschreven durotaxis kamers creëert een stijfheid interface tussen de relatief zachte gel PDMS en een stijf glazen dekglaasje. In het voorbeeld hebben we deze durotaxis kamers gebruikt om een ​​rol voor de Cdc42 tonen / Rac1 GTPase activerende protein, cdGAP in mechanosensing en durotaxis regelgeving in menselijke U2OS osteosarcoomcellen. Deze test is gemakkelijk aan te passen aan andere typen cellen en / of knock-down van andere eiwitten van de belangen van hun respectieve rollen verkennen in mechanosignaling en durotaxis.

Inleiding

De extracellulaire matrix (ECM) bestaat uit een complexe reeks van structurele en verknopen van proteïnen zoals collageen, fibronectine en laminine. Hoewel het goed is vastgesteld dat de ECM levert belangrijke structurele steun voor cellulaire weefsels, is er steeds meer bewijs om aan te geven dat cellen actief inspelen op de fysieke veranderingen in hun ECM-omgeving om diverse cellulaire processen zoals overleving van de cel, differentiatie en celmigratie reguleren. Zo kunnen verschillen in stijfheid van de ECM mesenchymale stamcellen rijdt richting verschillende geslachten, met zachte substraten (~ 1 kPa) bevordering neurogene lineages terwijl stijve (~ 25 kPa) substraten te bevorderen osteogene differentiatie ^1. Ook is een toename van de stromale matrix stijfheid aangetoond mammaire epitheelcellen tumorigenese en invasie in het omringende weefsel ^2,3 promoten.

Een bijzonder interessant aspect van deze mechanosignaling activiteit leidt tot een proces dat durotaxis, waarbij cellen preferentieel migreren naar een stijver substraat ^4,5. Cellen constant zin de fysische eigenschappen van de extracellulaire omgeving via integrine receptor binding aan de ECM. Dit bevordert op zijn beurt de ophoping van talrijke structurele en signaaleiwitten hun cytoplasmatische domeinen van de vorming van lijm structuren bekend als focale adhesies of focale contacten ^6,7 drijven. Omdat integrinen zijn geen inherente enzymatische activiteit worden signalen doorgegeven vanuit het ECM door deze additionele eiwitten de reactie van de cel om hun veranderende omgeving ⁸ coördineren. Dienovereenkomstig is de identificatie en karakterisering van de belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij het reguleren mechanosignaling en durotaxis is een belangrijk onderzoeksgebied.

Verschillende modelsystemen ontwikkeld studeren durotaxis in vitro, maar de meeste hebbengebruikt met collageen beklede substraten polyacrylamide ^4. Echter, de bereiding van de polyacrylamide substraten technische uitdaging en collageen die in deze testen moeten chemisch verknoopt aan het substraat ⁹ zijn. Polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten bleken vergelijkbare mechanische eigenschappen vertonen om de substraten ¹⁰ polyacrylamide. Echter PDMS substraten bereid door eenvoudig mengen van een verhouding van de base om verknopingsmiddel en deze substraten kunnen worden bekleed met ECM eiwitten zonder chemische verknoping, waardoor PDMS makkelijker instrument om de effecten van starheid celgedrag bestuderen. Hierin beschrijven we hoe een eenvoudige durotaxis kamer waarin een zachte PDMS substraat is geïntegreerd met een stijve glazen dekglaasje bereiden.

De test, zoals hieronder wordt uiteengezet, verschaft een snelle en eenvoudige methode om durotaxis bestuderen. Voor deze studie gebruikten we de menselijke U2OS osteosarcoomcellen gecombineerd met siRNA-gemedieerdeknockdown van cdGAP om de rol van deze focale adhesie eiwit bestuderen durotaxis ^11. Belangrijk is, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast aan de individuele behoeften. Andere celtypen kunnen worden gesubstitueerd voor de U2OS cellen en elk eiwit kan worden neergeslagen of overexpressie gebracht om de effecten op celgedrag tijdens durotaxis bepalen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan fluorescent gemerkte eiwitten te nemen om hun dynamiek en gedrag met behulp van FRAP of FRET benaderingen te analyseren.

