Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening

Summary

Fosforylering van eiwitten is een centrale eigenschap van hoe cellen informatie in hun extracellulaire milieu interpreteren en hierop reageren. Hier presenteren we een hoogdoorlaatscreeningprotocol met behulp van kinasen gezuiverd uit zoogdiercellen om snel kinasen te identificeren die een substraat(s) van belang fosforyleren.

Abstract

We hebben een screeningsplatform dedicated humane eiwitkinasen gefosforyleerd identificeren substraten die kunnen worden gebruikt om nieuwe signaaltransductieroutes ophelderen ontwikkeld. Onze aanpak biedt het gebruik van een bibliotheek van gezuiverde GST-gelabeld humaan proteïne kinasen en een recombinant eiwit substraat plaats. We hebben gebruik gemaakt van deze technologie MAP / microtubule-affiniteit regulerende kinase 2 (MARK2) identificeren als de kinase voor glucose gereguleerde plaats op CREB Regulated Transciptie coactivator 2 (CRTC2), een eiwit dat nodig is voor betaceldeling, alsmede de Axl familie van tyrosinekinasen als regulatoren van cel metastase door fosforylering van de adapter eiwit ELMO. We beschrijven deze technologie en te bespreken hoe het kan helpen om een ​​uitgebreide kaart van hoe cellen reageren op prikkels uit de omgeving vast te stellen.

Introduction

Protein post-translationele modificaties (PTMs) zijn essentieel voor intracellulaire communicatie. Misschien is het beste bestudeerd van PTMs is fosforylering gekatalyseerd door proteïne kinases, die een groot aantal eiwit functies, waaronder hun biochemische activiteit, subcellulaire lokalisatie, conformatie, stabiliteit en reguleren. De identificatie van fosforyleringsplaatsen op doeleiwitten kan door tryptische fosfopeptidekartering of nu standaard proteomische technieken waarbij monsters verrijkt gefosforyleerde peptides ^1,2. Terwijl driekwart van het tot expressie proteoom verwachting worden gefosforyleerd ³ en een geïdentificeerde 200.000 fosforyleringslocaties ^5, met schattingen tot 1 miljoen ^6, veel van deze geen toegewezen biologie, signaalweg of proteïne kinase.

Terwijl de identificatie van gefosforyleerd sites is relatief eenvoudig, een relatief grotere uitdaging is omidentificeren van de verwante kinase (s) die deze plaatsen gericht een werkwijze we noemen mapping kinase: substraat paren. Verschillende benaderingen voor het identificeren van kinase: substraat paren zijn beschreven, beginnend met een kinase van belang zijn en op zoek naar de substraten of het starten met een substraat van belang en een poging om een modificerend kinase experimenteel ^11/07 of computationeel ¹² te vinden. Om kinases een bekende gefosforyleerd substraat identificeren, kan bioinformatica worden gebruikt om eiwitten die een korte geconserveerde sequentie van aminozuren aan weerszijden van de gefosforyleerde residu (de consensus plaatse), alsook het identificeren van kinasen die een bezinkbare complex met het substraat bevat te identificeren. Echter, deze methoden zijn tijdrovend en vaak niet met succes bekroond.

We ontwikkelden een systematische functionele benadering om snel kinasen die een bepaald substraat ¹³ kan fosforyleren identificeren. Het scherm test produceert uitstekende specifieketeit, met een zeer duidelijke keuze voor potentiële verwante kinases. Gezien de centrale plaats van fosforylering biologische signalering, het scherm is nuttig voor ontdekking in nagenoeg alle cellen signaalroutes ^14-16. Het scherm omvat het uitvoeren van een grootschalig kinase assay met een bibliotheek van menselijk eiwit kinasen. De kinasen zijn gelabeld met bacteriële glutathion S-transferase (GST) eiwit worden gezuiverd uit zoogdiercellen celextracten, hetgeen betekent dat de recombinante enzymen - anders dan die bereid uit bacteriën - gegenereerd in aanwezigheid van het stroomopwaartse eiwit kinasen vaak nodig voor het recombinante enzymen activiteit in vitro. Inderdaad, terwijl serine, threonine en tyrosine kinase-activiteit vereist voor downstream kinase activatie aanwezig in gist ¹⁰ zijn, de gist genoom codeert 122 proteïnekinasen, wat aangeeft dat het zoogdier kinome, meer dan 500 genen ¹⁷ is geworden aanzienlijk complexer om regulaTÉ de processen die uniek zijn voor hogere orde organismen. Bovendien kan het effect van verschillende stimuli voor celbiologie en menselijke ziekten (bijvoorbeeld kleine moleculen, groeifactoren, hormonen, enz.) Worden gebruikt om relevante ^14,15 moduleren kinaseactiviteit in een geschikte omgeving.

