Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Samenvatting

We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.

Samenvatting

Membraan receptor-ligand-interacties mediëren vele cellulaire functies. Bindingskinetiek en downstream signalering veroorzaakt door deze moleculaire interacties worden waarschijnlijk beïnvloed door de mechanische omgeving waarin binding en signalering plaatsvinden. Een recente studie toonde aan dat mechanische kracht antigen herkenning door kunnen regelen en activeren van de T-celreceptor (TCR). Dit werd mogelijk gemaakt door een nieuwe technologie die we ontwikkeld en genoemd fluorescentie biomembraan kracht sonde (fBFP), die single-molecule kracht spectroscopie gecombineerd met fluorescentiemicroscopie. Met behulp van een ultra-soft menselijke rode bloedcellen als gevoelige krachtsensor, een high-speed camera en real-time imaging volgtechnieken, de fBFP is ~ 1 pN (10 ^-12 N) ~ 3 nm tot ~ 0,5 msec kracht, ruimtelijke en temporele resolutie. Met de fBFP, kan men precies enkele receptor-ligand bindingskinetiek onder dwang regelgeving en tegelijkertijd het binding-geactiveerd intracellulaire cal metenCium signalering op een enkele levende cellen. Deze nieuwe technologie kan worden gebruikt om andere membraan receptor-ligand interactie en signalering bestuderen andere cellen onder mechanische regeling.

Inleiding

Cel-cel en cel-extracellulaire matrix (ECM) adhesie wordt gemedieerd door binding tussen celoppervlakreceptoren ECM proteïnen, en / of lipiden ^1. Binding cellen mogelijk maakt functionele structuur ¹ vormen, alsmede erkennen communiceren, en reageren op de omgeving ^1-3. Unlike oplosbare proteïnen (bijvoorbeeld cytokines en groeifactoren) die binden van een driedimensionaal (3D) vloeistoffase op het celoppervlak receptoren, celadhesie receptoren vormen banden met hun liganden over een smalle spleet junctie met twee tegenover elkaar gelegen oppervlakken die moleculaire beperken overbruggen diffusie in een dimensionale (2D) interface van ^4-7 twee. In tegenstelling tot 3D kinetiek die vaak worden gemeten met traditionele binding assays (bijvoorbeeld oppervlakte plasmon resonantie of SPR), 2D kinetiek te kwantificeren met gespecialiseerde technieken zoals atomaire kracht microscopie (AFM) ^10/08, stromingskamerinfusie ^11,12, micropipet ^13,14, optischepincet ¹⁵ en biomembraan kracht sonde (BFP) ^16-21.

Meer dan louter fysieke koppeling verschaffen voor mobiele samenhang adhesiemoleculen zijn een belangrijke component van de signalering machines voor de cel te communiceren met de omgeving. Er is toenemende belangstelling voor het begrip hoe ligand betrokkenheid van adhesiemoleculen initieert intracellulaire signalering en hoe de eerste signaal wordt getransduceerd in de cel geweest. Intuïtief, eigenschappen van receptor-ligand binding kan invloed hebben op de signalen induceert. Het is echter moeilijk om mechanistische relaties tussen de extracellulaire en intracellulaire interactie signaleringsgebeurtenissen ontleden met traditionele ensemble van biochemische assays vanwege de vele beperkingen, zoals een slechte tijdsresolutie en het totale gebrek aan ruimtelijke resolutie. Bestaande methoden die zowel biofysische (2D receptor-ligand bindingskinetiek) toestaan ​​en biochemische (signalering) opmerkingen over live-cellen omvatten substraten van instelbare stijfheid ^22, elastomeer pijler arrays ²³ en stroom kamer / microfluïdische apparaten opgenomen met fluorescentie vermogen ^24-26. Echter, uitlezingen van signalering en receptor-ligand binding hebben (meestal door verschillende mogelijkheden) afzonderlijk te verkrijgen, waardoor het moeilijk om temporele en ruimtelijke relaties van obligatiekenmerken met signalerende gebeurtenissen ontleden.

