Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53035

⸱

1 september 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

In dit artikel

Samenvatting

Ionenkanalen tot expressie in renale tubulaire epitheel spelen een belangrijke rol in de pathologie van polycystische nierziekte. Hier beschrijven we de experimentele protocollen die worden gebruikt om patch-clamp-analyse en intracellulaire calciumgehalte metingen uit te voeren in cystic epitheel vers geïsoleerd van knaagdieren nieren.

Samenvatting

Cyste initiatie en uitzetting gedurende polycystische nierziekte is een complex proces gekenmerkt door afwijkingen in buisvormige celproliferatie, luminale vochtophoping en extracellulaire matrixvorming. Activiteit van ionkanalen en intracellulaire calcium signalering zijn belangrijke fysiologische parameters welke functies van tubulaire epitheel te bepalen. We ontwikkelden een methode geschikt is voor real-time observatie van ionkanalen activiteit met patch-clamp techniek en de registratie van de intracellulaire Ca 2+ niveau epitheelmonolagen vers geïsoleerd van renale cysten. PCK ratten, een genetisch model van autosomaal recessieve polycystische nierziekte (ARPKD), hier werden gebruikt voor de ex vivo analyse van ionkanalen en calcium flux. Hier beschreven is een gedetailleerde stap-voor-stap procedure die tot cystic monolagen en de niet verwijde buisjes van PCK of normaal Sprague Dawley (SD) ratten isoleren en controleren enkel kanaal activiteit en intracellulaire Ca2 + dynamiek.Deze methode niet enzymatische verwerking vereisen en maakt analyse in een inheemse setting van vers geïsoleerde epitheliale monolaag. Bovendien is deze techniek zeer gevoelig is voor intracellulaire calcium veranderingen genereert hoge resolutiebeelden voor nauwkeurige metingen. Tenslotte kunnen geïsoleerde blaas epitheel verder worden gebruikt voor kleuring met antilichamen of kleurstoffen, bereiden van primaire kweken en zuivering van verschillende biochemische assays.

Inleiding

Ionenkanalen spelen een belangrijke rol in vele fysiologische functies, waaronder celgroei en differentiatie. Autosomaal dominante en recessieve polycystische nierziekten (ADPKD en ARPKD respectievelijk) genetische aandoeningen gekenmerkt door de ontwikkeling van renale vloeistof gevulde cysten van de buisvormige epitheelcel oorsprong. ADPKD wordt veroorzaakt door mutaties van PKD1 of PKD2 genen die polycystins 1 en 2, membraaneiwitten betrokken bij de regulering van celproliferatie en differentiatie. PKD2 op zichzelf of als een complex met PKD1 ook functioneren als een Ca2 + -doorlaatbare kationenkanaal 1. Mutaties van het gen dat codeert fibrocystin PKHD1 (a cilia-geassocieerde receptor-achtige eiwitten die betrokken zijn bij de tubulogenesis en / of onderhoud van polariteit van epitheel) de genetische impuls van ARPKD 2. Cyste groei is een complex fenomeen gepaard met verstoorde proliferatie 3,4, angiogenese 5, dedifferentiatie en het verlies van polaireteit van de tubulaire cellen 6-8.

Defecte reabsorptie en augmented secretie in cystic epitheel bijdragen aan vochtophoping in het lumen en cyste uitbreiding 9,10. Verminderde doorstroming afhankelijk [Ca 2+] i signalering is ook gekoppeld aan cystogenesis tijdens PKD 11-15.

Hier beschrijven we een werkwijze geschikt voor patch-clamp metingen van één kanaal activiteit en intracellulaire Ca2 + niveaus in cystic epitheliale monolagen geïsoleerd van PCK ratten. Deze methode werd met succes toegepast door ons te karakteriseren van activiteit van de epitheliale Na + kanaal (ENaC) 10 en [Ca 2+] i afhankelijke processen veroorzaakt door Ca 2+ -doorlaatbare TRPV4 en purinerge signalisatie cascade 13.