Protocol

1. Voorbereiding van de reagentia, platen, en cellen

1. Voeg 500 ml lysis buffer: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-glycerofosfaat, 5% glycerol. Bewaar bij 4 ° C. Onmiddellijk vóór gebruik, voeg 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), en 1 mM natriumvanadaat. Na deze stap wordt PMSF niet vereist in spoelbuffer.
2. Maak 20 ml van 10x kinase buffer: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-glycerofosfaat (FW 216), 2 mM natriumvanadaat. Aliquot in 1 ml buizen en bewaar bij -20 ° C. Onmiddellijk vóór gebruik, voeg 5 mM DTT.
3. Maak 20 ml van 10x M-ATP buffer: 300 uM adenosine trifosfaat (ATP), 66 mM _MgCl2, 33 mM MnCl _2. Aliquot in 1 ml buizen en bewaar bij -20 ° C.
4. Voeg 100 ml 2x natriumdodecylsulfaat (SDS) lysis buffer: 1,5 g Tris-base, 20 ml glycerol, 30 ml _H2O Lossen en de pH op 6,8 met HCl. Voeg 40ml 10% SDS, het volume aanpassen tot 100 ml. Voeg 25 mg broomfenolblauw.
5. Spot 4 pl 25 ng / pl zoogdierlijke expressieplasmide dat codeert voor een GST-kinase ¹⁴ per putje in sets van 96 well platen en platen label dienovereenkomstig. Verbinding en bevriezen platen bij -20 ° C tot gebruik.
6. 1-2 dagen voor transfectie, kweek HEK293T cellen in compleet Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica in een 37 ° C incubator aangevuld met CO ₂ (laatste 5%). Passage met trypsine en niet toestaan ​​dat de voorraad tot> 80% confluent worden tijdens expansie. Een minimum van 6 x 10 ⁷ cellen voor het scherm (ongeveer 3 x 15 cm schalen van HEK293T cellen bij 80% confluentie).

2. Transfectie

Opmerking: zie figuur 1 een stroomdiagram van complete protocol.

1. Als platen met kinase plasmiden zijn bevroren, ontdooien bij kamertemperatuur eennd centrifugeren bij 1900 xg gedurende 3 min om eventueel vocht te verzamelen op de bodem van putjes.
2. Meng 8,6 ml gereduceerd serum medium (bijv OPTI-MEM) met 312,7 pl lipide-gebaseerde transfectie reagens. Laat zitten voor 5 min.
3. Voeg 10 ul gereduceerd serum medium aan elk putje met behulp van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een klein volume cassette.
4. Voeg 10 ul per putje van de gereduceerde serum medium / transfectiereagens mengsel uit stap 2.2 onder toepassing van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een klein volume cassette. Laat zitten voor 20 tot 45 min.
5. Resuspendeer 293T cellen op 7,5 x 10 ⁵ cellen / ml in 80 ml ​​compleet DMEM. Voeg 100 ul celsuspensie (bijvoorbeeld 7,5 x 10 ⁴ cellen) per putje met behulp van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een standaardvolume cassette.
6. Controle putjes onder microscoop voor gelijkmatige celverdeling en terugkeren naar incubator gedurende 24 uur.

