Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen

Samenvatting

Er wordt een methode gepresenteerd voor het oppervlaktespreiden van chromosomen uit knoppende gist. Deze methode is afgeleid van een methode die eerder werd beschreven door Loidl en Klein. Bovendien demonstreren we een procedure voor immunokleuring van gespreide chromosomen.

Samenvatting

De kleine omvang van kernen van de kiemende gist Saccharomyces cerevisiae beperkt het nut van lichtmicroscopie voor de analyse van de subnucleaire verdeling van chromatine-gebonden eiwitten. Oppervlakteverspreiding van gistkernen resulteert in uitbreiding van chromatine zonder verlies van gebonden eiwitten. Een methode voor oppervlakteverspreiding balanceert de fixatie van DNA-gebonden eiwitten met detergentbehandeling. De gedemonstreerde methode is licht gewijzigd ten opzichte van die beschreven door Josef Loidl en Franz Klein^1,2. De methode is gebruikt om de lokalisatie van veel chromatine-gebonden eiwitten in verschillende stadia van de mitotische celcyclus te karakteriseren, maar is vooral nuttig voor de studie van meiotische chromosoomstructuren zoals meiotische recombinosomen en het synaptonemale complex. We beschrijven ook een aanpassing die geen gebruik vereist van Lipsol, een eigenaardig detergent, dat in de oorspronkelijke procedure werd gevraagd, maar niet langer commercieel verkrijgbaar is. Een immunokleuringsprotocol dat compatibel is met de chromosoomverspreidingsmethode wordt ook beschreven.

Inleiding

De gist Saccharomyces cerevisiae biedt vele voordelen voor studies van moleculaire mechanismen van biologische processen, waaronder de studie van eiwitten die chromosoom functie regelen. Alhoewel er bekende voordelen van gist genetische, moleculaire en biochemische studies, is cytologisch onderzoek van de verdeling van eiwitten in de celkern gecompliceerd door zijn kleine omvang. De typische gist kern heeft een diameter van minder dan één micron, die slechts ongeveer 5 maal de resolutielimiet van zichtbaar licht. Aldus is de hoeveelheid informatie over de verdeling van nucleaire eiwitten die kunnen worden verkregen uit conventionele immunokleuring of door fluorescerend eiwit markeringen, zoals groen fluorescent eiwit (GFP), beperkt. Een nuttige benadering voor het karakteriseren van de subnucleaire verdeling van eiwitten chromosoom oppervlak verspreidt. Deze benadering omvat het verwijderen van de celwand, verstoren cellen en nucleaire membranen, enllowing de oplosbare inhoud van de kern om zich te vestigen op het oppervlak van een microscoopglaasje. De onoplosbare componenten omvatten nucleaire matrix en chromosomen. Naast het feit dat verwijdering van oplosbare nucleaire inhoud, die de mogelijkheid om chromatine gebonden eiwitten te detecteren verbetert, het chromosoom verspreiden methode resulteert in aanzienlijke decompressie van chromosomen zodat verspreiding nuclei diameter van ongeveer 3-5 urn (bij diploïde meiotische kernen) en 2-3 urn voor diploïde mitotische kernen. Gedecomprimeerd maakt detectie van nucleaire substructuur die relatief moeilijk of onmogelijk te lossen in intacte kernen.

Een duidelijke tekortkoming op chromosoom verspreiding is de mogelijkheid dat de verspreiding procedure geheel of gedeeltelijk kan verstoren de structuur van belang. Van bijzonder belang is dat een bepaald chromosoom gebonden eiwit als gevolg van het verspreidorgaan procedure verloren gaan. Deze potentiële complicatie should in gedachten worden gehouden bij het interpreteren van data. Een voorbeeld van een eiwit dat gevoelig is voor de verspreiding procedure beta-tubuline. Onder sommige omstandigheden, de spil, die hoofdzakelijk bestaat uit tubuline wordt behouden tijdens het verspreiden ^3. Visualisatie van de spil vaak nuttig om kernen plaats podium. Echter, visualiseren tubuline vereist behandeling met een hoge concentratie fixeermiddel; spillen verloren onder de hieronder beschreven standaardomstandigheden. Dit voorbeeld illustreert dat, wanneer de analyse van de verdeling van een eerder gekarakteriseerde proteïne, is het belangrijk om de concentratie fixeermiddel te bepalen hoe gevoelig het eiwit met deze wijziging te variëren. Ondanks de bezorgdheid over de gevolgen van het verspreidorgaan voorwaarden chromosoomstructuur is het nut en de kracht van het verspreidorgaan werkwijze aangetoond in vele contexten en heeft brede toepasbaarheid bij karakterisering van mitotische en meiotische cellen bijzonder ^4-7.

