Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Summary

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Abstract

Membraan receptor-ligand-interacties mediëren vele cellulaire functies. Bindingskinetiek en downstream signalering veroorzaakt door deze moleculaire interacties worden waarschijnlijk beïnvloed door de mechanische omgeving waarin binding en signalering plaatsvinden. Een recente studie toonde aan dat mechanische kracht antigen herkenning door kunnen regelen en activeren van de T-celreceptor (TCR). Dit werd mogelijk gemaakt door een nieuwe technologie die we ontwikkeld en genoemd fluorescentie biomembraan kracht sonde (fBFP), die single-molecule kracht spectroscopie gecombineerd met fluorescentiemicroscopie. Met behulp van een ultra-soft menselijke rode bloedcellen als gevoelige krachtsensor, een high-speed camera en real-time imaging volgtechnieken, de fBFP is ~ 1 pN (10 ^-12 N) ~ 3 nm tot ~ 0,5 msec kracht, ruimtelijke en temporele resolutie. Met de fBFP, kan men precies enkele receptor-ligand bindingskinetiek onder dwang regelgeving en tegelijkertijd het binding-geactiveerd intracellulaire cal metenCium signalering op een enkele levende cellen. Deze nieuwe technologie kan worden gebruikt om andere membraan receptor-ligand interactie en signalering bestuderen andere cellen onder mechanische regeling.

Introduction

Cel-cel en cel-extracellulaire matrix (ECM) adhesie wordt gemedieerd door binding tussen celoppervlakreceptoren ECM proteïnen, en / of lipiden ^1. Binding cellen mogelijk maakt functionele structuur ¹ vormen, alsmede erkennen communiceren, en reageren op de omgeving ^1-3. Unlike oplosbare proteïnen (bijvoorbeeld cytokines en groeifactoren) die binden van een driedimensionaal (3D) vloeistoffase op het celoppervlak receptoren, celadhesie receptoren vormen banden met hun liganden over een smalle spleet junctie met twee tegenover elkaar gelegen oppervlakken die moleculaire beperken overbruggen diffusie in een dimensionale (2D) inte....

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van en is door het menselijk onderzoek ethische commissie van het Georgia Institute of Technology zijn goedgekeurd.

1. Human RBC Isolatie, Biotinylatie en Osmolariteit Aanpassing

Opmerking: Stap 1.1 moet worden uitgevoerd door een opgeleide medische professional zoals een verpleegkundige, met een Institutional Review Board goedgekeurd protocol.

1. Verkrijgen 8-10 gl (één druppel) van bloed van vingerprik en aan 1 ml van het carbonaat / bicarbonaatbuffer (Tabel 1 en 2). Voorzichtig vortex of pipet het mengsel en centrifugeer gedurende 1....

Results

Het BFP techniek werd ontwikkeld door het laboratorium in Evans 1995 ^17. Deze picoforce gereedschap is uitgebreid gebruikt om interacties van eiwitten geïmmobiliseerd op oppervlakken meten, teneinde tweedimensionale kinetiek van adhesiemoleculen analyseren interactie met hun liganden ^{16,19,20, 30,} moleculaire elasticiteit ^21,29 meten en te bepalen eiwit conformatieveranderingen ^21. Voor een fBFP, een extra set van de epi-fluorescentie-gerelateerde apparaten met de bijbehorende.......

