Ionenkanalen tot expressie in renale tubulaire epitheel spelen een belangrijke rol in de pathologie van polycystische nierziekte. Hier beschrijven we de experimentele protocollen die worden gebruikt om patch-clamp-analyse en intracellulaire calciumgehalte metingen uit te voeren in cystic epitheel vers geïsoleerd van knaagdieren nieren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cyste initiatie en uitzetting gedurende polycystische nierziekte is een complex proces gekenmerkt door afwijkingen in buisvormige celproliferatie, luminale vochtophoping en extracellulaire matrixvorming. Activiteit van ionkanalen en intracellulaire calcium signalering zijn belangrijke fysiologische parameters welke functies van tubulaire epitheel te bepalen. We ontwikkelden een methode geschikt is voor real-time observatie van ionkanalen activiteit met patch-clamp techniek en de registratie van de intracellulaire Ca 2+ niveau epitheelmonolagen vers geïsoleerd van renale cysten. PCK ratten, een genetisch model van autosomaal recessieve polycystische nierziekte (ARPKD), hier werden gebruikt voor de ex vivo analyse van ionkanalen en calcium flux. Hier beschreven is een gedetailleerde stap-voor-stap procedure die tot cystic monolagen en de niet verwijde buisjes van PCK of normaal Sprague Dawley (SD) ratten isoleren en controleren enkel kanaal activiteit en intracellulaire Ca2 + dynamiek.Deze methode niet enzymatische verwerking vereisen en maakt analyse in een inheemse setting van vers geïsoleerde epitheliale monolaag. Bovendien is deze techniek zeer gevoelig is voor intracellulaire calcium veranderingen genereert hoge resolutiebeelden voor nauwkeurige metingen. Tenslotte kunnen geïsoleerde blaas epitheel verder worden gebruikt voor kleuring met antilichamen of kleurstoffen, bereiden van primaire kweken en zuivering van verschillende biochemische assays.
Inleiding
Ionenkanalen spelen een belangrijke rol in vele fysiologische functies, waaronder celgroei en differentiatie. Autosomaal dominante en recessieve polycystische nierziekten (ADPKD en ARPKD respectievelijk) genetische aandoeningen gekenmerkt door de ontwikkeling van renale vloeistof gevulde cysten van de buisvormige epitheelcel oorsprong. ADPKD wordt veroorzaakt door mutaties van PKD1 of PKD2 genen die polycystins 1 en 2, membraaneiwitten betrokken bij de regulering van celproliferatie en differentiatie. PKD2 op zichzelf of als een complex met PKD1 ook functioneren als een Ca2 + -doorlaatbare kationenkanaal 1. Mutaties van het gen dat codeert fibro....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op het Medical College of Wisconsin en de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren. Figuur 1 toont de belangrijkste stappen van de isolatie weefsel en veredeling. In het kort worden de nieren van PCK of SD-ratten gebruikt voor het handmatig isoleren van epitheliale monolagen van verzamelbuizen hetzij van gezonde niet-gekozen buisjes of cysten. Hier studeerde we nieren 4-16 weken oud PCK ratten 10,13.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Potentiële ENaC betrokkenheid bij cystogenesis is aangetoond door verscheidene studies die verstoorde epidermale groeifactor (EGF) waargenomen signalering in PKD progressie 22-25 en abnormale natrium reabsorptie in ARPKD muizenmodellen en weefselculturen 26-28. Zo Veizis et al. Toonde aan dat de amiloride gevoelige Na + absorptie verminderd bij CD cellen van de niet-orthologe BPK muismodel van ARPKD 29. We hebben onlangs aangetoond dat een verminderde natrium en water.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hier beschreven toepassingen van conventionele patch-clamp techniek en epifluorescentie calcium beeldvorming om cystic epitheelmonolagen afgeleid van een muizen genetisch model van ARPKD. Het protocol bestaat uit drie stappen, waarbij de meeste aandacht moet worden besteed aan de isolatie van de cysten (stap 1.5 van de sectie protocollen) en de elektrofysiologische studies. Deze belangrijke procedures vereisen uitgebreide training en geduld, en de lezer mag niet worden gefrustreerd tegelijk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag naar Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) en Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) bedanken voor de uitstekende technische hulp bij microscopie experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institutes of Health subsidies R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (naar OPO) en K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (naar OPO) en de Ben J. Lipps Research Fellowship van de American Society of Nephrology (DVI).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | oplossing |
| Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
| Lichtbron | Sutter Instrument Co | Lambda XL | met geïntegreerde sluiter/filterwielbestuurder |
| Neutrale dichtheidsfilters | Nikon | ND4, ND8 | |
| Objectief | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 olie |
| Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon microscoop (invers) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Dekglas | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Diamantpotlood | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Beeldverwervingssoftware | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Beeldanalysesoftware | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin maakt het mogelijk om afbeeldingen te importeren in het native Nikon Instruments.nd2 formaat |
| Opname-/perfusiekamer | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp versterker | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Dataverwervingssysteem | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® Systeem |
| Laagdoorlaatfilter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 polige Bessel |
| Borosilicaatglas capillairen | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipet-puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipet-puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Gemotoriseerde micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Invers microscoop | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibratie-isolatietafel | TMC | uitgerust met een Faraday-kooi | |
| Meerkanaals klepperfusiesysteem | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Opname-/perfusiekamer | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
| Temperatuurgestuurde chirurgische tafel | MCW kern | voor knaagdieren | |
| Binoculair stereomicroscoop | Nikon | SMZ745 | |
| Spuitpomp-gebaseerd perfusiesysteem | Harvard Apparatus | ||
| Polyethyleen slang | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluran-anesthesie | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
| Andere basisreagentia | Sigma-Aldrich |
Referenties
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
- Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recess....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