Two uitrijmethoden zijn uitgebreid gebruikt. De eerste van deze methoden ontwikkeld Dresser en Giroux ^8, vermijdt het gebruik van detergens en kan verspreiden preparaten die lijken relatief goed geconserveerd chromosoom morfologie na kleuring voor DNA-specifieke kleurstof DAPI verkregen. Deze methode is relatief moeilijk te perfectioneren en de kwaliteit van het smeersel kernen varieert sterk, wanneer een gebied van een objectglaasje wordt in vergelijking met andere gebieden. Dit probleem kan kwantitatieve benaderingen die gepaard beeldvorming van veel niet-geselecteerde kernen van de ene dia naar data-acquisitie vertekening te voorkomen compliceren. De tweede chromosoom verspreiden methode, ontwikkeld door Loidl en Klein ^1, gaat balanceren fixatie door paraformaldehyde, met lysis en chromatine decompressie gepromoot door een reinigingsmiddel. Wanneer goed uitgevoerd, deze methode geeft zeer reproduceerbare resultaten met minder regio tot regio verschillen ten opzichte van de Dresser en Giroux methode. Deze presentatie richt zich op een Modified van de methode van Klein Loidl en vanwege zijn betrouwbaarheid en eenvoud.

Chromosoom verspreiden is niet ingewikkeld of tijdrovend; tot 100 objectglaasjes kunnen worden voorbereid immunokleuring in één dag. Bovendien kan de verspreiding preparaten in de diepvries worden bewaard jaren voorafgaand aan immunokleuring en daarmee labs een repository van bevroren chromosoom spreads die kunnen worden gebruikt bij nieuwe biologische vragen rijzen of nieuwe kleurstoffen beschikbaar komen ontwikkelen.

De chromosoom dingswerkwijze wordt meestal gebruikt in combinatie met immunokleuring en groothoek fluorescentiemicroscopie, maar het is ook mogelijk om objectglaasjes voor superresolutie lichtmicroscopische werkwijzen zoals gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie bereiden.

Protocol

OPMERKING: Enkele stappen van het protocol hieronder vereisen werken in een schone zuurkast. Bovendien vereist de werkwijze een gist viertal dissectie microscoop uitgerust met een 10X objectief lange werkende afstand spheroplasting controleren. De microscoop moet worden ingesteld in de komende tijd kap. Verwijder de micromanipulator arm en plaat houder van het toepassingsgebied en plaats deze items op een veilige plaats uit de buurt van het werkgebied.

1. Bereiding van Sferoplasten

1. Grow gist onder gewenste omstandigheden. Met ongeveer 2 x 10 ⁸ cellen voor elk monster, bijvoorbeeld 4 ml van een kweek bij OD600 = 1,4 5 x 10 ⁷ cellen / ml. Hoewel directe verwerking van de monsters bij voorkeur in sommige gevallen kan, voor de meeste toepassingen, cel monsters kunnen worden opgeslagen op ijs gedurende maximaal 8 uur alvorens te worden verwerkt.
2. Overdracht celsuspensie aan een 15 ml centrifugebuis en draaien in een klinische centrifuge bij stand 5 (2345 rpm / 857,5 x g) gedurende 3 minuten om de cellen te pelleteren.
3. Giet het medium verzorgen niet om cellen te verliezen van de pellet. Voorzichtig resuspendeer de cellen in 1 ml ZK buffer en voeg 40 ul 1 M dithiothreitol (DTT). Incubeer 2 min met voorzichtig mengen. Pellet cellen als voorheen (zie stap 1.2).
4. Resuspendeer pellets in 1 ml ZK buffer. Voeg 5 ul van een vers bereide oplossing van zymolyase 100T die grondig gemengd. Incubeer 20-30 minuten bij 30 ° C om de celwand te verwijderen en sferoplasten.
5. Assay Een 10 ul druppel celsuspensie op een microscoopglaasje te bepalen of spheroplasting voltooid. Cellen bekeken onder de microscoop dissectie zonder dekglaasje. De cellen moeten opgeblazen en rond in plaats van iets langwerpige verschijnen en moet lyseren na toevoeging van 20 ul van water. Indien cellen niet lyseren, het monster tot 30 ° C en opnieuw assay elke 10 minuten totdat het water veroorzaakte lysis gemakkelijk wordt waargenomen. Pellet cellen als voorheen (zie stap 1.2).
6. Voorzichtig mengen en wassen celpellet in 2,5 ml koud MES / sorbitol buffer. Pellet cellen als voorheen (zie stap 1.2). Voorzichtig resuspendeer celpellet in 300-400 ul koude MES / sorbitol buffer. Cellen kunnen worden bewaard op ijs in dit stadium enkele uren.