Conventionele BFP is een ultragevoelige kracht spectroscopie met hoge spatiotemporele resolutie ^17. Het maakt gebruik van een flexibele rode bloedcellen (RBC) als een kracht sensor, waardoor de meting van de single-molecule 2D-kinetiek, mechanische eigenschappen en conformationele veranderingen ^{14,16,19-21,27-29.} Een fluorescerende beeldvorming gebaseerd BFP (fBFP) correleert de receptor-ligand binding kinetiek met de bindende geactiveerd cell signaling in single-molecule schaal. Met deze opstelling, in situ cell signaling-activiteiten in het kader van het oppervlak mechanical stimulering werd waargenomen in T-cellen ^27. De fBFP is veelzijdig en kan worden gebruikt voor onderzoek naar celadhesie en signalering gemedieerd door andere moleculen in andere cellen.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van en is door het menselijk onderzoek ethische commissie van het Georgia Institute of Technology zijn goedgekeurd.

1. Human RBC Isolatie, Biotinylatie en Osmolariteit Aanpassing

Opmerking: Stap 1.1 moet worden uitgevoerd door een opgeleide medische professional zoals een verpleegkundige, met een Institutional Review Board goedgekeurd protocol.

1. Verkrijgen 8-10 gl (één druppel) van bloed van vingerprik en aan 1 ml van het carbonaat / bicarbonaatbuffer (Tabel 1 en 2). Voorzichtig vortex of pipet het mengsel en centrifugeer gedurende 1 min bij 900 x g. Gooi supernatant en was eens te meer.
2. In een klein bekerglas te wegen 3.5-4 mg biotine-PEG3500-NHS linker (tabel 1). Oplossen in carbonaat / bicarbonaatbuffer de eindconcentratie 3 mg / ml te maken.
3. Meng 171 ul carbonaat / bicarbonaatbuffer, 10 pl RBC pakket en 1049 glBiotine-PEG3500-NHS linker-oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Was de RBC eenmaal met carbonaat / bicarbonaatbuffer en vervolgens tweemaal met N2-5% buffer (Tabel 1 en 2).
4. Doe ondertussen de linker fles met dop losgekomen in een glazen vacuüm exsiccator gevuld met droogmiddelen in de bodem en vacuüm gedurende 5 min, en vervult de exsiccator met argon. Draai de dop en neem de fles uit. Dicht de fles met plastic folie paraffine (tabel 1), plaatst deze in een bak met droogmiddelen op de bodem en berg -20 ° C.
   Opmerking: De stappen die het gebruik van biotine-PEG3500-NHS linker omvatten, waaronder 1.2-1.4 (behalve de incubatie en wassen in 1,3), moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
5. Verdun nystatine in N2-5% buffer tot een eindconcentratie van 40 ug / ml te maken. Meng 5 pl gebiotinyleerd RBC met 71,4 gl nystatine (tabel 1) oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij 0 &# 176; C. Tweemaal wassen met N2-5% buffer en winkel met N2-5% buffer + 0,5% BSA (Tabel 1) in de koelkast (4 ° C).

