Een 3D Human longweefsel Model voor functionele studies op<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infectie

Samenvatting

Tuberculose-infectie bij de mens is een complex proces, dat moeilijk te modelleren is in vitro. Hier beschrijven we een nieuw 3D-model van menselijk longweefsel dat de dynamische processen nabootst die tijdens infectie optreden, inclusief de migratie van immuuncellen en vroege granuloomvorming in een fysiologische omgeving.

Samenvatting

Tuberculose (tbc) heeft nog steeds een grote bedreiging voor de gezondheid van mensen over de hele wereld, en er is behoefte aan kostenefficiënte, maar betrouwbare modellen om ons te helpen begrijpen van de ziekte mechanismen en vooraf de ontdekkingen van nieuwe behandelingsmogelijkheden. In vitro celculturen van monolagen of co-culturen missen de driedimensionale (3D) milieu en weefselreacties. Hierin beschrijven we een innovatief in vitro model van een menselijk longweefsel, die belofte houdt om een doeltreffend instrument voor het bestuderen van de complexe gebeurtenissen die zich voordoen tijdens infectie met Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) zijn. De 3D weefselmodel uit weefselspecifieke epitheelcellen en fibroblasten die gekweekt in een matrix van collageen op een poreus membraan. Bij blootstelling aan lucht, de epitheelcellen stratify en scheiden slijm aan de apicale kant. Door de invoering van humane primaire macrofagen geïnfecteerd met M. tuberculose het weefsel model, hebben we aangetoond dat immune cellen migreren in het geïnfecteerde weefsel en vorm beginfase van TB granuloom. Deze structuren recapituleren de kenmerkende eigenschap van de menselijke TB, het granuloom, die fundamenteel anders is of niet vaak waargenomen bij veel gebruikt experimentele diermodellen. Dit organotypische cultuur methode maakt het mogelijk 3D-visualisatie en robuuste kwantitatieve analyse die cruciale informatie over ruimtelijke en temporele kenmerken van de gastheercel-pathogeen interacties biedt. Samen genomen, het longweefsel model biedt een fysiologisch relevante tissue micro-omgeving voor onderzoek naar tbc. Zo, het longweefsel model heeft mogelijke gevolgen voor zowel eenvoudige mechanistische en toegepast onderzoek. Belangrijk is dat het model maakt toevoeging of manipulatie van afzonderlijke celsoorten, dat daardoor verbreedt het gebruik ervan voor het modelleren van diverse infectieziekten die de longen beïnvloeden.

Inleiding

Bij de mens, reacties op infectie, weefsel ontsteking, cellulaire rekrutering, tissue remodelling en de regulering van het weefsel homeostase zijn complex evenementen waarbij verschillende celtypen. Daarom zijn deze werkwijzen best bestudeerd in het plaatselijke weefsel milieu. Eerder dit is vooral mogelijk zijn met behulp van experimentele diermodellen. De gebruikte proefdieren vasthouden vele grenzen vaak reageren pathogenen op een andere manier dan de mens en ook een ander ziekteverloop ¹ weergegeven. Een in vitro menselijk longweefsel model heeft de mogelijkheid om immuunresponsen in de menselijke longen te bestuderen.

Human tuberculose-infectie (TB) is hoofdzakelijk een ziekte van de longen. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), de verwekker van tuberculose, de longen via aerosol druppels die worden getransporteerd naar de alveolaire ruimte, waarbij de bacteriën worden overspoeld door pulmonaire dendri bereikttic cellen en alveolaire macrofagen als onderdeel van het aangeboren immuunreactie op de infectie ^2,3. Fagocytose van de ziekteverwekker leidt tot de compartimentering van de bug binnen een phagosome en idealiter resulteert in de neutralisatie en het doden van de ziekteverwekker door de fagocyt. Tot 50% van de personen blootgesteld aan M. tuberculose verondersteld kunnen de infectie te doen verdwijnen door het aangeboren immuunrespons ^4. Andere resultaten van infectie goedkeuring van het adaptieve immuunsysteem in een later stadium, latente infectie of in het ergste geval chronische actieve ziekte ^5.

Eerder is er geen in vitro weefsel modellen zijn geweest voor studies van de menselijke tuberculose. Enkele cel, humane macrofagen of andere perifere bloedcellen zijn vaak gebruikt ^6,7. Het nadeel van deze benadering is dat zij de dynamiek van verschillende celtypen samenwerkend in longweefsel blootgesteld aan M. kan reflecteren tuberculose . Er is dus behoefte aan een in vitro model te kunnen functionele en mechanistische onderzoeken op tuberculose. De cel-gebaseerde in vitro menselijk longweefsel model hier beschreven werd oorspronkelijk opgericht door onze groep voor studies op dendritische cel functies ^8. We hebben deze methode voor de studie van TB aangepast.