3. GST-kinase Pulldown

1. Maak fresh: 4 mM pervanadaat oplossing door het mengen van 60 ui van 0,2 M natrium vanadaat met 540 ui _H2O In een tweede buis mix 2,7 pl 30% peroxide en 1,4 ml PBS. Voeg de twee oplossingen bij elkaar en laat zitten voor 15 min voor gebruik.
2. Met behulp van een multichannel pipet (geen geautomatiseerde vloeistof dispenser gebruiken omdat dit zorgt voor te veel turbulentie in de put) afzien 2 pl 0,25 M _CaCl2 in elk putje, gevolgd door 2,5 pi van het bereid in stap 3.1 pervanadaat. Incubeer elke plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten en plaats op ijs.
3. Bereid 35 ml lysisbuffer door het toevoegen van DTT, PMSF en natriumvanadaat zoals aangegeven in artikel 1 (Voorbereiding van de reagentia).
4. Houden platen op ijs, verwijder medium uit elk putje met een stofzuiger aspirator. Voeg onmiddellijk 50 ul / putje ijskoude lysisbuffer behulp van een automatische vloeistof dispenser uitgerust met een standaard cassette. Laat zitten 30 min op ijs Lyse (optioneel: kan hier indien nodig stoppen door verzegeling plate en bewaren bij -80 ° C. Om door te gaan, dooi platen op ijs).
5. Spin platen bij 1900 g gedurende 3 min bij 4 ° C.
6. Schrapen cellen van elk putje met behulp van een multichannel pipet en de overdracht van alle inhoud op de juiste wijze gemerkt V-bodem met 96 putjes. Spin platen bij 1900 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
7. Tijdens rotatie, vul glutathion beklede platen (één voor elke 96-well plaat) met 100 ul / putje ijskoude lysisbuffer (zonder PMSF) als spoeling. Houd platen op ijs.
8. Verwijder V-bodemplaten van de centrifuge. Een voor een, keren de glutathion platen over een wastafel te schudden uit de lysisbuffer en vlek op een papieren handdoek. Transfer lysisbuffer van de V-bodemplaten met glutathion platen door het kantelen van de plaat en met een multichannel pipet voorzichtig om de pellet te verstoren onderaan. Afdekplaten en laat op ijs voor minimaal 2 uur te binden.
9. Dicht bij het einde van de 2 uur binden stap, bereiden een radioactiviteit werkstation, zodat tHij nodige voorzorgsmaatregelen zijn getroffen voor radioactief werk. Stel hybridisatie oven tot 30 ° C.
10. Bereid 200 ml lysisbuffer door toevoeging van DTT en natriumvanadaat zoals aangegeven in hoofdstuk 1. PMSF is niet vereist in dit stadium.
11. Keer de glutathion platen over een wastafel te schudden uit de lysisbuffer en dep op een papieren handdoek. Spoel putjes 3x met 100 ul lysisbuffer (zonder PMSF). Niet laten putten zitten droog - bewaar ze op spoelen tot klaar om verder te gaan.
12. Maak 55 ml van 1 x kinasebuffer (KB) door verdunning van de 10x voorraad en het toevoegen van DTT zoals aangegeven in hoofdstuk 1. Spoel platen eenmaal met 50 pl 1x KB behulp van een geautomatiseerde vloeistof dispenser uitgerust met een standaardvolume cassette. Vertrekken 1x KB in putten tot oplossing A is klaar:
    1. Bereid een oplossing door toevoeging van 500 tot 530 ug van het substraat plaats, 500 ug myeline basisch eiwit (MBP), 2,65 ml 10 x KB, 13,25 pl 1 M DTT en H ₂ O tot 15,9 ml.
13. Een voor een, keren de borden boven de gootsteen te spoelen 1x KB verwijderen vlek op keukenpapier en voeg onmiddellijk 30 ul van Solution A behulp van een geautomatiseerd vloeistof dispenser uitgerust met een klein volume cassette. Houd platen op ijs.
14. Bereid Oplossing B in de radioactiviteit werkgebied door het toevoegen van 2,5 ml 10x M-ATP, 500 uCi gamma ^32P ATP en H _{2 O} tot 10 ml.
    1. Voeg 20 ul van Solution B per putje met behulp van een repeater pipet die helpt bij het mengen als gevolg van het uitwerpen van kracht. Dek af en incubeer bij 30 ° C hybridisatie oven 30 min.
15. Na 30 min, overdrachtsplaten naar ijs. Voeg 50 ul van 2 x SDS lysis buffer aan elk putje met een multichannel pipet. Kan gaan op dit punt naar de volgende stap, of sluit de platen met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C tot handig.

4. Running, kleuring, en drogen Gels

Let op: Alle werkzaamheden moeten in een gebied designa worden uitgevoerdted voor radioactiviteit.

1. Schakel hybridisatie oven ingesteld op 85 ° C. Ontdooi platen bij kamertemperatuur. Eenmaal heeft oventemperatuur, overdracht platen oven en incubeer gedurende 10 minuten om monsters denatureren bereikt.
2. Load 26-goed pre-cast gels met 15 pi van elke reactie met behulp van een multichannel pipet om meerdere putten te vullen in een keer. Zorg moet worden genomen dat alle tips uitgelijnd met bijbehorende goed voor het toevoegen van samples. Draaien gel op 150 V. Laat niet de tracking kleurstof (blauwe lijn) run off van de bodem van de gel, omdat dit bevat de niet opgenomen ATP.
3. Demonteer de gels en snijd de niet opgenomen ATP (blauwe lijn) met een scalpel of een rechte rand als het de films zal overbelichten. Plaats de gels in geëtiketteerde containers en bedek met Coomassie vlek gedurende 15 minuten.
4. Verwijder de Coomassie vlek, kort spoel de gels met water en voeg destain oplossing. Destain de gelen tot de eiwitten zichtbaar. Een band voor MBP en een band voor het substraat moetzichtbaar voor elk monster.
5. Drogen de gels:
   1. Snijd een groot vel papier filter en plaats het op de droger.
   2. Bevochtig een cellofaan blad in gedestilleerd water tot het glad en kreukvrij, en plaats deze op de top van het papier.
   3. Leg de gels op de top van het cellofaan vel, het maken van een nota van de orde van gels. Bevochtig een tweede vel cellofaan en bovenop de gels.
   4. Uitrollen alle luchtbellen (een plaat afdichting roller werkt goed voor dit) voor een mooie uniform oppervlak. Sluit de flap, zet het vacuüm en droog de gels 3 uur bij 80 ° C.
6. Zodra gels zijn droog, stel ze niet bloot aan XAR film met behulp van een scherm om het signaal te versterken. Wikkel de cassette met Saran Wrap of een plastic zak en sluit met tape om buiten te houden vorst. Bewaar de cassette bij -80 ° C overnacht.

