Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

Samenvatting

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Samenvatting

In de loop van slechts een decennium is enkele molecuulmicroscopie veranderd van een afgescheiden domein dat slechts werd gedeeld door natuurkundigen met een sterke achtergrond in optica en laserfysica, naar een discipline die nu levendige aandacht geniet van bioloog-wetenschappers van alle vakgebieden ¹. Dit komt omdat enkele molecuulbeeldvorming het unieke potentieel heeft om eiwitgedrag in situ in levende cellen te onthullen en cellulaire organisatie met ongekende resolutie te onthullen onder de diffractielimiet van zichtbaar licht ². Glas-ondersteunde planaire lipide dubbellagen (SLB's) zijn een krachtig hulpmiddel om cellen die anders in suspensie groeien, in voldoende nabijheid van de glasplaat te brengen zodat ze gemakkelijk kunnen worden afgebeeld in ruisverminderde Total Internal Reflection-verlichtingsmodus ^3,4. Ze zijn zeer nuttig om de eiwitdynamica in plasmamembraan-geassocieerde gebeurtenissen te bestuderen, zoals cel-cel-contactvorming, endocytose, exocytose en immuunherkenning. Er worden eenvoudige procedures gepresenteerd hoe om op een reproduceerbare manier zeer mobiele eiwit-gefunctionaliseerde SLB's te genereren, hoe om eiwitmobiliteit binnen te bepalen en hoe om eiwitdichtheden te meten met behulp van enkele molecuuldetectie. Er wordt getoond hoe om een ​​kostefficiënt enkele molecuulmicroscopiesysteem met TIRF-verlichtingsmogelijkheden te construeren en hoe om het te bedienen in het experiment.

Inleiding

Het begrijpen van de mechanismen waarmee membraaneiwitten aan hun cellulaire functie kan vaak een moeilijke taak, omdat hun werkingsmechanismen worden vaak door lage affiniteit interacties, die moeilijk te detecteren en evalueren conventionele biochemische methodologieën. Membraaneiwitten Voorts kan sterk verrijkt in specifieke membraandomeinen ^5,6 of dynamische vormen hogere orde structuren, die in principe kunnen veranderen hun biologische activiteit ^7.

Niet-invasieve laser-assisted enkel molecuul fluorescentie microscopie is dus de methode bij uitstek om eiwit gedrag in complexe cellulaire omgevingen onderzoeken geworden. Dit geldt met name voor de biochemische processen die plaatsvinden in het plasmamembraan, zoals deze kunnen in principe worden gecontroleerd geluidsarme totale interne reflectie (TIRF) modus. Hier sample belichting beperkt tot een maximaal 200 nm dunne plak in de nabijheid van een glazen suce, wat resulteert in een significant verlies van cellulaire achtergrond en, vanwege de kenmerken van het verdwijnende excitatielicht, ook in een aanzienlijke toename in fluorescentie signaalintensiteit ^8,9. Beide aspecten zijn belangrijk bij het streven naar een hoge positie en tijdsresolutie in single molecule detectie.

Planar SLBs zijn niet alleen compatibel met TIRF microscopie. Wanneer gefunctionaliseerd met geschikte liganden ze ook directe toegang tot het bestuderen van de moleculaire dynamica van cel-cel erkenning als ze zich voordoen in immuuncellen of andere cellen. Ze kunnen ook alleen worden gebruikt voor beweeglijke en anderszins niet-hechtende cellen dicht genoeg bij het glaasje te positioneren zodat deze cellen kunnen worden afgebeeld in TIRF verlichting, hetgeen zeer wenselijk wanneer geleiding proeven met enkel molecuul volgen of single-moleculen gebaseerde superresolutie. Hiertoe eiwitten op een uiterst mobiel SLB worden geladen. Een inherent voordeel van de gebruikte li PIDs zijn dat er geen niet-specifieke binding van eiwitten helemaal. Bovendien kunnen SLBs als tweedimensionale vloeistoffen met een inherent vermogen om zichzelf te genezen worden beschouwd; onregelmatigheden in de glazen drager gecompenseerd tot een zekere mate. Een stapsgewijze protocol wordt aan zeer mobiele dubbellagen geladen met eiwitten van belang te genereren. De vorming van vlakke SLBs beschreven, waarbij 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC) als hoofdbestanddeel (90-99%) en de synthetische bevatten en gefunctionaliseerd lipide 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3 - {[N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiazijnzuur] succinyl} nikkelzoutoplossing (DGS NTA-Ni) in geringe hoeveelheden (1-10%). POPC draagt ​​een verzadigd vetzuur en een mono-onverzadigd vetzuur en vormt lipide dubbellagen hoge vloeibaarheid bij kamertemperatuur. DGS NTA-Ni bindt met een kopgroep poly-histidine staart en dient als anker voor poly-histidine-gemerkte eiwitten keuze (figuur 1).