Het menselijk longweefsel hier gepresenteerde model bestaat uit weefselspecifieke epitheelcellen en fibroblasten ^8. Deze cellen worden gekweekt in een matrix van collageen op een poreus membraan in een transwell inzetstuk en vormstructuren lijkt normaal menselijk longweefsel (figuur 1). Wanneer ze worden blootgesteld aan de lucht de cellen beginnen te slijm afscheiden aan de apicale kant ^8. Door het implanteren van humane primaire macrofagen geïnfecteerd met M. tuberculose het model hebben we gezien hoe de immune cellen migreren in het weefsel en vorm beginfase van TB granulomen ^9. Dit is het eerste model van menselijk weefsel described TB en het vormt een veelbelovend hulpmiddel om aangeboren immuunresponsen TB en andere ziekten van de long. Tot nu toe hebben we alleen monocyten en macrofagen als immuuncellen in het model, maar de complexiteit kan worden vergroot door toevoeging van aanvullende relevante celtypen.

Figuur 1. Schematisch overzicht van het longweefsel model. (A) Het model bestaat uit humane long-specifieke epitheelcellen, M. tuberculosis geïnfecteerde primaire macrofagen en rode kleurstof gemerkte monocyten gezaaid op collageen ingebed fibroblasten voorbereid op een Transwell filter. Blootstelling van het weefsel model om de lucht initieert de productie van extracellulaire matrix eiwitten, slijmafscheiding en stratificatie van het epitheel. De 3D-weefsel-model dus ontwikkeld is een nuttig instrument om M. te studeren tuberculose-infectie in een omgeving die clodichtbevolkt lijkt op een menselijke long. (B) Representatieve microscopische beelden van de verschillende stappen in de bereiding van de weefselmodel. (C) Complete structuur van de weefselsectie longmodel. Schaal -. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Opmerking: menselijke perifeer bloed van gezonde bloeddonoren anonieme gekocht bij de bloedbank van Linköping University Hospital, Zweden werd gebruikt als de bron van immuuncellen voor deze studie. Dit protocol is geschikt voor 24 mm 6-wells plaat inserts. Directe aanpassing aan de andere goed formaten wordt niet aanbevolen, aangezien het weefsel modelcontracten zowel verticaal als horizontaal tijdens de ontwikkeling.

1. Voorbereiding van Materialen, Media en Cultuur van Bacteriën / cellijnen

1. Cultuur van bacteriën:
   1. Groeien de mycobacteriële stam M. tuberculosis H37Rv die het pFPV2 plasmide constitutief green fluorescent protein (GFP), in Middlebrook 7H9 medium dat 0,05% Tween-80, 0,5% glycerol, kanamycine (20 gg / ml), aangevuld met Middlebrook albumine, dextrose en catalase verrijking ( Middlebrook ADC Enrichment), bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 7-10 dagen.
      Opmerking: Alle experimentele staps waarbij live-virulente M. tuberculose stammen moeten worden uitgevoerd in een BSL-3 faciliteit.
2. Bereid 1x Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) compleet medium (aangevuld met 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10 mM HEPES, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren en 10 % hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS)). Bereid ook antibiotica-vrij DMEM compleet medium.
3. Bereid 1x Minimum Essential Medium (MEM) volledig medium (1 mM natrium-pyruvaat, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10 mM HEPES, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren en 10% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS)).
4. Bereiding van fibronectine / met collageen beklede flessen (totaal 10 ml):
   1. Pipetteer 8,8 ml 1x steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een schone buis. Voeg 1 ml runderserumalbumine (1 mg / ml), 100 ui type I Rundercollageen (3 mg / ml) en 100 gl recombinant human fibronectine (1 mg / ml).
   2. Meng de oplossing door de buis kop 5 keer. Kolven worden bekleed met fibronectine / collageenoplossing (1 ml van een T-25 en 2 ml van een T-75 kolf). Laat het O / N bij 37 ° C. Na incubatie Verwijder de oplossing en bewaar het beklede kolven bij kamertemperatuur.
      Opmerking: De verzamelde oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C en opnieuw driemaal. Opslag langer dan 2 weken kan de vloeistof bruine (kristalvorming), waarbij erop moet worden weggegooid draaien.
5. Cultuur van fibroblasten:
   1. Kweken en onderhouden MRC-5 (een menselijke long fibroblast cellijn afgeleid van normaal longweefsel van een 14-weken oude mannelijke foetus), volledig DMEM in 5% _CO2 bij 37 ° C. Gebruik de fibroblasten op passages 24-26 en groeien tot 70-80% confluent.
      Opmerking: MRC-5-cellijn bij doorgang> 30 hebben de neiging om de morfologie te verliezen en wordt niet aanbevolen voor gebruik in het weefsel model.
6. Kweken van epitheelcellen:
   1. Verkrijgen 16HBE14o- (16HBE), een onsterfelijke humane bronchiale epitheel cellijn dat de gedifferentieerde morfologie en functie van het normale menselijke luchtwegen epitheel behoudt, (dit was een gift van Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco , ^{USA. 10).} 16HBE cellen in kweek fibronectine / collageen gecoate kolven en behouden de cellen volledig MEM ​​in 5% _CO2 bij 37 ° C.
7. Bereiding van 5x DMEM
   1. Bereid 5x DMEM door het oplossen van 13,4 g poeder DMEM en 3,7 g natriumbicarbonaat in 150 ml steriel gedistilleerd water. Breng de pH van het medium tot 7,3, vul aan tot 200 ml en filteren met behulp van 0,22 pm membraanfilter. Verzamel de gefiltreerde medium in een steriele houder en tot gebruik opgeslagen bij kamertemperatuur.

