Methodenartikel

Maatwerk microdialysesonde ontwerp

DOI:

10.3791/53048

⸱

21 juli 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Goethe University of Frankfurt, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Goethe University of Frankfurt, 3Department of Clinical Pharmacology, Goethe University of Frankfurt

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microdialyse is een veelgebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek. Daarom commerciële sondes zijn in grote demand.In dit werk een sonde assemblage wordt in detail uitgelegd om een ​​betrouwbare, concentrische, op maat gemaakte microdialysesonde te bouwen voor minder dan $ 10.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microdialyse is een veelgebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek. Daarom commerciële sondes zijn in grote vraag naar de fysiologische, farmacologische en pathologische veranderingen in de cerebrospinale vloeistof te controleren. Helaas, commerciële probes zijn duur voor onderzoeksgroepen in openbare instellingen. In dit werk, wordt een sonde montage in detail uitgelegd om een ​​betrouwbare, concentrische, op maat gemaakte microdialysesonde te bouwen voor minder dan $ 10. De microdialyse sonde bestaat uit een polysulfon membraan met een moleculaire cut-off van 30 kDa. Probe in vitro teruggevonden stoffen met verschillend molecuulgewicht (in de orde van 100-1,600 Da) en verschillende fysicochemische eigenschappen worden vergeleken. De probe levert een in vitro herstel van ongeveer 20% voor kleine verbindingen glucose, lactaat, acetylcholine en ATP. In vitro herstel van neuropeptiden met een molecuulgewicht tussen 1,000-1,600 Da bedraagt ​​2-6%. Terwijl de hogere moleculaire wacht van de neuropeptiden verlaagde in vitro herstel waarden, dialyse van verbindingen in het lagere bereik (tot 500 Da) van molecuulgewicht heeft geen grote invloed op de in vitro recovery rate. De onderhavige werkwijze maakt gebruik van een dialysemembraan met andere afkapwaarde en membraanmateriaal. Daarom is deze maat probe samenstel heeft het voordeel dat voldoende flexibiliteit stoffen dialyseren in een brede molecuulgewichtsverdeling range. Hier introduceren we een microdialysesonde met een uitwisseling lengte van 2 mm, die van toepassing zijn voor microdialyse in muis en rat gebieden van de hersenen is. Echter, de afmetingen van de sonde kan gemakkelijk worden aangepast voor grotere uitwisseling lengtes voor gebruik in grotere dieren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microdialyse is een veelgebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek. Gedurende de laatste 50 jaar, heeft de minimaal invasieve microdialyse techniek voortdurend verbeterd om een ​​gevestigde methode om de lokale concentraties van kleine moleculair gewicht verbindingen controleren in de extracellulaire ruimte geworden. Bijna elke interstitiële weefselvocht onderzocht kan worden in vrij bewegende dieren.

Gaddum introduceerde de push-pull methode in 1960. Hij gemodificeerde benadering van Feldberg et al. Waarin tubocurarine werd geperfuseerd via een canule eindigt in het laterale ventrikel en het verzamelen van het effluent ook via een canule 1. Gaddum ontwikkelde de push-pull techniek waarbij een canule bestaat uit twee concentrische stalen naalden werd geïmplanteerd in verschillende hersengebieden en geperfuseerd met een oplossing toegevoegd terwijl tegelijkertijd het neurotransmitters vrijgelaten uit de neuronen rond de tip 2. Helaas, weefsel damage veroorzaakt door de canule om de tip beperkt de toepassing van deze methode. Als verdere ontwikkeling van deze werkwijze Bito en medewerkers werd een dialysezak werkwijze waarbij de verzamelde oplossing werd afgescheiden van het omringende weefsel door een dialysemembraan. Ze geïmplanteerd een dialyse sac in het onderhuidse weefsel van de hond nek. De inhoud van de dialysezak wordt eiwitvrij en kan vele weken later worden geanalyseerd ionen en aminozuren 3. De volgende ontwikkeling was de dialytrode, een primitieve microdialyse sonde werd oorspronkelijk beschreven door Delgado in 1972 4. Tenslotte Ungerstedt en collega verbeterd ontwerp van microdialysesonde zodat het kleiner en minder verplaatste weefsel 5.