Discussion

Een succesvolle fBFP experiment brengt een paar kritische overwegingen. Ten eerste, voor de berekening van krachten betrouwbaar zijn, de micropipet, de RBC en de probe hiel moet worden afgestemd coaxiaal zo dicht mogelijk. De projectie van de RBC in de pipet moet ongeveer één probe pipet diameter zodat de wrijving tussen de RBC en de pipet verwaarloosbaar. Voor een typische humane RBC, de optimale pipet diameter 2,0-2,4 urn, waarbij een beste passing van vergelijking 1 ^17,30 oplevert. Ten tweede, om te waarbo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Phosphate buffer preparation
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Phosphate buffer preparation
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonate/bicarbonate buffer preparation
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonate/bicarbonate buffer preparation
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	N2-5% buffer preparation
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	N2-5% buffer preparation
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655	N2-5% buffer preparation
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	N2-5% buffer preparation
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Bead functionalization
Biotin-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	RBC biotinylation
Nystatin	Sigma-Aldrich	N6261	RBC osmolarity adjustment
Ammonium Hydroxide (NH4OH)	Sigma-Aldrich	A-6899	Glass bead silanization
Methanol	BDH	67-56-1	Glass bead silanization
30% Hydrogen Peroxide (H2O2)	J. T. Barker	Jan-86	Glass bead silanization
Acetic Acid (Glacial)	Sigma-Aldrich	ARK2183	Glass bead silanization
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)	Uct Specialties, llc	4420-74-0	Glass bead functionalization
Borosilicate Glass beads	Distrilab Particle Technology	9002	Glass bead functionalization
Streptavidin−Maleimide	Sigma-Aldrich	S9415	Glass bead functionalization
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Ligand functionalizing
Fura2-AM	Life Technologies	F-1201	Intracellular calcium fluorescence dye loading
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Intracellular calcium fluorescence dye loading
Quantibrite PE Beads	BD Biosciences	340495	Density quantification
Flow Cytometer	BD Biosciences	BD LSR II	Density quantification
Capillary Tube 0.7-1.0 mm x 30 inches	Kimble Chase	46485-1	Micropipette making
Flaming/Brown Micropipette Puller	sutter instrument	P-97	Micropipette making
Pipette microforce	Narishige	MF-900	Micropipette making
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP2629-1	Chamber assembly
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-G	Chamber assembly
Micro-injector	World Precision Instruments	MF34G-5	Chamber assembly
1 ml syringe	BD	309602	chamber assembly
Micropipette holder	Narishige	HI-7	Chamber assembly
Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining.	Biophysics Instrument	All parts are customized according to the CAD designs.	BFP system
Microscope (TiE inverted)	Nikon	MEA53100	BFP system
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)	Nikon	MRH00401	BFP system
Camera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono	Graftek Imaging	02-2020C	BFP system
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC	Graftek Imaging	02-2185A	BFP system
Manual submicron probehead with high resolution remote control	Karl Suss	PH400	BFP system
Anti-vibration table (5’ x 3’)	TMC	77049089	BFP system
3D manual translational stage	Newport	462-XYZ-M
SolidWorks 3D CAD software	SOLIDWORKS Corp.	Version 2012 SP5	BFP system
LabVIEW software	National Instruments	Version 2009	BFP system, BFP program
3D piezo translational stage	Physik Instrumente	M-105.3P	BFP system
Linear piezo accuator	Physik Instrumente	P-753.1CD	BFP system
Micromanager software		Version 1.4	fBFP system, fluorescence imaging program
Dual Cam (DC-2)	Photometrics	77054724	fBFP system
Dual Cam emission filter (T565LPXR)	Photometrics	77054725	fBFP system
Fluorescence Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600-10B	fBFP system
Plastic paraffin film (Parafilm)	Bemis Company, Inc	PM996	bottle sealing
Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5)			8.4 g/L sodium carbonate (Na2CO3), 10.6 g/L sodium bicarbonate (NaHCO3)
Phosphate buffer (pH 6.5-6.8)			27.6 g/L NaPhosphate monobasic (NaH2PO4 • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate dibasic (Na2HPO4)
N2-5% buffer (pH 7.2)			20.77 g/L potassium chloride (KCl), 2.38 g/L sodium chloride (NaCl), 0.13 g/L potassium phosphate monobasic (KH2PO4), 0.71 g/L anhy. sodium phosphate dibasic (Na2HPO4), 9.70 g/L sucrose