2. Bereiding van collageen-ingebedde fibroblasten

1. Ontdooi ingevroren aliquots van FBS en L-glutamine in een 37 ° C waterbad.Na het ontdooien houden de monsters op ijs. Plaats Natriumbicarbonaat (71,2 mg / ml) en gentamycine (50 mg / ml) bij 4 ° C. Pre-cool 50 ml centrifugebuizen en 10 ml steriel pipetten tot 4 ° C.
   Opmerking: Alle gebruikte materialen (met uitzondering van de 5x DMEM) worden gekoeld op ijs voorafgaand aan het gebruik en alle stappen worden uitgevoerd op het ijs. Type I collageen (1,1 mg / ml) moeten koud bewaard worden, aangezien dit voorkomt stolling van collageen.
2. Bereid de fibroblast cellen:
   1. Warm Trypsine in een 37 ° C waterbad en incubeer voldoende hoeveelheid met longfibroblasten (MRC-5) cellen gedurende 10 minuten bij 5% _CO2 bij 37 ° C. Neutraliseren van de trypsine door het toevoegen 1x DMEM compleet. Zuig de celsuspensie en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 min. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen bij 2,3 x 10 ⁵ cellen / ml in DMEM compleet. Plaats de cellen op ijs tot aan gebruik.
3. Bereid het voormengsel:
   1. De volgende aan een buis gemerkt "voormengsel"; 395pl 5x DMEM, 40 pi L-Glutamine, 120 pl NaHCO3 (71,2 mg / ml), 440 ui FBS, 5 gl gentamicine (50 mg / ml), totale volume 1000 pi, dan swirl het voormengsel goed en op ijs.
      Opmerking: De opgegeven volumes zijn voor een 24 mm 6-well cultuur insert. Bereken het nodig is voor het totale aantal inserts specifieke bedragen, maar voeg een extra om zeker te zijn, is genoeg pre-mix voorbereid.
4. Bereid de acellulaire collageen mengsel:
   1. Om elke cultuur voeg 1 ml acellulair collageen mengsel. De volgende aan een 50-ml conische buis op ijs in de aangegeven volgorde; 686 pl 1,1 mg / ml collageen, 250 ul Pre-mix en 64 pl 1x compleet DMEM tot een totaal volume van 1000 ui. Meng de oplossing goed zodat er geen luchtbellen. Werk snel en voeg het collageen van de wand van de buis om luchtbellen te voorkomen.
   2. Voeg 1 ml van de acellulaire laag mengsel aan het inzetstuk geplaatst in 6 wells plaat. Gebruik geen medium niet toe te voegen aan de put buiten het insert. Incubate gedurende 30 min in een 37 ° C incubator. Zorg ervoor dat de acellulaire mengsel omvat het gehele insert zonder luchtbellen.
5. Bereid de cellulaire collageen mengsel:
   1. Meng componenten van de cellaag in een 50 ml conische buis op ijs gehouden in deze volgorde; 2 ml Collageen, 615 ul Pre-mix, 58 ul van 1x volledige DMEM en 327 ul celsuspensie longfibroblasten (MRC-5) te maken van het totale volume tot 3000 ul. Elke cultuur vereist 3 ml van cellulaire collageen mengsel.
      Kritische stap: Zorg ervoor dat het collageen en premix meng zorgvuldig vóór toevoeging van de celsuspensie. Dit zal de pH van het collageen te neutraliseren toxische effecten op de fibroblasten voorkomen.
   2. Voeg de cellaag (3 ml) boven op de acellulaire collageenlaag en incubeer gedurende 2 uur in een 37 ° C incubator. Werk snel en voeg het collageen van de wand van de buis om luchtbellen te voorkomen.
   3. Na polymerisatie, voeg 2 ml DMEM compleet aan tHij bodem van de 6 wells plaat (onder de insert) en incubeer 24 uur.
      OPMERKING: Als polymerisatie deed zich niet, gooi de plaat inzetstukken die de fibroblast-collageen matrix en start opnieuw. De meest waarschijnlijke oorzaak is een onjuiste toevoeging of onjuiste volume van een van de bovengenoemde reagentia.