2. Chromosome Spreading

LET OP: De glazen oppervlakken waarop chromosomen wordt gespreid-ofwel dia's of dekglaasjes-moeten van tevoren worden voorbereid. Elke dia of dekglaasje worden ondergedompeld in water, daarna EtOH, daarna laten drogen en gepolijst met lenspapier. Als chromosomen zal worden verspreid op dekglaasjes, moet het dekglaasje worden aangebracht op een dia met Scotch tape of rubber cement. Tenzij anders vermeld, wordt de rest van het protocol beschreven verspreiding op hetzij een objectglaasje of dekglaasje

1. Met behulp van een pipet P20 Pipetteer 20 ul celsuspensie op het oppervlak van een schoon objectglas.
2. Met behulp van een P200 pipet, voeg 40 ul van de 3% PFA / sucrose-oplossing en meng de solution door "wervelende" de dia met de hand tot Schlieren lijnen verdwijnen. Plaats de dia onder de microscoop en bevestigen dat cellen in focus. De PFA oplossing dient vers bereid in de zuurkast op de dag van gebruik.
   Opmerking: Als het eiwit van belang niet door de werkwijze eerder onderzocht, is het raadzaam om extra slides via oplossingen die 2 en 4% PFA bevat om te bepalen of retentie van het eiwit gevoelig voor fixatie omstandigheden bereiden. Een 4% PFA / sucrose oplossing wordt gebruikt wanneer het gewenst is geassocieerd tubuline microtubuli zichtbaar is. Het nadeel van de hogere concentratie fixeermiddel dat de chromosomen worden "underspread," 2% PFA beoogt ook "underspread" chromosomen geven.
3. Met behulp van een pipet P200, voeg 80 ul van 1% Lipsol, wervelen zoals voorheen oplossingen te mengen zo volledig mogelijk, start een timer. Als Lipsol niet beschikbaar is, kan 80 pi 1% NP40 of 80 ul dH ₂ O zijnvervangen (zie Representatieve resultaten, figuur 2).
4. Kijk naar de cellen zorgvuldig en voorzichtig wervelen de schuif om de 15 sec. Bij ongeveer 80% van de cellen zijn gelyseerd (verdwenen) stopt de timer, onmiddellijk verwijderen van de dia uit de microscoop, voeg 80 ul van PFA / sucrose-oplossing en krul te mengen. Lysis optreedt van tussen 30 en 90 seconden na het starten van de timer.
   OPMERKING: Als er meerdere slides zien lysis op ongeveer hetzelfde moment, kan men uiteindelijk weglaten microscopische controle voor de rest van de dia's en gewoon zorgvuldig tijd dat de periode tussen toevoeging van lipsol en de toevoeging van de laatste portie van fixatief. Echter, deze korte cut is alleen betrouwbaar bij het voorbereiden van meerdere dia's van hetzelfde monster. Het beste is om te controleren lysis van elk monster microscopisch wanneer verschillende dia's worden bereid uit monsters genomen op verschillende tijdstippen of uit verschillende culturen.
5. Plaats de dia op een schone vlakke ondergrond en de verspreiding van de vloeistof over het gehele unfrosted surface van de slede via de zijkant van een schone, wegwerpbare pipet Weiland onder de meniscus van de "puddle", maar boven het oppervlak van de schuif zelf, dwz bij. geen 'rake' het oppervlak van de slede met de pipet. Heeft pipet op verschillende dia niet opnieuw om verontreiniging van monsters te voorkomen.
6. Laat de dia's om 's nachts te drogen in de zuurkast. Onoplosbare nucleaire componenten zullen vestigen op de dia oppervlak en binden aan het. Voor grote experimenten, de planning van het gebruik van de ruimte voor het drogen stap is belangrijk.
7. Eenmaal gedroogd worden de beste resultaten verkregen door ontwikkelen tot het stadium immunokleuring op dezelfde dag. De gedroogde sacharoseoplossing sluit de spreiding chromosomen in een "honing" dat bevriezing monsters toelaat: slides kunnen worden overgebracht naar een plastic dia doos en bewaard bij -20 ° C gedurende jaren.