In deze studies gebruikten we PCK ratten, een model van ARPKD veroorzaakt door een spontane mutatie in het gen PKHD1. De PCK stam was originally afkomstig van Sprague-Dawley (SD) ratten 16 daardoor SD ratten gekozen als controle voor vergelijking met de PCK stam. Daardoor kan zowel SD rat nefron segmenten en niet-verwijde verzamelbuizen geïsoleerd uit dezelfde PCK ratten dienen als twee vergelijkingsgroepen voor experimenten op cystic epitheel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op het Medical College of Wisconsin en de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren. Figuur 1 toont de belangrijkste stappen van de isolatie weefsel en veredeling. In het kort worden de nieren van PCK of SD-ratten gebruikt voor het handmatig isoleren van epitheliale monolagen van verzamelbuizen hetzij van gezonde niet-gekozen buisjes of cysten. Hier studeerde we nieren 4-16 weken oud PCK ratten 10,13.

1. Isolatie van Nier cysten en aansluiten Buisjes (CNT) / Verzamelen Goten (CD) Segmenten

  1. Verdoven proefdier met isofluraan (5% inductie, 1,5 tot 2,5% onderhoud) / medische kwaliteit O 2 of een andere goedgekeurde methode. Dieren moeten voortdurend worden bewaakt om adequate le zorgenvel van de anesthesie. Stabiele ademhaling en teen knijpen reactie worden gebruikt om de juiste verdoving bevestigen.
  2. Voer laparotomie en spoel de nieren met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) via de abdominale aorta 17.
    1. Bereid een polyethyleen buis catheter (PE50) en sluit hem aan op een injectiepomp gevuld met PBS. Snijd de huid en de buikwand langs de linea alba, maak dan een dwarse incisie in de buik over de buik van links naar rechts en de verschuiving van de buikorganen met wattenstaafjes om de toegang tot de dalende aorta komen met vertakkende mesenterische en coeliakie slagaders. Bevochtig de inwendige organen met warme zoutoplossing tijdens de verdere procedures om hun droogte te voorkomen.
    2. Plaats een ligatuur (# 1) rond de mesenterische en coeliakie slagaders en andere ligatuur (# 2) rond de aorta onder het membraan (niet binden). Scheiden voorzichtig een. abdominalis door stomp ontleden bindweefsel rond het met dunne pincet en plaats twee ligaturen ~ 3mm onder de linker nierslagader (# 3) en boven de iliacale arteriën bifurcatie (# 4).
    3. Bind ligatuur # 4 en voeg een vat klem rond de aorta tussen de linker nierslagader en ligatuur # 3. Maak een incisie tussen de klem en ligatuur # 4 naar de aorta katheteriseren, gebruiken ligatuur # 3 om de catheter stevig vast te stellen.
    4. Laat de klem en zorg ervoor dat het bloed puls is zichtbaar in de katheter om de juiste installatie te verzekeren. Beginnen perfusie met een snelheid van 6 ml / min, das ligaturen # 1 en # 2, en snijd de linker nier ader. Verder spoelen gedurende 1-2 min tot de organen volledig geblancheerd.
    5. Renale bloedvaten, urethra en de omliggende bindweefsel en vetweefsel knippen met een schaar aan de nieren te verzamelen. Maak dan een korte scheur in de nier capsule en schil de nieren om ze decapsulate. Plaats de nieren in ijskoud PBS. Euthanasie wordt bevestigd door een thoracotomie.
  3. Bereid 5 x 5 mm dekglas chips bekleed met poly-L-lysine. Snijd een cover GLAss met een diamant potlood en plaats ongeveer 20 ui 0,01% steriel gefiltreerd Poly-L-lysine oplossing op elk glas chip. Bereid zoutoplossing en twee paar horlogemaker tang voor dissectie.
  4. Snijd de nieren met een scheermesje langs het frontale vlak in plakjes ~ 1-2 mm dik. Plaats een van de segmenten onder een stereomicroscoop. Isolatie van weefsels moet gebeuren in ijskoude zoutoplossing.
  5. Lokaliseren cysten onder een stereomicroscoop als round-shape holtes (Figuur 2A); hun muren bevatten vaak prominente netwerk van verspreid bloedvaten. Gebruik fijne punt tang ontleden de interne epitheliale laag van een cyste zo dun mogelijk om een ​​monolaag gebied te verkrijgen. Maak het aan een glazen chip bedekt met poly-L-lysine. Kleverige Poly-L-Lysine oppervlak kan de onderzoeker stevig positioneren interne cyste laag op glas. Expose de cyste met de apicale kant naar boven om de toegang voor de pipetten (Figuur 2B) te verstrekken.
  6. Gebruik PCK of SD rat kindney centrale schijfjes bevatten papilla voor isolatie van niet-verwijde CNT / CCDsegments 18-21.
    OPMERKING: Papillaire weefsels duurzamer dan cortex en houden papillaire buisvormige banden met een pincet en scheuren langs de radiale as van de plak kan worden gesplitst in dunne sectoren. Afzonderlijke buisjes zijn zichtbaar en kunnen worden getrokken op hoes glazen chips worden geplaatst.
  7. Identificeren van de CNT / CCD segmenten van vertakkingen, grotere transparantie dan proximale buisjes en grote prominent zichtbare cellen (figuur 2C). Plaats het deksel glas chip met aangehechte buisjes onder een microscoop uitgerust met micromanipulators geschikt voor het rijden micropipetten. Met behulp van scherpe micropipetten split open buisjes en hechten hun randen aan het glas op het apicale oppervlak toegankelijk te maken (Figuur 2D).