3. Continu Cultuur van de fibroblast-collageen Matrix

1. Til het inzetstuk met een schone pincet en zuig het kweekmedium van de bodem van de put. Voeg 2 ml compleet DMEM naar de bodem van de put, gevolgd door 2 ml compleet DMEM binnen het inzetstuk. Voorkomen dat er luchtbellen onder het inzetstuk, zoals dit voorkomt de diffusie van nutriënten tussen de buitenste en binnenste kamers. Verwijder luchtbellen met een micropipet tip.
2. Veranderen van de cultuur media (binnen en onder de insert) elke tweede dag en cultuur voor ongeveer 5-7 dagen. Wees voorzichtig bij het verwijderen van het materiaal uit de insert. Om te voorkomen dat Contact met de fibroblast-collageenmatrix, enigszins schuin de insert met een schone pincet en zuig de media uit de insert muren.
   Kritische stap: De fibroblasten in het collageen matrix moet een langgerekte fenotype te krijgen, en de vorm van de collageen, die vervolgens contracten. In ongeveer 5-7 dagen is de matrix tegenover een platform (10-14 mm in diameter) in het midden van het inzetstuk vormen. De gecontracteerde matrix is ​​klaar voor gebruik in de volgende stap. Om een ​​gelijkmatige contractie van de matrix is ​​het kritisch dat het verkrijgen fibroblasten goed vermengd met het collageen uit te zaaien (stap 2.6.1).

4. Het zaaien van immuuncellen (Infected / Uninfected monocyten-macrofagen Mengsel)

Opmerking: De volgende experimentele werk betrekken virulente mycobacteriën en moet daarom in een BSL-3 faciliteit worden uitgevoerd.

1. Bereiding van primaire monocyten en macrofagen:
   1. Isoleer perifere bloed monocyten uit donorbloed met behulp van een establischuur protocol. Isoleer monocyten op dezelfde dag als het instellen van de weefselmodel en cultuur en differentiëren ze in macrofagen ongeveer 7 dagen vóór infectie met M. tuberculose.
      NB: Dit zal zorgen voor zowel de macrofagen en de gecontracteerde fibroblast-collageenmatrix zijn beschikbaar na 7 dagen. Isoleren ook verse monocyten die samen met de besmette macrofagen worden toegevoegd.
2. Bereiding van M. tuberculosis geïnfecteerde macrofagen
   1. Oogst de gekweekte bacteriën, wassen met 1x PBS met 0,05% Tween-80, resuspendeer in antibiotica-vrij compleet DMEM, passeren een afgeknotte steriele 27 G naald om bacteriële klonten verspreiden en meet de optische dichtheid.
      Let op: Pre-bepalen de M. tuberculose kolonievormende eenheid equivalenten optische dichtheid in het laboratorium. Dit geeft een schatting van het aantal bacteriën te gebruiken voor infectie.
   2. Incubeer de macrofagen gedurende 4 uur bij M. tuberculose bij de multipliciteit van infectie (MOI) 10). Na infectie, 3x wassen met 1x PBS aan het extracellulaire bacteriën te verwijderen. Gebruik geïnfecteerde macrofagen gekweekt op dezelfde manier, maar zonder M. tuberculose, als controles.
   3. Maak de macrofagen van de kweekplaat door behandeling met 2 mM EDTA gedurende 10 min bij 37 ° C geresuspendeerd en de cellen in antibioticumvrij compleet DMEM.
3. Etikettering van monocyten
   Opmerking: Isolatie en kenmerken van monocyten worden uitgevoerd in de BSL-2 bank vervolgens in BSL-3 eenheid voor verdere verwerking genomen.
   1. Stain vers bereide monocyten (2 x 10 ⁷ cellen) met een uiteindelijke concentratie van 2 pM PKH26 rode kleurstof gedurende 5 minuten, volgens de instructies van de fabrikant. Was 3x en resuspendeer de cellen met antibioticumvrij compleet DMEM bij een dichtheid van 1 x 10 ⁷ cellen / ml.
4. Toevoeging van immuuncellen fibroblastachtige collageenmatrix
   1. EENN a 5-7 dagen kweken van de fibroblast collageen matrix, zuig het kweekmedium van de buitenste en binnenste kamers en voeg 1,5 ml vers antibiotica-vrij DMEM compleet de buitenkamer.
   2. Bereid een gemerkte monocyt-macrofaag (geïnfecteerde / geïnfecteerd) mengsel met een verhouding van MO: MQ (5: 1) in 50 gl DMEM compleet. 50.000 macrofagen, neem 250.000 bestempeld monocyten.
   3. Voeg 50 ul MO: MQ mengsel aan de fibroblast collageen matrix en incubeer 1 uur in 5% _CO2 bij 37 ° C. Na incubatie voorzichtig voeg 2 ml kweekmedium in het inzetstuk en incubeer gedurende nog 24 uur in 5% _CO2 bij 37 ° C.
      Opmerking: Als de cellen toegevoegd losjes bevestigd, moet toevoeging van media langzaam door voorzichtig toevoegen van op de wanden van het inzetstuk.

5. Het zaaien van longepitheelcellen (16HBE)

Opmerking: De volgende stappen moeten in een BSL-3 faciliteit worden uitgevoerd.