3. Immunokleuring

1. Dip dia's in 0,2% Foto-Flo voor 30 sec. om honing te verwijderen. Lean dia's opeen rand, de rand die op een papieren handdoek om resterende foto-Flo verwijderen.
2. Dip dia's in 1x TBS gedurende 5 minuten om zich te wassen. Verwijder overtollige vloeistof door te leunen dia's op een rand, maar laat ze niet uitdrogen.
3. Leg slides matte kant naar boven, pipet 300 ul TBS / BSA op de dia over de unfrosted deel van de dia.
4. Incubeer in een vochtige kamer bij RT gedurende 15 min. (Grote plastic container vol met water verzadigd papieren handdoeken onder een geperforeerde metalen plaat of plastic dia doos met verzadigd papieren handdoeken).
5. Afvoer dia door te rusten van een korte zijde van de dia op een papieren handdoek en leunend de dia tegen een passende ondersteuning (zoals een reageerbuis rack). Sta niet toe dat oppervlak drogen.
6. Onmiddellijk toepassen 80 ul van TBS / BSA-buffer met de juiste verdunning van primair antilichaam. Als antilichaam wordt beperkt, gebruik 40 ul en 22 x 22 mm dekglaasje. Voor ruwe konijn serum, is dit meestal tussen een 1/50 en 1/500 verdunning.
   LET OP:Voer titraties voor nieuwe antilichaam preparaten. De meeste verdunde voorbereiding die een hoge signaal boven de achtergrond oplevert wordt gekozen. Om te controleren voor het niveau van achtergrondkleuring dient kernen worden bereid uit de geschikte deletie mutant stam en / of dubbele objectglaasjes worden gekleurd met pre-immuun serum.
7. Plaats een gepolijst 22 x 50 mm dekglaasje op de dia vermijden bubbels. Doe dit door het houden van de dekglaasje tussen duim en wijsvinger langs de lange zijde op de posities in de buurt van een korte zijde. Houd het dekglaasje op een 30 ° hoek ten opzichte van glijden, de korte zijde het verst van de vingers omlaag tot deze op de slede net binnen de rand van de "plas" het dichtst bij de matte gebied van de schuif. Dan langzaam lager de dekglaasje in een vloeiende beweging tot de vingers die de dia contact met de bank, en dan los. Probeer niet om de positie van de dekglaasje aan te passen zodra het landt.
   OPMERKING: Als chromosoom spreads werden opgesteld opaangebracht dekglaasjes (in plaats van rechtstreeks op het oppervlak van slides), wordt dit monster dekglaasje blijft bevestigd aan de slede gehele kleuring en wasstappen. Een extra dekglaasje wordt bovenaan het monster dekglaasje gelijkmatig de antilichaamoplossing verdelen geplaatst tijdens kleuring en vervolgens weggegooid.
8. Plaats de glaasjes in een gesloten vochtige kamer en incubeer overnacht bij 4 ° C.
9. Houd de matte rand overdracht van de dia's om een ​​glasplaatje vlekken rek en onder te dompelen in een kleuring pot met TBS.
10. Voorzichtig dip de schuif omhoog en omlaag om het dekglaasje verwijderen. Probeer te veel kracht te gebruiken om dit te doen. Was de dia's 2x 10 min door onderdompeling in TBS. Verwijder dia's van rack en afvoer overtollige vloeistof door het aanraken van rand tot papieren handdoek. Laat niet oppervlak droog.
11. Werken onder gedempt licht, onmiddellijk aan toevoegen 80 ul TBS / BSA met een 1/1000-voudige verdunning van fluorochroom geconjugeerd secundair antilichaam (of 40 pi met een 22 x 22 mm dekglaasje). Advertentied dekglaasje als hiervoor en incuberen bij 4 ° C gedurende 2 uur in de vochtige kamer in het donker.
12. Verwijder dekglaasjes zoals eerder, afvoer slides, en laat het oppervlak drogen gedurende 1-2 uur in het donker. Lean slides op keukenpapier als voorheen.
    LET OP: Als het verspreiden werd uitgevoerd op een dekglaasje gemonteerd, los het dekglaasje van de glijbaan voor het drogen. Coverslips worden dan gedroogd zoals beschreven voor objectglaasjes in de vorige stap.
13. Werken onder gedempt licht, voeg ongeveer 30 ul van montage medium met DAPI (drie 10 ul druppels) en vervolgens voorzichtig zakken een dekglaasje. Als de spreads op dekglaasjes, plaatst de druppels montage medium op een schoon dia en laat het dekglaasje, chromosoom naar beneden, op de glijbaan.
14. Nog steeds onder gedempt licht, wacht 2 min voor dekglaasje om zich te vestigen en te verzegelen randen van dekglaasje met duidelijke nagellak. Plaats de dia's in een platte glijbaan doos.
    OPMERKING: Voor STED microscopie, monteren met ProLong Gold. Gebruik 30 pi ProLong Goldzonder DAPI en laat 's nachts te genezen. Afdichten met nagellak is overbodig.
15. Bekijk slides door groothoek epifluorescentiemicroscopie met een 40 of 100x objectief met een filter geschikt instellen voor DAPI te concentreren. Eventueel slaan de schuif in het donker bij 4 ° C gedurende enkele weken. Niet invriezen.