2. Glass Bead silanisatie

1. Reinigen van Bead Surface
   1. Weeg 50 mg glasparels poeder en opnieuw op te schorten ze in 500 ul van DI water.
   2. Meng 0,5 ml 30% H ₂ O ₂ (tabel 1) met 9,5 ml DI water in een bekerglas van 50 ml, voeg vervolgens 2 ml geconcentreerd _NH4OH (tabel 1) en breng deze oplossing een verwarmingsketel op een hete plaat .
   3. Voeg de glasparels de kokende oplossing en laat koken gedurende nog 5 min. Draai de oplossing elke min.
   4. Na het koken, dragen ~ 5 ml van deze hete kraal ophanging in een 15 ml micro-centrifugebuis en vul met RT DI water. Centrifugeer bij 3500 xg gedurende 5 minuten, te verwijderen en gooi het supernatant.
   5. Transfer nog 5 ml heet kraal schorsing en toe te voegen aan de gewassen kralen, Bijvullen met meer DI water, meng goed en centrifuge opnieuw. Herhaal deze procedure tot ongeveer 50 ml gedeïoniseerd water wordt gebruikt, die in totaal 4-5 maal wassen wordt.
   6. Breng de parelsuspensie in een 1 ml ampul. Herhaal het wassen van de bolletjes met methanol (tabel 1) door centrifugeren bij 17.000 xg gedurende 5 min gedurende 3 keer, en uiteindelijk resuspendeer de kralen in 1 ml 100% methanol.
2. Bead Surface thiolering
   1. Aan een 50 ml centrifugebuis voeg 45,6 ml methanol, 0,4 ml azijnzuur (Tabel 1), 1,85 ml gedeïoniseerd water, 1,15 ml 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan (MPTMS) (Tabel 1) en 1 ml parels suspensie bereid in 2,1, Vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 3 uur.
   2. Na de reactie verwijdert alle reactanten door eenmaal wassen met verse methanol en resuspendeer de parels in 500 pl methanol. Gelijkmatig verdelen deze geconcentreerde glazen kraal suspensie in een set van 20 droge en schone glazen flesjes metschroefdoppen. Verdampen van de methanol met behulp van een straal droge argon langzaam draaien de flesjes teneinde een dunne laag droog kralen geven aan de zijkanten van elk flesje.
   3. Plaats de flacons van kralen in een voorverwarmde oven op 120 ° C gedurende 5 minuten en daarna nemen en snel plaats de dop (s) losjes op. Plaats de flesjes in een glazen vacuumexsiccator gevuld met droogmiddelen in de bodem en stofzuigen de exsiccator met een vacuümpomp tot gekoeld.
   4. Spoel de gestofzuigd exsiccator met droge argon aan de exsiccator tot normale atmosferische druk te brengen. Verwijder de exsiccator deksel en snel draai de dop (s) op de flacon. Dicht de flesjes met plastic paraffine film en bewaar ze bij kamertemperatuur in een droge donkere opbergdoos.
   5. Bij onmiddellijk gebruik, neem een flacon droge korrels en eenmaal wassen met fosfaatbuffer (tabellen 1 en 2), resuspendeer in 50 gl fosfaatbuffer en bewaar bij 4 ° C. Deze geconcentreerde kraal preparaat wordt hiernaals "MPTMS beads" in de volgende stappen.
      Opmerking: Met de juiste opslag, kon MPTMS kralen functioneel voor maximaal drie maanden blijven.

3. Bead functionalisering

1. Covalent Coating eiwitten op Beads
   1. Neem een bepaald volume (bijvoorbeeld 2,5 pl) van het eiwit bouillon en meng met een gelijk volume van carbonaat / bicarbonaat buffer oplossing 1 te maken.
      Opmerking: Het volume afhankelijk van de voorraad concentratie en het gewenste uiteindelijke plaatsdichtheid van het eiwit op het oppervlak korrels.
   2. In een klein bekerglas te wegen 2-3 mg MAL-PEG3500-NHS linker (tabel 1) en los het met carbonaat / bicarbonaat buffer tot een uiteindelijke concentratie van 0,231 mg / ml te bereiken.
   3. Meng Oplossing 1 met een gelijk volume van de linker bereid in 3.1.2. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 min om Oplossing 2 te maken.
   4. Ondertussen, plaats de linker fles met losgemaakte dop in een glas vacuümexsiccator filled met droogmiddelen in de bodem en vacuüm gedurende 5 minuten, en vul de exsiccator met argon. Draai de dop en neem de fles uit. Dicht de fles met plastic folie paraffine, plaatst deze in een bak met droogmiddelen op de bodem en berg -20 ° C.
      Opmerking: De stappen die het gebruik van MAL-PEG3500-NHS linker omvatten, waaronder 3.1.2-3.1.4 (behalve de incubatie in 3.1.3), moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
   5. Meng 5 ui MPTMS kralen met Oplossing 2 en voeg fosfaatbuffer (tabel 1) tot een eindvolume van 250 pl te maken.
   6. Incubeer de korrels een nacht bij kamertemperatuur, 3 keer wassen met fosfaatbuffer en resuspendeer in 100 ul fosfaatbuffer en bewaar bij 4 ° C.
2. Voorbereiding Eiwit / Streptavidine (SA) Coated Beads
   1. Volg protocol 3.1.1-3.1.4.
   2. Meng 5 ui MPTMS kralen met Oplossing 2 en 5 gl 4 mg / ml streptavidine-maleïmide (SA-MAL) (Tabel 1) Oplossing en voeg fosfaatbuffer tot een eindvolume van 250 pl te maken.
   3. Incubeer de korrels een nacht bij kamertemperatuur, 3 keer wassen met fosfaatbuffer en uiteindelijk resuspendeer in 100 ul fosfaatbuffer en bewaar bij 4 ° C.
3. Coating Streptavidine op glaskralen
   1. Meng 5 ui MPTMS kralen met 5 gl 4 mg / ml SA-oplossing en voeg 140 pl fosfaatbuffer.
   2. Incubeer de korrels een nacht bij kamertemperatuur, 3 keer wassen met fosfaatbuffer en resuspendeer in 50 gl fosfaatbuffer en bewaar bij 4 ° C.
4. Coaten van de SA Coated Beads met een Gebiotinyleerd Protein
   1. Meng 5 ui SA beklede parels met het eiwit (volume afhankelijk van de gewenste coating dichtheid) en voeg fosfaatbuffer om het uiteindelijke volume op 100 pl.
   2. Incubeer het mengsel overnacht bij 4 ° C of gedurende 3 uur bij kamertemperatuur, 3 keer wassen met fosfaatbuffer, en resuspendeer in 50 gl phosphate buffer en opgeslagen bij 4 ° C.