1. Zaad long epithelial cellen (16HBE) bovenop de MO: MQ-fibroblast collageen laag. Om dit te doen, eerst dissociëren 16HBE cellen uit de kolf door behandeling met trypsine (zoals in 2.2.1.) En resuspendeer in 4 x 10 ⁶ cellen / ml in een antibiotisch-vrij DMEM.
2. Zuig het kweekmedium binnen en buiten het inzetstuk. Voeg vervolgens 1,5 ml antibiotica-vrij DMEM compleet in de bodem van de put buiten het inzetstuk.
3. Voeg 50 ul van 16HBE bovenop de immuuncel-fibroblast collageen matrix. Laat gedurende 2 min in de kap en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C incubator met 5% CO _2. Na incubatie voeg voorzichtig 2 ml antibiotica-vrij DMEM volledig in het inzetstuk en kweek bij 37 ° C gedurende 3 dagen. De cultuur stap vergemakkelijkt de proliferatie van epitheelcellen in het weefsel model.
   Opmerking: Als de cellen toegevoegd losjes bevestigd, moet toevoeging van media langzaam en zacht door schuiven door de wanden van het inzetstuk.

6. Air-blootstelling van de 3D-LungModel

Let op: Na dag 5 na toevoeging van geïnfecteerde macrofagen, het weefsel modellen zijn voorzien van blootgesteld en de volgende stappen moeten in een BSL-3 faciliteit worden uitgevoerd.

1. Zuig het kweekmedium binnen en buiten het inzetstuk.
   Opmerking: In deze stap kan supernatanten worden verzameld voor de detectie van uitgescheiden factoren. Centrifuge, steriel filter en bewaar supernatanten bij -70 ° C.
2. Voeg 1,8 ml antibiotica-vrij DMEM compleet in de buitenkamer en incubeer in 5% _CO2 bij 37 ° C incubator gedurende 2 dagen. Heeft cultuur media niet binnen de insert toe te voegen.
   OPMERKING: Air-opheffing van het weefsel model vergemakkelijkt de vorming van gelaagde epitheel en slijm afscheiding, die de kracht om het weefsel en fysiologische gelijkenis met de menselijke longweefsel biedt.

7. oogsten en monteren van de 3D-Lung Tissue Model

Opmerking: De volgende stappen moeten in een BSL-3 faciliteit worden uitgevoerd.

1. Op dag 7 na implantatie van geïnfecteerde macrofagen, het weefsel modellen klaar zijn voor de oogst. Verwijder het kweekmedium volledig uit het weefsel model. Bevestig het weefsel model met 4% paraformaldehyde gedurende 30 min in het donker bij kamertemperatuur. Deze stap doodt de bacteriën en fixeert het weefsel / celmorfologie voor verdere verwerking.
2. Met behulp van een scalpel, scheiden de membraan uit de put insert. Breng het membraan dat het weefsel naar een putje met 1x PBS.
3. Snijd en verwijder de zijkanten van het weefsel-model met een schone scalpel. Snijd het weefsel model in 4 ongeveer gelijke vierkante stukken. Transfer van een stukje weefsel op een superfrost glasplaatje. Bewaar de weefselstukken in 1x PBS bij 4 ° C.
4. Droog het weefsel gedurende 5 minuten en monteer met ProLong Gold antifade met DAPI en dekglaasje. Laat de dia's zonder verstoring in het donker bij kamertemperatuur tot het droog is.
   Opmerking: De dikte van het weefsel kan variëren tussen centrum en periferie, waardoor geringe tilting van het dekglaasje. Om dit te voorkomen, kan een afstandhouder (bijvoorbeeld parafilm) op de hoek van de dekglas worden geplaatst.
5. Toepassing nagellak aan de randen van het dekglaasje en laat ze drogen. Dompel de glaasjes in 70% ethanol om ze veilig uit de BSL-3 mogelijkheid tot stand te brengen.

8. Visualisatie, Acquisitie en Kwantitatieve Analyse 3D

1. Visualiseren weefselobjectglaasjes behulp van een confocale microscoop systeem laser die emitteert bij 488 nm voor excitatie van GFP (groen kanaal), 420 nm voor DAPI (blauw) en 555 nm voor de PKH26-gemerkte monocyten (rood) resp.
2. Acquire 3D beelden met een resolutie van 512x512 Z-stacks die ten minste 20 urn dikte en met 1 - 1,5 urn scheiding tussen stapels. Verwerven van 5-10 verschillende gebieden die de hele stukje weefsel.
   Let op: Gebruik de configuratie zoals Nyqvist voor optimale instellingen van de optische resolutie (golflengte, laservermogen / belichting, pixelgrootte en zoom). Vermijd under of boven de verzadiging van pixels.
3. Analyseer de confocale beelden met 3D-beeld processing software. Voor 3D kwantificering van celgroepen, worden de volgende stappen aanbevolen voor optimale analyse.
4. Open het 3D-beeld processing software en laden van de afbeelding. Meet de afmetingen van objecten in het beeld te analyseren, bijvoorbeeld de grootte van een kern, individuele monocyten en enkele bacteriën. Deze waarnemingen zijn bruikbaar voor het definiëren of het filteren van de voorwerpen.
5. Met behulp van een aanpassing van de weergave tool, optimaliseren volume rendering door het aanpassen van elk kanaal voor het contrast, de helderheid en mix ondoorzichtigheid. Deze stap is om de storing van ruis in volumerendering minimaliseren.
   Opmerking: Gamma correctie kan leiden tot manipulatie van afbeeldingen en derhalve moeten worden vermeden.
6. Maak oppervlakken door te kiezen voor het rode kanaal (monocyten) en stel de drempel (automatische of handmatige selectie). Zonodig wordt filters om de selectie van rode monocyten beperking of the b sluitenackground. Evenzo maakt oppervlakken groen (M. tuberculosis) en blauw (kernen) kanalen zoals hierboven beschreven.
7. De gegevens in Ms-Excel-bestanden te exporteren. Het is mogelijk om een ​​bepaalde parameter of alle gegevens te exporteren. De parameters die voor de analyse van cellen clustering zijn volume, intensiteit, aantal objecten, aantal voxels en bolvormigheid.
8. Opslaan en de afbeeldingen te exporteren in een geschikt beeldformaat bij voorkeur TIFF.
   OPMERKING: Animaties kunnen ook worden gemaakt met behulp van de animatie menu en opgeslagen als een mediabestand.
9. Sla de analyse instellingen van elk kanaal met de optie parameters toevoegen en kan later op te halen met behulp van de Rebuild functie. Tegelijkertijd analyseren meer bestanden met behulp van de batch processing tool.
   Opmerking: Alle beelden te vergelijken worden verworven, verwerkt en op dezelfde wijze geanalyseerd. Bijvoorbeeld een 8 bit image (256 integer) niet moeten worden vergeleken een 12 bit image (4096 integer) met.