Een concentrische microdialysesonde gedraagt ​​zich op dezelfde wijze als een bloed capillaire. Het systeem constant geperfundeerd door een oplossing die de ionische samenstelling van het omringende weefselvocht terwijl het niet de van belang zijnde analyt. The dialysemembraan blootgesteld aan de externe oplossing of weefsel semi-permeabel. Het maakt passieve diffusie van stoffen in de probe langs hun concentratiegradiënt 6. De permeabiliteit is afhankelijk van vele variabelen zoals moleculaire gewicht, vorm, lading en pH van de verbinding. Ook wordt beperkt door eigenschappen van het membraanmateriaal, poriegrootte van het membraan en de stroomsnelheid 7.

Figuren 1 en 2 tonen een concentrische microdialysesonde. De perfusievloeistof komt binnen via een inlaat slang in de metalen huls, die het kwartsglas omringt. Binnen in de metalen huls, dat stroomt langs de fused silica en laat het op zijn tip. In de ruimte tussen het dialysemembraan en polytetrafluorethyleen (PTFE) -tubing (bijvoorbeeld Teflon) de perfusievloeistof stroomt dan opwaarts. Hier, diffusie van stoffen uit het weefsel voordoet die het membraan omringen. Het dialysaat verlaat de sonde via de PTFE-buis, die is aangesloten op uitlaat slang en kan worden verzameld.

De microdialyse techniek heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere in vivo technieken. De probe vormt een fysieke barrière zodat het dialysaat bevat geen enzymen of cellen. Daarom is er geen behoefte aan zuivering van het eluaat vóór de analyse en niet enzymatische afbraak van analyten plaatsvindt. Oxidatieve afbraak kan optreden tijdens passage van analyten in de slang, maar kunnen vaak worden voorkomen door toevoeging van een antioxidans (bijvoorbeeld ascorbinezuur) aan het perfusaat. Alternatief oxidatieve beschadiging neuropeptiden bijvoorbeeld werd effectief onderdrukt door het vervangen van de uitlaat buis met een tip aan het dialysaat 8 verzamelen. Het dialysaat kan direct worden onderzocht met bijna elke vorm van analysemethode en meerdere analyten tegelijkertijd worden verzameld. Dit systeem kan worden gebruikt in wakkere dieren, en bijna alle hersenregio's kunnenonderzocht. Bovendien infusie van geneesmiddelen door de sonde mogelijk (retrodialyse). Er zijn echter ook beperkingen van de microdialyse. De ietwat lage tijdsresolutie niet real-time informatie te verstrekken met betrekking tot neurotransmitter veranderingen. Omdat het een invasieve techniek probe implantatie veroorzaakt chirurgisch trauma en anesthesie, die invloed neurotransmitter concentraties nodig tijdens deze stap 7,9,10.

De verbindingsconcentratie in het dialysaat uit slechts een kleine hoeveelheid van de feitelijke concentratie verbinding in de extracellulaire vloeistof. Voor de berekening van de onbekende concentratie van verbinding in de extracellulaire vloeistof, relatieve in vitro herstel worden berekend. Bepaling van afzonderlijke relatieve in vitro herstel voor elke probe en elke verbinding noodzakelijk alvorens de in vivo experiment. Hiervoor wordt de sonde ondergedompeld in een oplossing die hetanalyte van belang dat de perfusievloeistof is dezelfde oplossing zonder de analyt. Na de bepaling van verbindingsconcentraties in het dialysaat, deze gegevens moeten worden genoemd de concentratie in de omringende vloeistof. In vitro recovery-bepalingen uit meerdere stoffen tegelijk 9 worden uitgevoerd.

Veel neurowetenschappelijk onderzoek groepen gebruik maken van de microdialyse techniek om neurotransmitters en metabolieten in de extracellulaire ruimte van verschillende hersengebieden onderzoeken. Zo commerciële sondes zijn in grote vraag in de neurowetenschappen onderzoeksomgeving. Een groot voordeel van commercieel beschikbare probes is de hoge bedrijfszekerheid. De experimentele set-up voor commerciële sondes is goed ingeburgerd en gevalideerd voor vele bekende neurotransmitters en metabolieten. Echter, terwijl de handel verkrijgbare microdialyse apparatuur duur en minder toepassingsflexibiliteit 11, in eis werken microdialyse sonde samenstel wordt in detail kan worden aangepast aan elke applicatie en kan worden vervaardigd voor minder dan 10 $. Deze op maat gemaakte probe is een concentrische microdialysesonde getest voor onderzoeken in verschillende hersengebieden 8.

