Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen

Samenvatting

Er wordt een methode gepresenteerd voor het oppervlaktespreiden van chromosomen uit knoppende gist. Deze methode is afgeleid van een methode die eerder werd beschreven door Loidl en Klein. Bovendien demonstreren we een procedure voor immunokleuring van gespreide chromosomen.

Samenvatting

De kleine omvang van kernen van de kiemende gist Saccharomyces cerevisiae beperkt het nut van lichtmicroscopie voor de analyse van de subnucleaire verdeling van chromatine-gebonden eiwitten. Oppervlakteverspreiding van gistkernen resulteert in uitbreiding van chromatine zonder verlies van gebonden eiwitten. Een methode voor oppervlakteverspreiding balanceert de fixatie van DNA-gebonden eiwitten met detergentbehandeling. De gedemonstreerde methode is licht gewijzigd ten opzichte van die beschreven door Josef Loidl en Franz Klein^1,2. De methode is gebruikt om de lokalisatie van veel chromatine-gebonden eiwitten in verschillende stadia van de mitotische celcyclus te karakteriseren, maar is vooral nuttig voor de studie van meiotische chromosoomstructuren zoals meiotische recombinosomen en het synaptonemale complex. We beschrijven ook een aanpassing die geen gebruik vereist van Lipsol, een eigenaardig detergent, dat in de oorspronkelijke procedure werd gevraagd, maar niet langer commercieel verkrijgbaar is. Een immunokleuringsprotocol dat compatibel is met de chromosoomverspreidingsmethode wordt ook beschreven.

Inleiding

De gist Saccharomyces cerevisiae biedt vele voordelen voor studies van moleculaire mechanismen van biologische processen, waaronder de studie van eiwitten die chromosoom functie regelen. Alhoewel er bekende voordelen van gist genetische, moleculaire en biochemische studies, is cytologisch onderzoek van de verdeling van eiwitten in de celkern gecompliceerd door zijn kleine omvang. De typische gist kern heeft een diameter van minder dan één micron, die slechts ongeveer 5 maal de resolutielimiet van zichtbaar licht. Aldus is de hoeveelheid informatie over de verdeling van nucleaire eiwitten die kunnen worden verkregen uit conventionele immunokleuring of door fl....

Protocol

OPMERKING: Enkele stappen van het protocol hieronder vereisen werken in een schone zuurkast. Bovendien vereist de werkwijze een gist viertal dissectie microscoop uitgerust met een 10X objectief lange werkende afstand spheroplasting controleren. De microscoop moet worden ingesteld in de komende tijd kap. Verwijder de micromanipulator arm en plaat houder van het toepassingsgebied en plaats deze items op een veilige plaats uit de buurt van het werkgebied.

1. Bereiding van Sferoplasten

1. Grow gist onder gewenste omstandigheden. Met ongeveer 2 x 10 ⁸ cellen voor elk monster, bijvoorbeeld 4 ml van een kweek bij OD600 = 1,4 5....

Resultaten

Het uiterlijk van de spread kernen kritisch afhankelijk van de balans tussen chromosoom fixatie en de-verdichting. Zelfs wanneer de reagentia goed in evenwicht kan variatie in de mate van de-chromosoom verdichting plaatsvinden in verschillende gebieden van hetzelfde glas en / of tussen verschillende dia. Daarom moet de kwaliteit van de spreads in een bepaalde regio van een dia worden beoordeeld voordat beelden worden geïnterpreteerd.

De effecten van "een vleugel" en "underspre.......

Discussie

Het verschijnen van verspreide kernen hangt cruciaal af van de balans tussen fixatie en lysis/detergensbehandeling. Zoals hierboven besproken, vereist de bewaring van verschillende cellulaire structuren het gebruik van verschillende PFA-concentraties. Voor de meeste eiwitten is 3% PFA optimaal. Echter, bewaring van spindles vereist het gebruik van 4% PFA. Zelfs met een enkele set reagentia, kan het tijdstip van lysis ten opzichte van fixatie ook de kwaliteit van de verspreide kernen beïnvloeden. Voor de meest consiste.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Zymolyase	US Biological	Z1004	Bereid een oplossing van 20 mg/mL in 50 mM Tris pH 7,5 aangevuld met 2% glucose. Bereid vers voor elke experiment en bewaar bij 4°C totdat het klaar is voor gebruik.
Lipsol	L.I.P. Ltd	niet langer commercieel verkrijgbaar	Bereid een 1% (v/v) oplossing in water. Bewaar op ijs.
NP-40	USB	19628	Bereid een 1% (v/v) oplossing in water. Bewaar op ijs.
Tween 20	Sigma	P2287
Glijmiddel	Corning	2948-75x25
Standaard dekglas	Fisher	12-544-E of 12-540-B
Hoge resolutie dekglazen	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 oplossing	Kodak	P-7417	Bereid een 0,2% (v/v) oplossing in water.
TBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Bereid een 1% (w/v) oplossing in TBS. Bewaar bij 4°C tot een maand.
Primaire antistof
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antilichaam
Vectashield montagemedium met DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Kunststof diabox	Fisher	03-448-1	Bewaar dia's met gedroogde verspreidingen in sleuven bij -20°C. Gebruik ook als natte kamer.
Karton diabox	Fisher	12-587-10	Gebruik om gemakkelijk gekleurde/verzegelde dia's te vervoeren of bewaar bij 4°C.
Coplin pot	Fisher	08-816	Gebruik als wasbak voor dia's.