Resultaten

Een 3D longweefsel model voor humane tuberculose kan effectief worden gebruikt om het gastheer-pathogeen interacties in M. bestuderen tuberculose-infectie. De basisstappen van deze werkwijze worden representatieve microscopische beelden van verschillende stappen en een totale microscopische structuur van een weefselsectie geschetst in figuur 1. Het model heeft verschillende bestanddelen van menselijke longweefsel, zoals longfibroblasten, bronchiale epitheelcellen en primaire monocyten / macrofagen ingebed in het 3D weefselomgeving. Naast de integratie van onderdelen van het menselijk longweefsel, het model lijkt op fysiologische omstandigheden namelijk stratificatie van epitheel en slijm afscheiding.

Een voorbeeld voor het gebruik van het longweefsel model bij de controle een tuberculose-infectie is weergegeven in figuur 2. Voor het visualiseren van de M. tuberculose immuun cel migratie en interactie, we macrofagen besmet met M. geïntroduceerd tuberculose dat GFP uitdrukken(groen) samen met vers geïsoleerde PKH26-gemerkte monocyten (rood) in de weefselmodel (blauw DAPI gekleurd voor kernen). Op dag 7 na toevoeging van M. tuberculosis geïnfecteerde cellen aan de weefselmodel, confocale microscopie onthult clusters van rode monocyten op de plaats van infectie (groen) (figuur 2), die de letsels kenmerk van menselijke tuberculose ⁹ nabootst.

Een reeks van representatieve beelden voor 3D-visualisatie van M. tuberculosis geïnfecteerde weefselmodel en kwantificatie van celgroepen is weergegeven in figuur 3. De 3D-visualisatie geeft de gebruiker de flexibiliteit om te communiceren, te onderzoeken en te kwantificeren verschillende functies in een 3D-beeld. De ruimtelijke rangschikking van groene en rode bacteriën monocyt clusters blijkt uit de apicale, rotatie en zijaanzicht zoals afgebeeld in figuur 3B, die clustering van monocyten onthult op de plaats van M. tuberculose. De clusters niet obgepresenteerd in geïnfecteerde weefsels (Figuur 3A). We gekwantificeerd de grootte en het aantal monocyten celgroepen en vond dat de grootte (volume) van celgroepen verbeterd (p <0,001), terwijl het aantal individuele monocyten verminderde (p <0,01) in M. tuberculosis geïnfecteerde weefsels in vergelijking met niet-geïnfecteerde weefselmodellen (Figuur 3C en 3D). Deze gegevens bevestigt onze eerdere bevindingen van de vroege vorming van granuloma in M. tuberculose-infectie waargenomen in longweefsel modellen in 2D coupes ⁹ geanalyseerd.

Onze gegevens suggereren dat het weefsel model zorgt voor een natuurlijke 3D leefomgeving te onderzoeken het complex gastheer cel-M. tuberculose communicatienetwerk. We vonden ook dat 3D visualisatie en kwantitatieve analyse zijn betere instrumenten voor het bestuderen van de eigenschappen van het weefsel type (figuur 3). Kwantificering van een cel cluster (granuloom bijvoorbeeld) vaak stretc hes verschillende cellagen en kan volledig worden opgevangen door een 3D kwantitatieve analyse. Bovendien visualisatie van nauwkeurige ruimtelijke en temporele kenmerken van afzonderlijke cellen of bacteriën in het model dat de levende-imaging, migratie en tracking studies in een aangewezen laboratorium.