In vitro probe teruggevonden stoffen met verschillend molecuulgewicht (bereik van 100-1,600 Da) en met verschillende fysicochemische eigenschappen worden vergeleken. In vitro bepaling herstel van glucose, lactaat en acetylcholine met een molecuulgewicht lager dan 200 Da, ATP met een molecuulgewicht van ongeveer 500 Da en neuropeptiden angiotensine II, substantie P en somatostatine met een molecuulgewicht van meer dan 1000 Da is uitgevoerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiden van PTFE-buis

  1. Verkort PTFE-slang in 2,5 cm stuk. Gebruik een schaal papier om fysieke afmetingen te schatten. (Zie figuur 3a)
  2. Snijd één einde in een hoek te faciliteren aansluiten van outlet slang. (Zie figuur 3a)
  3. Opruwen PTFE-buizen door het gebruik van schuurpapier om hechtende van de epoxy lijm mogelijk te maken.

2. Voorbereiden Fused Silica

  1. Verkort fused silica in 2.25 cm stuk. (Zie figuur 3a)

3. Plaatsen van de Fused Silica in de PTFE-buis

  1. Plaats een 30 G canule in de holle PTFE vezels te doorboren op een afstand van 1 cm van het platte uiteinde. Buig de PTFE-buis om het proces te vereenvoudigen. (Zie figuur 3b)
  2. Plaats de gesmolten silica in de PTFE-slang met de canule als leidraad. (Zie figuur 3c)
  3. Verwijder voorzichtig de canule en zet de fused silica. (ZieFiguur 3d)
  4. De fused silica wordt verondersteld 5 mm aan het platte uiteinde uitsteken. (Zie figuur 3e)
  5. Lijm de fused silica in plaats op de prikplaats door cyanoacrylaat lijm en laat het dan verharden 's nachts. (Zie figuur 3e)

4. Voorbereiden van Epoxy Lijm (Twee Component Glue)

  1. Voeg 30 delen van gele verharder tot 70 delen van zwarte epoxy lijm met behulp van een fijne naald en meng voorzichtig. Het is direct klaar voor gebruik.

5. Toepassing van de Membrane (Alle verdere stappen moeten worden uitgevoerd onder de microscoop en een schaal papier wordt gebruikt voor het schatten Fysieke afmetingen)

  1. Trek de polysulfonmembraan voorzichtig over de fused silica, trek de membraan in de PTFE-buis en stel het membraan tot 5,5 mm met een scherp scalpel. (Zie figuur 3f)
  2. Stel een markeringspunt aan het membraan met een fijne pen om de uitwisseling lengte van 2 mm definiërenvanaf het einde van het membraan.
  3. Breng een kleine hoeveelheid epoxy lijm op het uiteinde van het membraan met behulp van een fijne naald. (Zie figuur 3g)
  4. Afsluiten van de verbinding tussen de dialyse membraan en PTFE vezels door hulp van dezelfde fijne naald gebruikt in stap 5.3) met epoxy lijm. (Zie figuur 3g)
  5. Voeg genoeg epoxylijm op het membraan tot het gemarkeerde punt uitwisseling lengte van 2 mm te waarborgen. Laat het uitharden 's nachts. (Zie figuur 3g) voor de bepaling van de wissellengte, het membraan 5,5 mm. Nadat de epoxy lijm op het membraan slechts 2 mm van het membraan is beschikbaar voor diffusie.

6. Toepassing van de metalen huls

  1. Snijd een 25 G naald in 1 cm metalen huls stukken door behulp van een tang buigen.
  2. Trek de 1 cm metalen huls (25 G) op het resterende deel van het kwartsglas. De metalen huls maakt later de aansluiting van de inlaatbuis met MICRODIAlysis probe. (Zie figuur 3h)
  3. Seal verbinding tussen metalen huls en PTFE-buis met de rest van epoxy lijm. Laat het uitharden ten minste 24 uur. (Zie figuur 3i)
  4. Het toepassen van hete lijm rond de splitsing van de sonde voor de extra fixatie en stabilisatie.
    OPMERKING: De inlaat inwendige volume van de sonde 0.045 gl en de uitlaat inwendig volume 2,5 ul. Daarom, met een stroomsnelheid van 1 pl / min, duurt het ongeveer 2,5 minuten na het aansluiten van de inlaatbuis voor de inning van het dialysaat te starten. Met het huidige protocol, de sonde montage procedure levert microdialyse probes die zijn 95% betrouwbaar.