4. Celbereiding

Opmerking: Om de cellen T-cellen ²⁷ of bepaalde cellijnen ^21,29 zuiveren volgens standaardprocedures cell zuiveringsprotocollen overeenkomend met die van cellen gebruikt, bijvoorbeeld.

1. Voor fBFP experimenten, wanneer de celsuspensie wordt bereid, voeg fura2-AM (tabel 1), opgelost in DMSO aan de celsuspensie tot een eindconcentratie van 2 uM bereikt, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en daarna eenmaal wassen. Houd dit fluorescent geladen celsuspensie in het donker tot gebruik.

5. Voorbereiding voor Micropipetten en een Cell Chamber

1. Voorbereiding Micropipetten
   1. Snijd lange capillaire glazen buisjes (tabel 1) met een glassnijder in korte stukjes van ongeveer 3 centimeter in lengte. Mount één stuk op de micropipet trekker (tabel 1), klik op de "Trek", maarton zodat het midden van het capillair wordt door de machine worden verwarmd en de capillaire zullen worden getrokken uit de beide einden twee capillairen van scherpe punten (raw micropipetten) maken.
      Opmerking: Door het volgen van het product richtlijn, de gewenste morfologie van de ruwe pipet heeft 6-8 mm conus en 0,1-0,5 um tip.
   2. Monteer een rauwe pipet op de pipet houder van de micropipet smederij (tabel 1). Verwarm de glazen bol op de smederij smelten. Steek de punt van de pipet in het ruwe glazen bol. Afkoelen van de glazen bol en trek de ruwe pipet om het te breken van buiten en laat de tip in de bol. Herhaal deze procedure tot de gewenste tip opening wordt verkregen.
      Opmerking: Voorbeelden van een micropipet tip inwendige diameter: 2,0-2,4 urn voor RBC, ~ 1,5 urn voor een kraal, ~ 2-4 micrometer voor een T-cel en -7 urn voor een hybridoma cel.
2. Het bouwen van een Cell Chamber
   Let op: de cel kamer is gebouwd op basis van een home-made kamerhouder, bestaande uit twee stukken metaal vierkantjes (Cu / Al) en een handgreep die ze met elkaar verbindt (figuur 1D).
3. Snij een 40 mm x 22 mm x 0,2 mm dekglaasje met een glazen mes in twee 40 mm x 11 mm x 0,2 mm gesneden (dekglaasje 1 en 2). Glue dekglaasje 1 van vet op de bovenzijde van de kamer houder in de manier waarop zij overbrugt de twee metalen pleinen en soortgelijke dekglaasje lijm 2 aan de onderzijde, waarbij een parallel dekglaasje celkamer (figuur 1D) vormt.
4. Gebruik een pipet om 200 gl buffer experimentele injecteren tussen twee dekglaasjes. Zorg ervoor dat de buffer hecht aan beide dekglaasjes. Voorzichtig draaien en schud de kamer te laten de buffer raken beide uiteinden van de kamer.
5. Injecteer minerale olie voorzichtig in beide zijwanden van de kamer aan weerszijden van de experimentele bufferzone waardoor de buffer uit de buitenlucht verzegeling. Injecteer suspensies probe korrels (bijvoorbeeld pMHC-beklede korrels), RBC's en doelen(Bijvoorbeeld T-cellen) in het bovenste, middelste en onderste delen van de bufferzone respectievelijk.