Figuur 2. Monocyt in het weefsel model cluster rond virulente M. tuberculose. Vertegenwoordiger confocale beelden van geïnfecteerde en M. tuberculose besmet weefsel model wordt gepresenteerd. Panelen van groen (M. tuberculose- GFP), rood (PKH26-label monocyten), blauw (DAPI gekleurd kernen) en samengevoegd kanalen tonen de werving van monocyten in het geïnfecteerde weefsel in vergelijking met niet-geïnfecteerde weefsels. Scale - 100 urn.large.jpg "style =" font-size: 14px; line-height: 28px; "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. 3D visualisatie en kwantitatieve analyse van het weefsel model bruikbare informatie. Vertegenwoordiger beelden van 3D-visualisatie van het hele weefsel model (A) niet-geïnfecteerde weefsel (B) die besmet zijn met M. tuberculose, door middel van optische sectie met behulp van Zeiss LSM700 confocale microscoop en kwantitatieve analyse door Imaris image processing software (versie 7.6.8). Deze beelden werden verkregen bij 20X vergroting 14 z-stacks die een weefsel dikte van 19,5 urn met 1,5 urn interval, zodat de visualisatie van apicale, rotatie horizontaal, rotatie verticaal en zijaanzicht (A en B). (C) Quantitative analyse van monocyten celgroepen onthullen verbeterd (p <0,0001) omvang van granuloma vroege clusters na M. tuberculose in vergelijking met geen besmetting. (D) Kwantificering van het aantal monocyten daalden (p <0,01) in geïnfecteerd weefsel in vergelijking met niet-geïnfecteerde weefsel herhalen meer clusters in het geïnfecteerde weefsel. Green - M. tuberculose GFP, Rood - PKH26-gelabelde monocyten, Blue - celkernen, Schaal -. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het vermogen om georganiseerde celclusters te rekruteren en te vormen op de plaats van infectie is het kenmerk van menselijke tuberculose ¹¹. Deze dynamische structuren, bekend als tuberkelgranulomen, bestaan voornamelijk uit immuuncellen (macrofagen, monocyten, T-cellen en B-cellen) en multinucleaire gigantische cellen die M. tuberculosis omringen. De rol van het granuloma werd lange tijd gezien als het afschermen van de infectie, om lokale verspreiding van bacteriën te voorkomen. Recentere studies tonen echter aan dat granulomavorming essentieel is voor de vroege overleving, groei en verspreiding van bacteriën ¹². Een strategie van nieuwe studies is om moleculen of paden te identificeren die efficiënt kunnen worden aangesproken om de cellulaire migratie bij granulomavorming en/of tuberculoseverspreiding te remmen.

Een beperking voor nieuwe studies over tuberculose is het ontbreken van modellen die menselijke tuberculose nabootsen. De meest gebruikte experimentele dieren vormen geen echte granuloma bij M. tuberculosis-infectie en zijn daarom niet geschikt voor tuberculosestudies ^13-16. Niet-menselijke primaten hebben de grootste gelijkenis met menselijke tuberculose ¹⁷, maar zijn niet de voorkeurskeuze vanwege hoge operationele kosten en ethische kwesties. Menselijke tuberculose is een complex immunologisch proces en is moeilijk te modelleren in vitro. Celculturen van monolagen of co-culturen missen de 3D-omgeving en weefselresponsen. Daarom hebben we een innovatief longweefselmodel ontwikkeld op basis van menselijke primaire immuuncellen en menselijke longspecifieke cellijnen ^8,9. Het model vertoont karakteristieke kenmerken van menselijk longweefsel, inclusief epitheel met gelijkmatig geïntegreerde macrofagen, vorming van extracellulaire matrix, gelaagd epitheel en slijmafscheiding ⁹.

Het 3D-menselijke longweefselmodel heeft verschillende voordelen boven de in vitro enkele of co-culturen gezaaid op weefselkweekplaten of transwell-inzetstukken. Ten eerste worden de menselijke longspecifieke cellen (fibroblasten en epitheelcellen) niet vaak opgenomen in de in vitro enkele of co-culturen. Ten tweede zijn de immuuncellen en longspecifieke cellen ingebed in een 3D fysiologische context (collageenrijke extracellulaire matrixproducten). De reactie van cellen op een stimulus/infectie en het migratiegedrag van cellen, bijvoorbeeld de vorming van een granuloma, verschilt significant tussen een 2D en 3D omgeving. Bovendien maakt de beschreven methode 3D-visualisatie en robuuste 3D-kwantitatieve analyse mogelijk die cruciale informatie geeft over ruimtelijke verdeling en complexe cellulaire interacties.

Experimentele infectie in het modelweefsel met M. tuberculosis resulteerde in clustervorming van macrofagen op de plaats van infectie, wat doet denken aan een vroeg TB-granuloom (Figuur 2 en 3). We hebben onlangs aangetoond dat mutante stammen die defect zijn in het vermogen om de virulentiefactor ESAT-6 af te scheiden of Mycobacterium bovis BCG dat ESAT-6 mist, de clustervorming van monocyten niet induceerden (geen vroeg granuloma), in tegenstelling tot de virulente M. tuberculosis ⁹. Deze gegevens zijn consistent met de waarnemingen van Mycobacterium marinum-geïnfecteerde zebravisembryo's, waarvan de transparantie elegante live-beelden van granulomavorming mogelijk maakt ¹². Aangezien er geen gouden standaardmodel voor tuberculose is, hebben we gebruik gemaakt van chirurgisch verwijderde weefselbiopsies van tuberculosepatiënten voor validatie van de methode ⁹. Ons in vitro weefselmodel vertoont verschillende kenmerken met de long- en lymfeklierbiopsies van tuberculosepatiënten, inclusief de aggregatie van macrofagen in granuloma, de aanwezigheid van zowel intra- als extracellulaire bacteriën ¹⁸ en inductie van necrose ¹¹.