7. Uitvoering van In Vitro Recovery Experiments

  1. Dompel de probe met een cut-off van 30 kDa en uitwisseling lengte van 2 mm in een voorraadoplossing bestaande uit aCSF bevattende 1 mM glucose en 1 mM lactaat en, in een afzonderlijk experiment in een CSF bevattende 100ATP nM en 100 nM acetylcholine.
  2. Perfuseren de probes met aCSF. Stel debiet 1 pl / min en voeren experimenten bij kamertemperatuur (22 ° C). Laat de probes equilibreren 1 uur in de voorraadoplossing en het verzamelen van de monsters iedere 30 min daarna en bewaar bij -80 ° C tot meting.
  3. Voor de berekening van de in vitro herstel, vergelijkt de concentratie van analyten in de dialysaten met bekende analytconcentraties in de voorraadoplossing. Resultaat als percentage van de concentratie stof in dialysaat vs. voorraad oplossing te uiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De concentrische maatwerk microdialysesonde bestaat uit een polysulfon membraan met een moleculaire cut-off van 30 kDa. De sonde samenstel is weergegeven in figuur 3.

Het vertoonde een in vitro herstel voor kleine energie metabolieten glucose (180,16 Da) en lactaat (112,06 Da) van 19,10 ± 1,2% en 21,2 ± 1,6%, respectievelijk. Voor de positief geladen acetylcholine met een molecuulgewicht van 181,66 Da, bleek een in vitro restwaarde van 22,6 ± 1,4%. ATP met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 3 toont een voorbeeld probe constructie. Juiste innerlijke en uiterlijke dimensies diameter hebben nauw worden waargenomen voor buis (OD 1,6 mm, ID 350 micrometer), fused silica (OD 105 micrometer; ID 40 micrometer) en dialyse membraan (OD 245 micrometer; ID 210 micrometer). Het is ook belangrijk om een ​​ruimte tussen membraan en gesmolten siliciumdioxide (105 um) en tussen membraan en leidingen (105 pm) en houden. Indien de waarden verschillen, kan de druk in de sonde omhoog en lekkage van het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Duitsland) dankbaar voor zijn ondersteuning en voor het verstrekken van de epoxylijm. Verder danken de auteurs Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Duitsland) voor het leveren van de Capillary Haemodiafilter FXCorDiax. Financiering werd verkregen van de Goethe Universiteit van Frankfurt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Epoxy lijmSunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Duitsland   
Fused silica ID 40 µm OD 105 µmZiemer-Chromatographie, Mannheim, DuitslandArt. Nr: 6.040105
Polysulfone membraan (hemodialysefilter FX Cor Diax 600)Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, DuitslandREF: F00001593
Cyanacrylaatlijm (Pattex® superlijm kunststof)Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Duitsland
TEFLON-buis 1,6 x 0,35 mmSunChrom® GmbH, Friedberg, DuitslandArt. Nr: 969-195.219
Schaarpje (Feather® Chirurgische Blad No. 10)pfm medical ag, Keulen, DuitslandArt. Nr: 07310
MicroscoopMEIJI Techno EMZ-8TR
30 G x 11" (0,3 x 25 mm) cannula  Sterican® ZB.Braun Melsungen AG, Melsungen, DuitslandREF: 9324500
25 G x 11/2" (0,5 x 40 mm) cannula 100 Sterican®B.Braun Melsungen AG, Melsungen, DuitslandREF: 9186166
Fijne pen (Stabilo point 88 fine 0,4)Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KGArt. Nr: 88/36
Hetelijm  (Lijmsticks ULTRA Power x 11 mm)Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, DuitslandArt. Nr: 4007841046910
Schuurpapier P60 230 x 280Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, DuitslandCatalogusnummer: 2608605397

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
  2. Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
  3. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  4. Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
  5. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
  6. Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
  7. Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  8. Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
  9. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1(2009).
  10. Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
  11. Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
  12. Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Custom Microdialysis ProbePolysulfone MembranePTFE TubingFused SilicaEpoxy GlueMetal SleeveIn Vitro RecoveryMolecular Weight CutoffExchange LengthNeuropeptide Detection

Gerelateerde artikelen