6. BFP experiment

Figuur 1: fBFP assemblage (A) Een overzicht beeld van de fBFP hardware-systeem.. (B) Een schematische tekening van het fBFP hardwaresysteem. (C) De dual-cam systeem "DC2" (oranje) waarop de high-speed camera (blauw) en een fluorescentie camera (wit) werden gemonteerd. (D) De microscoop podium dat een experiment kamer en drie micropipet manipulatie systemen past. (E en F) Microfoto van BFP setting in een experimentele kamer. (E) Micropipetten samenstel waarin de pipette probe (links), doel pipet (rechtsboven) en helper pipet (rechtsonderechts). (F) Probe kraal plaatsing. Een sonde kraal werd gemanipuleerd door een helper pipet en bevestigd aan een RBC apex om een kracht probe te vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Schakel de microscoop (tabel 1) en de lichtbron. Plaats de kamer op de belangrijkste microscoop podium (figuur 1A, D).
2. Installeer de drie micropipetten van BFP (figuur 1D. Links: probe, een RBC, exact pak: doel, een cel of korrel, rechtsonder pak: helper, een parel grijpen).
   1. Gebruik van een micro-injector (tabel 1) een micropipet experimentele buffer backfill. Haal de pipet houder (tabel 1) en houd het op een lagere plek op het water druipen van de tip mogelijk te maken. Steek snel de micropipet in de houder tip en zorg ervoor dat er geen luchtbel krijgt in de micropipettijdens het inbrengen. Draai de houder vast.
   2. Monteer elke pipet houder op de bijbehorende micro-manipulator. Duw de micropipet in de richting van de kamer, zodat hun tips voer de kamer buffer gebied. Pas de positie van de micropipet en vinden ze onder de microscoop gezichtsveld.
3. Verplaats u in de kamer houder podium om de kolonies van drie elementen (de rode bloedcellen, de doelstellingen en de sonde kralen) vinden één-op-één. Pas de positie van de overeenkomstige micropipet door te draaien aan de knoppen van de manipulatoren te laten de tip van de micropipet aanpak ene cel / kraal. Zuig de cellen / korrel door de druk in de overeenkomstige micropipet. Alle drie micropipetten hun overeenkomstige elementen vastleggen.
4. Verplaats u in de kamer houder podium om een ​​open ruimte weg van de kolonies van de geïnjecteerde elementen, waar het experiment wordt uitgevoerd vinden. Schakel de microscoop visuele modus om de afbeelding te visualiseren op de computer programma op het computerscherm. Verplaats alle drie elementen op pipet tips in beeld veld van het programma.
5. Lijn de probe kraal en RBC en nauwkeurig manoeuvreren probe kraal aan de apex van de RBC kort treffen de hiel op de RBC en zachtjes trekken. Pas de druk van de helper micropipet om voorzichtig te blazen de kraal weg, zodat het links zal worden gelijmd op de RBC apex (Figuur 1F). Ga weg van de helper micropipet en lijn het doel en sonde kraal (Figuur 2A).

Figuur 2:. BFP systeem en de testcyclus (A) Video-microfoto die een kracht sonde (links) en een target T-cellen (rechts) afgezogen door hun respectievelijke pipettes.The stationaire werking probe bestaat uit een gezwollen RBC en een bijgevoegd -ligand dragende bead. De receptor-dragendeT-cellen (doel) wordt gemonteerd op een piezotranslator tegengesteld gericht aan de probe. De ROI is aangegeven in groen. De rand tracker is aangegeven in een blauwe lijn. De inzet toont het ligand (pMHC, kralen kant) en receptor (TCR, T-cel kant) paar op de twee tegengestelde oppervlakken in het gebied gemarkeerd in oranje. (B) Het intensiteitprofiel van de kraal rand in (A). De ROI regio in de x-richting wordt uitgezet als x-as (in aantal pixels) en de lichtsterkte (in grijswaarde) gemiddeld door binning 30 pixels langs de y-richting. (C) de doorbuiging van de RBC en de positie van de hiel en het doel (T-cellen) in een testcyclus kracht clamp test. De verticale en horizontale stippellijnen geven de nulstaaf positie van de RBC apex en het tijdsverloop resp. De lijn rand tracker van de RBC vervorming wordt weergegeven in blauw in elk paneel. Dezelfde maar minder stappen adhesie frequentie aangenomenassay en thermische fluctuatie assay (waarbij de stap van "dissociëren" ontbreekt) (welke de stappen "clamp" en "scheiden" ontbreekt).