2. Single Channel Patch-clamp elektrofysiologie

  1. Vul de patch-clamp kamer met bad oplossing en breng het deksel glas chipmet geïsoleerde weefsels naar de kamer. Zorg ervoor dat de patch-clamp micropipetten hebben weerstand van 10/07 MQ voor een betrouwbare on-cel (cel bevestigd) metingen.
  2. Voor de cel bevestigd metingen, zet de versterker winst verhouding tot 20x en low-pass de stroming bij 300 Hz met een acht-polige Bessel-filter. Voor de bewaking ENaC kanalen, gebruikt een bad oplossing in mM: 150 NaCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7,4); pipet: 140 LiCl, 2 MgCl2 en 10 HEPES (pH 7,4).
  3. Voer een conventionele patch-clamp experiment in een cel bevestigd modus 10. Selecteer een cel in de epitheliale monolaag en benaderen de pipet om het apicale membraan. Vormen een hoge weerstand afdichting tussen een pipet en celmembraan door het toepassen van zachte zuigkracht. Zodra een hoog resistente gigaohm afdichting wordt gevormd, zou een spleetvrije protocol op een bedrijf potentieel worden gestart voor de monitoring activiteit van het kanaal van belang.
  4. Store gap-free enkel kanaal huidige gegevens van gigaOhm verbindingen voor daaropvolgende analyse. Analyseer het kanaal gebeurtenissen met behulp van een softwarepakket het algemeen geleverd met patch-clamp opstellingen 18. Bereken kanaalactiviteit als NPO waarbij N verwijst naar het aantal actieve kanalen in de pleister en P o gemiddeld geopend waarschijnlijkheid van de kanalen.
    OPMERKING: Gebruik geïsoleerde cysten of buisjes in patch-clamp experimenten niet meer dan 30 min.