Protocol

1. Voorbereiding van Durotaxis Chambers

1. Een 6-well weefselkweek plaat voor te bereiden, tarra de balans met een 50 ml conische buis. Weeg ongeveer 10 g PDMS basisoplossing in de 50 ml buis (de oplossing vrij viskeus).
2. Voor een 90: 1 substraat (Overeenstemming van ~ 1 kPa), verdeel het gemeten gewicht van de PDMS basisoplossing in de buis 90 door de juiste hoeveelheid verknopingsmiddel oplossing nodig te bepalen. Voeg de berekende hoeveelheid PDMS crosslinker oplossing dezelfde buis.
   Voorbeeld: 10 g / 90 = 0,11 g. Voeg 0,11 g PDMS crosslinker oplossing van het PDMS basisoplossing.
   Opmerking: De basis en crosslinker oplossingen zijn beide voorzien in het PDMS kit.
3. Krachtig mengen de PDMS base / crosslinker mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met een kleine spatel. In dit stadium zal het mengsel een groot aantal luchtbellen bevatten.
4. Centrifugeer de PDMS substraat in een benchtop centrifuge gedurende 5 minuten bij 50 xg bij kamertemperatuur om het verwijderen bubBles. Als er nog steeds belletjes na 5 min, centrifuge opnieuw.
5. Pipetteer 1 ml van 90: 1 PDMS substraat in elk putje van weefselkweek behandelde 6-wells plaat. Eventuele resterende luchtbellen aanwezig in het PDMS kan in dit stadium worden geëlimineerd door popping ze met behulp van een 21 G naald. Laat de PDMS spreiden gedurende 30 min in de put.
6. Kook 12 mm glazen dekglaasjes # 1 in gedestilleerd water gedurende 5 min. Herhaal tweemaal en bewaar de dekglaasjes in gedistilleerd water.
7. Plaats een gedroogd dekglaasje in elk putje van de weefselkweekplaat door voorzichtig aanraken van één kant van het dekglaasje in het PDMS oplossing dan vallen het dekglaasje op het PDMS. Aangezien het dekglaasje afwikkelt, zal de PDMS beginnen te tasten over de randen van het dekglaasje, maar niet volledig bedekken. Dit zal een interface tussen de PDMS en glazen na uitharding te genereren (zie Figuur 1A, B).
8. Incubeer de plaat bij 70 ° C in een oven gedurende 16 uur om uit te harden (harden) het PDMS. Leg het plate in een celkweek kap en UV steriliseren 10 min.
   NB: Het beste is om de platen te maken binnen een paar dagen van gebruik. Echter de platen in Parafilm gewikkeld zonder buffer en opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken zonder merkbare vermindering van de kwaliteit.

2. Cell Plating

Opmerking: Als het bestuderen van het effect van siRNA-gemedieerde knockdown Voer de knockdown volgens de instructies van de fabrikant of geoptimaliseerd protocol voor het celtype gekozen.

1. Coat elk durotaxis kamer met 1 ml van 10 ug / ml fibronectine in PBS zonder calcium en magnesium gedurende 1 uur bij 37 ° C. Alternatief kan de fibronectine worden toegepast op de dag voorafgaand aan analyse door het incuberen van de PDMS met 10 ug / ml fibronectine in PBS gedurende 16 uur bij 4 ° C. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak is ondergedompeld in de fibronectine in PBS oplossing.
2. Bereid hitte-gedenatureerd 1% BSA. Weeg 0,5 g BSA en oplossen in 50 ml PBS.Filter steriliseren van de oplossing door een 0,22 urn filter en verwarm bij 80 ° C gedurende 12 min.
   Opmerking: Bereid deze oplossing de dag voorafgaand aan plateren en opslag cel bij 4 ° C.
3. Zuig het fibronectine oplossing en was 3 maal met PBS. Voeg 1 ml van hitte gedenatureerd BSA in PBS aan elk putje en incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
4. Trypsinize en te tellen cellen van keuze, terwijl de durotaxis kamers blokkeren met de hitte gedenatureerd BSA.
5. Plaat 1 x 10 ⁵ cellen in een volume van 2 ml in elk putje van de durotaxis kamer via de media die voor het specifieke celtype naar keuze. Laat de cellen te hechten en verspreiden op het substraat 4 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% _CO2.
   OPMERKING: U2OS cellen worden routinematig aangehouden in DMEM met 10% FBS, aangevuld met 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, en 10 IU / ml penicilline, 10 ug / ml streptomycine.
   Opmerking: Het aantal cellen in dit voorbeeld is geoptimaliseerd voorU2OS cellen. Optimalisatie voor andere celtypen vereist zijn. Deze dichtheid geeft de cellen voldoende ruimte te migreren zonder significante interacties met andere cellen.