6. Op het programma, in de visie gebied venster gebruik maken van de hulpmiddelen in het programma aan de respectievelijke stralen van de sonde micropipet (R _p) te meten, de RBC (R _0), de cirkelvormige contactoppervlak tussen de RBC en sonde kraal (R _c) , waarbij de schatting van de veerconstante van de RBC (k) kan de volgende vergelijking ^17,30,
   
   
   waarbij Δ p is het streven druk sonde pipetpunt.
   
   Opmerking: Uit de wet van Hooke dat de bindende kracht, F, kan worden gekwantificeerd door het product van de lente constant en verplaatsing van de sonde kraal (d), dat wil zeggen, F = d (Figuur 2C).
7. Voer de gewenste RBC veerconstante in het programma (Zie Protocol rubriek 6.6. De veerconstante is doorgaans ingesteld op 0,25 of 0,3 pN / nm voor de kracht klem assay en hechting frequentie test en 0,1 pN / nm voor de thermische fluctuatie assay) , waarin een vereiste aspiratie druk zal terugkeren in de eenheid van de centimeter water. Stel de hoogte van de watertank die links naar pipet van de sonde tot de gewenste opzuigen druk is bereikt.
8. Teken een horizontale lijn over de RBC-top, die een bocht zal opleveren in de aangrenzende venster waarin de helderheid (grijswaarde) van elke pixel langs deze lijn. Sleep de drempel lijn om ongeveer de helft van de diepte van de curve (figuur 2A, B).
   Opmerking: De minimale punt van de helderheid curve onder de drempel regel geeft de positie van de hiel grens, dus slechts één lokaal minimum is toegestaan. Indien twee of meer lokale minima zijn op dit moment,geeft aan dat de afbeelding niet optimaal is (waarschijnlijk te wijten aan het beeld niet scherp, of een slechte afstemming tussen de sonde kraal en de RBC).
9. Selecteer de gewenste experiment modus: thermische fluctuatie assay, hechting frequentie test of kracht klem test. Instellen als gewenst (bv botsing kracht = 15 PN, het laden rate = 1000 pN / s, contacttijd = 1 sec, klemkracht = 20 PN (voor kracht clamp-test), etc) de parameters.
   1. Klik op "Start", waarin het programma naar het doel pipet verplaatsen en rijden het doel in en uit het contact met de sonde (zie representatieve resultaten sectie voor details) mogelijk maakt. De gegevensverzameling wordt parallel uitgevoerd, waarbij de positie van de sonde hiel in real time vastgelegd. Stop het programma door te klikken op de knop "Stop experiment", op dat moment een venster zal pop uit aan het redden van de verkregen gegevens mogelijk te maken.

7. Fluorescentie BFP (fBFP) experiment

1. Om de fluore gebruikenscence functie van het BFP systeem zet de excitatielichtbron (Tabel 1) en de fluorescentie camera (Tabel 1), die worden bestuurd door een afzonderlijk programma (tabel 1). Op het programma selecteert de parameters voor fluorescentie beeldvorming, waaronder gain, belichting, excitatie kanalen (in dit geval, 340 nm en 380 nm licht), enz. Volg alle voorbereidingen in de BFP experiment protocol, met inbegrip van het afstemmen van de sonde en het doel, die zal zorgen voor visualisatie van de doelcel live-tl-image opgewonden door 340 nm of 380 nm excitatie licht.
2. Gebruik het snijden gereedschap om ruwweg sectie het gebied waarbinnen de cel zal blijven gedurende de gehele opnameperiode.
   Opmerking: Door de toepassing van de aanpak-contact-retractie cyclus zal de cel vooruit en achteruit herhaaldelijk, waardoor het doorgesneden gebied is veel groter dan de cel zelf.
3. Klik op "Record" om de 340 nm een ​​toestaand 380 nm licht afwisselend prikkelen de intracellulaire fluorescentie kleurstof (fura2), en een paar overeenkomstige fluorescentiebeelden afwisselend ongeveer elke seconde geregistreerd. Klik simultaan "Start" programma om de BFP experiment voor analyse moleculaire interactie en de fluorescentie imaging experiment intracellulaire calcium signaaloverdracht bewaken beginnen. Het systeem toont een ruwe gegevensbestand van het receptor-ligand-binding (zie figuur 6A hieronder) en een reeks van fluorescerende beelden in TIFF formaat voor de calciumsignalen produceren.