5. Het ontwikkelen van XAR Films

1. De volgende dag, verwijder cassette uit diepvries en laat ontdooien bij kamertemperatuur. Ontwikkelen van de film ineen donkere kamer met een film processor volgens de instructies van de fabrikant.
   Let op: Controleer de films voor het bewijs van kinase-substraat paren. Een tweede langere blootstelling kan ook nuttig zijn om zwakkere fosforylering gebeurtenissen detecteren.

Results

Representatieve resultaten van een scherm worden getoond in Figuur 2. 180 kinasen werden gescreend met behulp van een GST-gelabeld peptidesubstraat overeenkomende met aa 268-283 van CRTC2 evenals de klassieke kinase assay substraat myeline basisch eiwit (MBP). Slechts twee kinasen, MARK2 en de nauw verwante kinase gefosforyleerd MARK3 de CRTC2 peptide. MBP wordt opgenomen als een interne controle in alle assays, zoals het bevat veel fosforyleerbare residuen en loopt bij 18 kDa, naar de ...

Discussion

Aangezien de oorspronkelijke publicaties waarin de benadering ^14,15, is de oorspronkelijke bibliotheek van 180 GST-kinases uitgebreid met 420 leden, en ~ 80% van het humane eiwit kinome. Met de uitgebreide bibliotheek, het protocol zoals beschreven duurt 4-5 dagen en dan 1-4 dagen om films te ontwikkelen (als noodzakelijk geacht), die door het gebruik van fosforimaging en digitale verhoging signaal kon worden ingekort. Er zijn een aantal belangrijke stappen waarbij zorg moet worden genomen (zie figuur...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysis buffer	Gemaakt in huis		Zie Protocol stap 1.1
10x kinase buffer	Gemaakt in huis		Zie Protocol stap 1.2
10x M-ATP	Gemaakt in huis		Zie Protocol stap 1.3
Human kinase plasmids	Orfeome, Invitrogen, Origene		GST-getagd in huis
96 wel platen	Fisher Scientific	CS003595
293T cellen	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	Supplement met 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 10% foetaal runderserum.
CO2 incubator	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm celcultuur schaaltjes	Fisher Scientific	877224
Serumvrij medium	Invitrogen	22600-050
Lipide-gebaseerd transfectiereagens	Invitrogen	11668-019
Automatische vloeistofdespender	Thermo Scientific	5840300
Kleine cassette-aansluiting	Thermo Scientific	24073295
Standaard cassette-aansluiting	Thermo Scientific	14072670
4 mM pervanadate	Gemaakt in huis		Zie Protocol stap 3.1
0.25 M CaCl2	Gemaakt in huis
Meerkanaals pijpette (20-200 μl)	Labnet	p4812-200
Meerkanaals pijpette (1-10 μl)	Thermo Scientific	4661040
V-bodem 6-wel platen	Evergreen Scientific	290-8116-01V
Glutathione gecoate 96-wel platen	Fisher Scientific	PI-15240
Hybridisatie oven	Biostad	350355
GST getagd substraat	Gemaakt in huis
Myeline Basis Protein (MBP)	Sigma	M1891
Repeater pijpette (1 ml)	Eppendorf	22266209
32P gamma-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS lysis buffer (100 ml)	Gemaakt in huis		Zie Protocol stap 1.4
26-wel voorgevormde TGX gels	BioRad	567-1045	Het vereiste gelpercentage is afhankelijk van het molecuulgewicht van het substraat van belang
Coomassie kleurstof	Gemaakt in huis		0.1% Coomassie R250, 10% azijnzuur, 40% methanol
Coomassie ontkleurmiddel	Gemaakt in huis		10% azijnzuur, 20% methanol
Gelabelde gelcontainers	Gemaakt in huis		Gebruikte plastic deksels van lege tipboxen, net groot genoeg om één gel te bevatten
Whatman filterpapier	Fisher Scientific	57144
Cellofaan vellen (2)	BioRad	165-0963
Geldroger	Labconco	4330150
Dubbele emulsie autoradiografiefilm	VWR	IB1651454
Film cassette	Fisher Scientific	FBAC-1417
Intensiteitsscherm	Fisher Scientific	FBIS-1417
Plate sealing rubber roller	Sigma	R1275