3. live-cell imaging

1. Live cell imaging op een omgekeerde microscoop, met behulp van fase contrast met een 10x doelstelling. De microscoop moet worden voorzien van een afgesloten milieu, bevochtigde kamer, waardoor temperatuurregeling bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende langdurige imaging.
2. Nadat de cellen hebben verspreid voor ongeveer 3,5 uur, de montage van de plaat in de microscoop kamer. Laat het monster (s) equilibreren in de kamer gedurende 30 min.
3. Het opzetten van geautomatiseerde, multi-point een bezoek op de microscoop, indien beschikbaar. Richten zich op het raakvlak tussen de 90: 1 PDMS en het glas dekglaasje en kies punten om de afbeelding rondom de interface met een gemiddelde van 40 punten per durotaxis kamer. Afbeelding de cellen elke 10 minuten gedurende maximaal 16 uur.
   OPMERKING: Het opnieuwgion plaats verschijnt als twee lijnen met de buitenste lijn overeenkomt met de rand van het dekglaasje en de binnenleiding voor het werkelijke interface tussen de PDMS en het dekglaasje. Zie figuur 1B.

4. Data Analysis

1. Genereer een spreadsheet zoals in tabel 1.
2. Tel het aantal events oversteek van de PDMS het glasoppervlak en vice versa van elke film gegenereerd. Noteer het aantal kruising gebeurtenissen in de juiste kolom in het Excel-spreadsheet.
   Opmerking: Een kruising event wordt gedefinieerd als de celkern die over de grens tussen de PDMS en glas in beide richtingen.
3. Om meerdere kruisingen kwantificeren, tel het aantal keren dat de cel stak de interface. Dit aantal dient te worden geregistreerd in de kolom excel overeenkomt met het substraat waarop de cellen werd aan het einde van de film. Herhaal de analyse voor elke cel die de interface kruisen in tHij film. Uitsluiten cellen die migreren uit het gezichtsveld tijdens de beeldvorming.
   Opmerking: Het is van belang om, door cellen te tellen bij het begin van het experiment dat de cellen kunnen eveneens hechten aan de met fibronectine gecoate PDMS en glazen dekglaasje oppervlakken.
4. Bereken het percentage cellen dat gemigreerd van PDMS het glasoppervlak (dwz onderging durotaxis). Voeg het aantal oversteken gebeurtenissen van zacht naar hard en de meervoudige kruising gebeurtenissen die eindigde op harde en delen door het totaal aantal kruising evenementen.
5. Bereken het percentage meervoudige kruisingen door het aantal meervoudige kruisingen door het totaal aantal kruisingen.

Resultaten

Een schema van de durotaxis kamer wordt getoond in figuur 1A. Soft PDMS substraat (een 90: 1 mengsel van PDMS base oplossingen verknopingsmiddel) is verdeeld in een 6 putjes en een glazen dekglaasje geplaatst bovenop de PDMS, die vervolgens gedeeltelijk bedekt het bovenoppervlak van het dekglaasje waardoor een interface creëren tussen de twee substraten van verschillende compliance. De stijfheid van het zachte PDMS substraat ~ 1 kPa, vergelijkbaar met de typische naleving van hersenweefsel, terwijl de s...

Discussie

Hierin beschrijven we een eenvoudige test om durotaxis bestuderen migrerende cellen. Een grote kracht van deze test is het gemak van de voorbereiding van de durotaxis kamers met behulp van PDMS. De stijfheid van de substraten kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door de verhouding van PDMS base oplossing verknopingsmiddel voor de studie van diverse starheid in de test toe. Echter, een mogelijke beperking van het systeem is dat cellen alleen worden blootgesteld aan een enkele verandering in substraat stijfheid tegenst...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm	Fisher Scientific	12-545-82
6-well plate	Celltreat	229106
DMEM	Cellgro	15-017-CM
L-Glutamine	Cellgro	25-005-CI
Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
Fibronectin	BD Biosciences	610077
PBS	Invitrogen	21600-044
Falcon tubes	Celltreat	229456
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
U2OS cells	ATCC	HTB-96