8. Data Analyse

1. BFP Data Analyse
   1. Data-analyse voor de hechting frequentie test
      1. Sequentieel inspecteren elke cyclus van 'kracht vs. tijd "signaal en eenvoudig opnemen die cycli bevatten een hechting evenement en welke niet, en samen te vatten tot een gemiddelde hechting frequentie opleveren.
      2. Verzamel de breuk kracht van elk hechting evenement, datis de piekwaarde van de lineair hellende kracht voordat bond breuk. Na het verzamelen van een voldoende hoeveelheid breuk krachten in een reeks van ramp tarieven, leiden de breuk krachtverdeling bij elke ramp tarief waaruit de kracht-afhankelijke off-rate van receptor-ligand dissociatie wordt afgeleid met behulp van dynamische kracht spectroscopie analyse ^18,31.
   2. Data-analyse voor de thermische fluctuatie assay
      1. Opeenvolgend inspecteren het vastklemmen fase signaal van elke cyclus, die waarschijnlijk bevat meerdere bond associatie en dissociatie gebeurtenissen. Gebruik de klem fase thermische fluctuatie niveau (de gemiddelde standaardafwijking van een glijdende interval van 70 opeenvolgende tijdstippen van de kraal positie) in de "kracht vs. tijd" signaal als een leidraad voor de obligatie associatie en dissociatie gebeurtenissen te onderscheiden, omdat een band formatie komt overeen met een afname van de thermische fluctuatie.
      2. Wijs het interval vanaf het moment van bindingsdissociatie (wanneer de thermal fluctuatie hervat normaal niveau) om het moment van de volgende binding vorming als wachttijd, en wijzen de duur van de binding van deelneming aan dissociatie bankpost- levensduur, die beide gedurende dezelfde data controle. Bereken de gemiddelde wachttijd en de gemiddelde band leven, die respectievelijk weerspiegelen de wederzijdse van on-tarief en die van off-rate onder zero-force ^16,30.
   3. Data-analyse voor kracht klem assay
      1. Record parameters van alle leven evenementen, waaronder de gemiddelde kracht en obligatiemarkten leven met het volgnummer, alsmede de starttijd en de eindtijd, waardoor men een levenslange cumulatieve curve te tekenen (bijvoorbeeld figuur 6C, gele curve).
      2. Verzamel een voldoende hoeveelheid van de levensduur van evenementen in het kader van een reeks van krachten. Groep hen in verschillende kracht bakken, die een gemiddelde levensduur in elke kracht bin zal produceren, en helemaal op een "gemiddelde levensduur vs. force "curve (figuur 4).
2. Calcium fluorescentie Imaging Data Analyse
   1. Stel de intensiteitsdrempel tot fluorescentiebeelden een duidelijke contour van de cel in zowel 340 nm en 380 nm kanalen zonder achtergrondruis (Figuur 5A, B). Raadpleeg vervolgens intracellulair Ca2 ⁺ signaal beeld voor beeld met een pseudo-kleuraanduidelement het intensiteitsniveau (figuur 6B), die verband houdt, gebaseerd op de intensiteit verhouding van 340 nm / 380 nm, om de "genormaliseerde Ca2 ⁺ intensiteit versus genereren . tijd "curve (figuur 6C). Gebruik de pseudo-kleur fluorescentie beelden naar een film die de fluorescentie niveau tweede toont door tweede te produceren.

Resultaten

Het BFP techniek werd ontwikkeld door het laboratorium in Evans 1995 ^17. Deze picoforce gereedschap is uitgebreid gebruikt om interacties van eiwitten geïmmobiliseerd op oppervlakken meten, teneinde tweedimensionale kinetiek van adhesiemoleculen analyseren interactie met hun liganden ^{16,19,20, 30,} moleculaire elasticiteit ^21,29 meten en te bepalen eiwit conformatieveranderingen ^21. Voor een fBFP, een extra set van de epi-fluorescentie-gerelateerde apparaten met de bijbehorende...