3. Ratiometrische epi-fluorescent Metingen van de intracellulaire calciumconcentratie in de epitheelcellen

  1. Gebruik 5 mM Fura-02:00 opgelost in DMSO. Aliquot voorraad oplossing in individuele 500 pi conische buizen (ongeveer 10 pl). Beschermen tegen licht en op te slaan in de vriezer bij -20 ° C voor maximaal zes maanden.
  2. Incubeer geïsoleerde cysten en split open buisjes voor 30-40 min in de PSS (in mm: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2 en 10 HEPES bij pH 7,35) met 5 uM Fura-02:00 kleurstof en 0,05% pluronzuur om verspreiding van de acetoxymethylesters. Daarvoor in de plaats weefsels 3,5 cm schaaltje met laden cocktail, bescherming tegen licht en incubeer op een langzame shaker bij kamertemperatuur.
  3. Verander Fura-2 AM bevattende media te reinigen PSS na incubatie en plaats het weefsel onder een microscoop te epifluorescentie- beeldvorming verder voeren.
  4. Schakel CCD camera en stabiele lichtbron (monochromator systeem) voorzien filterwiel (elk filter positie kan worden door zijn eigen demping niveau telkens het filter wordt geselecteerd).
  5. Vind het weefsel in heldere gebied. Schakel om detectie van het fluorescentiesignaal en de intensiteit van de lichtbron via grijsfilters en lampvermogen verzadiging van het signaal te voorkomen.
  6. Monitor Fura-2 AM fluorescentie in het weefselmonster met ratiometrische excitatie bij 340/380 nm met een frequentie van 0.125 Hz of hoger. Gebruik een 40 × / NA 1.3 of soortgelijke objectief voor de juiste resolutiesimage tie.
  7. Voor beeldverwerking en berekeningen importeer de sequentie van beelden. Zorg ervoor om de kanalen te splitsen en gebruik een HyperStack grijstinten-modus. Selecteer meerdere regio's van belang (single cyste cellen of geselecteerde gebieden van cystische weefsel) en het berekenen van de intensiteit waarden voor elk kanaal (340 en 380 nm) in de voorkeur data-analyse software; aftrekken achtergrond intensiteit waarden van elk gegevenspunt.
  8. Voor elk tijdstip berekent de verhouding van intensiteiten van de Fura-2 AM 340 om 380 kanalen. Perceel scatter / line point-time wijzigingen van Ca 2+ transient voor elke regio en het berekenen van de gemiddelde / SE waarden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Potentiële ENaC betrokkenheid bij cystogenesis is aangetoond door verscheidene studies die verstoorde epidermale groeifactor (EGF) waargenomen signalering in PKD progressie 22-25 en abnormale natrium reabsorptie in ARPKD muizenmodellen en weefselculturen 26-28. Zo Veizis et al. Toonde aan dat de amiloride gevoelige Na + absorptie verminderd bij CD cellen van de niet-orthologe BPK muismodel van ARPKD 29. We hebben onlangs aangetoond dat een verminderde natrium en water...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hier beschreven toepassingen van conventionele patch-clamp techniek en epifluorescentie calcium beeldvorming om cystic epitheelmonolagen afgeleid van een muizen genetisch model van ARPKD. Het protocol bestaat uit drie stappen, waarbij de meeste aandacht moet worden besteed aan de isolatie van de cysten (stap 1.5 van de sectie protocollen) en de elektrofysiologische studies. Deze belangrijke procedures vereisen uitgebreide training en geduld, en de lezer mag niet worden gefrustreerd tegelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag naar Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) en Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) bedanken voor de uitstekende technische hulp bij microscopie experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health subsidies R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (naar OPO) en K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (naar OPO) en de Ben J. Lipps Research Fellowship van de American Society of Nephrology (DVI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Poly-L-lysineSigma-AldrichP4707
Pluronic acidSigma-AldrichF-68 oplossing
ShakerBoekel Scientific260350
LichtbronSutter Instrument CoLambda XLmet geïntegreerde sluiter/filterwielbestuurder
Neutrale dichtheidsfiltersNikonND4, ND8
ObjectiefNikonSFluo 40/1.3 DIC WD 0.22   olie
CameraAndor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  microscoop (invers)NikonNikon Eclipse TE2000-S
DekglasThermo Scientific6661B52
DiamantpotloodFisher Scientific22268912
BeeldverwervingssoftwareNikonNikon NIS-Elements 
BeeldanalysesoftwareImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Utility plugin maakt het mogelijk om afbeeldingen te importeren in het native Nikon Instruments.nd2 formaat
Opname-/perfusiekamerWarner InstrumentsRC-26
Patch Clamp versterkerMolecular DevicesMultiClamp 700B
DataverwervingssysteemMolecular DevicesDigidata 1440AAxon Digidata® Systeem
LaagdoorlaatfilterWarner InstrumentsLPF-88 polige Bessel
Borosilicaatglas capillairenWorld Precision Instruments1B150F-4
Micropipet-pullerSutter Instrument CoP-97Flaming/Brown type micropipet-puller
MicroforgeNarishigeMF-830Japan
Gemotoriseerde micromanipulatorSutter Instrument CoMP-225
Invers microscoopNikonEclipse Ti
Microvibratie-isolatietafelTMCuitgerust met een Faraday-kooi
Meerkanaals klepperfusiesysteemAutoMake ScientificValve Bank II
Opname-/perfusiekamerWarner InstrumentsRC-26
SoftwareMolecular DevicespClamp 10 . 2
Temperatuurgestuurde chirurgische tafel MCW kernvoor knaagdieren
Binoculair stereomicroscoopNikonSMZ745
Spuitpomp-gebaseerd perfusiesysteemHarvard Apparatus
Polyethyleen slangSigma-AldrichPE50
Isofluran-anesthesiehttp://www.vetequip.com/911103
Andere basisreagentiaSigma-Aldrich

Referenties

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Ionkanaalactiviteitintracellulair calciumisolatie van cystische monolagenelektrofysiologische registratiecalciumimagingconfocale microscopieladen met fluorescente kleurstof
Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.