Resultaten

Het uiterlijk van de spread kernen kritisch afhankelijk van de balans tussen chromosoom fixatie en de-verdichting. Zelfs wanneer de reagentia goed in evenwicht kan variatie in de mate van de-chromosoom verdichting plaatsvinden in verschillende gebieden van hetzelfde glas en / of tussen verschillende dia. Daarom moet de kwaliteit van de spreads in een bepaalde regio van een dia worden beoordeeld voordat beelden worden geïnterpreteerd.

De effecten van "een vleugel" en "underspre...

Discussie

Het verschijnen van verspreide kernen hangt cruciaal af van de balans tussen fixatie en lysis/detergensbehandeling. Zoals hierboven besproken, vereist de bewaring van verschillende cellulaire structuren het gebruik van verschillende PFA-concentraties. Voor de meeste eiwitten is 3% PFA optimaal. Echter, bewaring van spindles vereist het gebruik van 4% PFA. Zelfs met een enkele set reagentia, kan het tijdstip van lysis ten opzichte van fixatie ook de kwaliteit van de verspreide kernen beïnvloeden. Voor de meest consiste...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Zymolyase	US Biological	Z1004	Bereid een oplossing van 20 mg/mL in 50 mM Tris pH 7,5 aangevuld met 2% glucose. Bereid vers voor elke experiment en bewaar bij 4°C totdat het klaar is voor gebruik.
Lipsol	L.I.P. Ltd	niet langer commercieel verkrijgbaar	Bereid een 1% (v/v) oplossing in water. Bewaar op ijs.
NP-40	USB	19628	Bereid een 1% (v/v) oplossing in water. Bewaar op ijs.
Tween 20	Sigma	P2287
Glijmiddel	Corning	2948-75x25
Standaard dekglas	Fisher	12-544-E of 12-540-B
Hoge resolutie dekglazen	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 oplossing	Kodak	P-7417	Bereid een 0,2% (v/v) oplossing in water.
TBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Bereid een 1% (w/v) oplossing in TBS. Bewaar bij 4°C tot een maand.
Primaire antistof
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antilichaam
Vectashield montagemedium met DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Kunststof diabox	Fisher	03-448-1	Bewaar dia's met gedroogde verspreidingen in sleuven bij -20°C. Gebruik ook als natte kamer.
Karton diabox	Fisher	12-587-10	Gebruik om gemakkelijk gekleurde/verzegelde dia's te vervoeren of bewaar bij 4°C.
Coplin pot	Fisher	08-816	Gebruik als wasbak voor dia's.