Discussie

Een succesvolle fBFP experiment brengt een paar kritische overwegingen. Ten eerste, voor de berekening van krachten betrouwbaar zijn, de micropipet, de RBC en de probe hiel moet worden afgestemd coaxiaal zo dicht mogelijk. De projectie van de RBC in de pipet moet ongeveer één probe pipet diameter zodat de wrijving tussen de RBC en de pipet verwaarloosbaar. Voor een typische humane RBC, de optimale pipet diameter 2,0-2,4 urn, waarbij een beste passing van vergelijking 1 ^17,30 oplevert. Ten tweede, om te waarbo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Fosfaatbuffervoorbereiding
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Fosfaatbuffervoorbereiding
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonaat/bicarbonaatbuffervoorbereiding
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonaat/bicarbonaatbuffervoorbereiding
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	N2-5%-buffervoorbereiding
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	N2-5%-buffervoorbereiding
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655	N2-5%-buffervoorbereiding
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	N2-5%-buffervoorbereiding
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Beadfunctionalisatie
Biotin-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	RBC biotinylering
Nystatin	Sigma-Aldrich	N6261	RBC osmolariteitsaanpassing
Ammonium Hydroxide (NH4OH)	Sigma-Aldrich	A-6899	Glaskralen silanisering
Methanol	BDH	67-56-1	Glaskralen silanisering
30% Hydrogen Peroxide (H2O2)	J. T. Barker	Jan-86	Glaskralen silanisering
Acetic Acid (Glacial)	Sigma-Aldrich	ARK2183	Glaskralen silanisering
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)	Uct Specialties, llc	4420-74-0	Glaskralenfunctionalisatie
Borosilicate Glass beads	Distrilab Particle Technology	9002	Glaskralenfunctionalisatie
Streptavidin−Maleimide	Sigma-Aldrich	S9415	Glaskralenfunctionalisatie
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Ligand functionaliseren
Fura2-AM	Life Technologies	F-1201	Intracellulair calciumfluorescentie kleurstof laden
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Intracellulair calciumfluorescentie kleurstof laden
Quantibrite PE Beads	BD Biosciences	340495	Dichtheidskwantificering
Flow Cytometer	BD Biosciences	BD LSR II	Dichtheidskwantificering
Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches	Kimble Chase	46485-1	Micropipet maken
Flaming/Brown Micropipette Puller	sutter instrument	P-97	Micropipet maken
Pipette microforce	Narishige	MF-900	Micropipet maken
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP2629-1	Kammersamenstelling
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-G	Kammersamenstelling
Micro-injector	World Precision Instruments	MF34G-5	Kammersamenstelling
1 ml syringe	BD	309602	Kammersamenstelling
Micropipette holder	Narishige	HI-7	Kammersamenstelling
Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining.	Biophysics Instrument	Alle onderdelen zijn aangepast volgens de CAD-ontwerpen.	BFP systeem
Microscope (TiE inverted)	Nikon	MEA53100	BFP systeem
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)	Nikon	MRH00401	BFP systeem
Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono	Graftek Imaging	02-2020C	BFP systeem
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC	Graftek Imaging	02-2185A	BFP systeem
Manual submicron probehead with high resolution remote control	Karl Suss	PH400	BFP systeem
Anti-vibration table (5’ x 3’)	TMC	77049089	BFP systeem
3D manual translational stage	Newport	462-XYZ-M
SolidWorks 3D CAD software	SOLIDWORKS Corp.	Version 2012 SP5	BFP systeem
LabVIEW software	National Instruments	Version 2009	BFP systeem, BFP programma
3D piezo translational stage	Physik Instrumente	M-105.3P	BFP systeem
Linear piezo accuator	Physik Instrumente	P-753.1CD	BFP systeem
Micromanager software		Version 1.4	fBFP systeem, fluorescentiebeeldvorming programma
Dual Cam (DC-2)	Photometrics	77054724	fBFP systeem
Dual Cam emission filter (T565LPXR)	Photometrics	77054725	fBFP systeem
Fluorescence Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600-10B	fBFP systeem
Plastic paraffin film (Parafilm)	Bemis Company, Inc	PM996	fles afsluiten
Carbonaat/bicarbonaatbuffer (pH 8,5)			8,4 g/L natriumcarbonaat (Na2CO3), 10,6 g/L natriumbicarbonaat (NaHCO3)
Fosfaatbuffer (pH 6,5-6,8)			27,6 g/L NaFosfaat monobasic (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfaat dibasic (Na2HPO