Hoewel het beschreven model fysiologische relevantie heeft voor menselijke tuberculose en verschillende voordelen heeft ten opzichte van andere in vitro modellen, heeft het enkele beperkingen. Bijvoorbeeld, van de meer dan 20 collageeneiwitten die bij mensen zijn geïdentificeerd, is alleen type I opgenomen in het model om de extracellulaire matrix na te bootsen. Type I collageen is echter een complex mengsel van extracellulaire matrixproducten en is het meest voorkomende collageen in het menselijk lichaam. Verder hebben we de aanwezigheid van collageen IV en verschillende extracellulaire matrixeiwitten zoals tropoelastin, vimentin en laminine aangetoond, die door de epitheelcellen en fibroblasten in het weefselmodel worden geproduceerd, wat duidt op de synthese van nieuw collageen ⁸. Momenteel heeft het longweefselmodel alleen monocyten en macrofagen, naast longspecifieke cellen. Het mist neutrofielen en lymfocyten die ook bekend zijn als aanwezig in het granuloma. Opmerkelijk is dat het model niet beperkt is tot de introductie van aanvullende immuuncellen en het is interessant om te onderzoeken hoe ze bijdragen aan de complexe cellulaire interacties bij menselijke tuberculose. Implantatie van primaire alveolaire macrofagen, huidspecifieke cellen en longcarcinoomcellen is al getest in het model. Aangezien ons doel was om een model te gebruiken dat nauw verwant is aan menselijke tuberculose, is de introductie van muizencellen niet geprobeerd.

Kortom, het longweefselmodel heeft implicaties voor zowel fundamentele mechanistische als toegepaste studies. Potentiële toepassingen van het longmodel omvatten de studie van aangeboren immuniteit, onderzoek naar mechanistische aspecten van gastheerverdedigingen zoals fagosomale rijping, autofagie, productie van cytokinen, chemokinen en antimicrobiële peptiden, en functionele karakterisering van individuele celtypen. Opvallend is dat het in vitro weefselmodel manipulatie van een of meer celtypen toestaat en een relevant weefselmicro-omgeving biedt, niet alleen voor studies over tuberculose, maar voor een verscheidenheid aan infectieuze en niet-infectieuze ziekten die de longen aantasten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cell culture inserts	BD Falcon	353092
6-well culture plates	BD Falcon	353046
MRC-5 cells, lung fibroblasts			ATCC#CCL-171
16HBE cells, lung epithelial cells			Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA
5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM)	Gibco	12800-082	Gemaakt van poeder maar voeg 5 keer minder water toe. Pas pH aan tot 7,3 en filter het met een 0,2 µm filter.
Dulbecco’s modified Eagle’s medium met glucose (DMEM) 1x	Gibco	41965-039
Minimum Essential Medium (MEM) 1x met Earle’s zouten	Sigma	M4655
Non-Essential Amino Acids Solution, 100x	Life Technologies	11140-035
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-024
Sodium Pyruvate	Life Technologies	11360-039
NaHCO3 (71,2 mg/ml)			Bereidt in huis
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106	Heat geïnactiveerd gedurende 30 min, 56 °C
Gentamicin (50 mg/ml)	Gibco	15750-060
Hepes buffer oplossing 1M	Gibco	15630-056
Penicilline Streptomycine (Pen Strep)	Gibco	15140-122
Lymphoprep	Axis-Shield	7801
Ultrapuur 0,5 M EDTA	Gibco	15575
Bovine Collageen PA behandeld (500 ml)	Organogenesis	200-055
Pure col gezuiverde boviene Collageen oplossing (100 ml)	Advanced biomatrix	5005-B
Extracellulair matrix eiwit, Fibronectine (1 mg)	BD	354008
Primary human monocytes/macrophages			Geïsoleerd uit menselijk volbloed of buffy coats.
PKH26 Red fluorescent cell linker	Sigma	MINI26
Mycobacterium tuberculosis H37Rv die groen fluorescent eiwit tot expressie brengt			M. tuberculosis H37Rv wild type werd getransformeerd met de pFPV2 plasmid die constitutief GFP tot expressie brengt.
Middlebrook 7H9 medium	Difco	271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment	BBL	211887
Tween-80
Glycerol
Kanamycin B sulfaat (20 µg/ml)	Sigma	B5264
Prolong Gold anti=-fade reagens met DAPI	Invitrogen	P36935
Trypsin -EDTA
Bovine serum albumine
Paraformaldehyde
DAPI
LSM700 Confocal microscoop	Zeiss
iMaris Scientific 3D/4D beeldverwerkingssoftware, versie 7.6.8	Bitplane AG