"> Belangrijk is dat de microscopie hardware omvat een aantal randapparaten die hieronder worden beschreven. Met de ontvangen informatie en enige basiskennis optica en laserfysica moet elke bioloog kunnen een enkel molecuul beeldvorming setup bouwen. Sample excitatie idealiter uitgevoerd op een omgekeerde microscoop in Total Internal Reflection (TIRF) gebied aangezien dit regime minder vals licht en buitensporige achtergrond anderszins gevolg van cellulaire auto-fluorescentie ^9. Hiervoor is een speciale TIRF geschikte objectief (zie hierna) en laser belichting nodig. Sommige experimenten zullen verlichting tijden vereisen binnen de milliseconde range en geëxploiteerd in snelle opeenvolging. Om de verlichting tijd te besparen of om onnodige bleken veroorzaakt door repeterende belichting is het vaak nuttig om het uitgezonden licht te splitsen in twee of meer spectrale kanalen te voorkomen. Dit zorgt voor gelijktijdige uitlezing twee of meer emissieprofielen, waarbij een belangrijke factor bij Conduc kan wordenTing experimenten met Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Hier de emissie van zelfstandige excitatie lichtpuls kan worden opgenomen zowel de FRET-donor en acceptor FRET (zoals gesensibiliseerde emissie). De camera moet genoeg fotonen te vangen met een voldoende lage achtergrond van enkele fluoroforen visualiseren tijdens de belichtingstijd. Computer software zal moeten worden tot de taak om excitatie sluiting en beeldacquisitie synchroniseren. Een volledig overzicht is hieronder en in figuur 2 gegeven:

TIRF geschikte doelstelling: Voor doelstellingen gebaseerde TIRF verlichting de numerieke apertuur (NA) van het objectief moet gelijk zijn aan of groter dan 1,4 met standaard objectglaasjes zijn (n = 1,515) ^9. Vergroting kan variëren van 60x tot 150x. Het doel moet chromatisch worden gecorrigeerd om voor confocaliteit wanneer beeldvorming verschillende fluoroforen.

Lasers: Het aantal beschikbare laser opties is sterk toegenomen in de afgelopen jaren. Modern elektronisch moduleerbare continue golf diode lasers zijn kostenefficiënt en kan worden bediend met een ongekende frequentie en snelheid. Duurdere gas ion lasers uitblinken in laserstraal kwaliteit, maar vereisen externe sluiting (zie hieronder) en vaak uitgebreide (water) koeling.

Excitatie luiken: akoestisch-optische modulators (AOM) zorgen voor een snelle sluiting in snelle opeenvolging ^10. Voor strak sluiten van de combinatie van een AOM met mechanische luiken aanbevolen. Deze manier uitgebreide opwarming van de AOM als gevolg van continue blootstelling aan licht wordt vermeden en het licht lekt uit de AOM in de off-positie wordt opgeheven.

Lenzen worden gebruikt om laserstralen te verbreden en te concentreren op de achterkant brandvlak van het objectief. Zo het excitatielicht verlaat het objectief een parallelle bundel (figuur 3), die nodig is voor TIRF verlichting vanhet voorbeeld. Verplaatsen het brandpunt in de rug brandvlak van het centrum naar de periferie van het doel zal de hoek waaronder de bundel verlaat het doel te veranderen, maar niet de plaats van de laserspot op het monster (figuur 3), dat een functie van de totale bundelgeometrie. TIRF verlichting ontstaat een kritische hoek, die kan worden aangepast met behulp van een set van spiegels functioneren als een periscoop om het brandpunt van de laser te vertalen in het brandvlak van de doelstelling. Lenzen chromatisch moet worden gecorrigeerd en kunnen worden gebruikt in een combinatie van twee of drie lenzen. Een drie-lens bestaat uit twee lenzen als een telescoop op de laserstraal (en dus de lichtvlek op het monster) en een derde lens verbreden naar de verbrede focusseren in de achterkant brandvlak van het objectief (figuur 4). Beide functies (telescoop en concentreren) kan ook worden bereikt door een combinatie van twee lenzen (zie figuur 4).

Mirrors ten minste 95% reflecterend verlies van laserlicht vermijden. Voor elke bundel aanpassing een set van twee spiegels wordt meestal toegepast als zodanig arrangement is voldoende om elke hoek en de positie van een laserstraal precies passen.

Dichroic overlays reflecteren en zenden licht van verschillende golflengten opgegeven en worden gebruikt om over elkaar of splitsing van de stralen van twee lasers.

Polychroic filters zijn complexer dan koudlichtfilters en zijn nodig om binnenkomende excitatie licht te reflecteren en doorgeven emissie licht het verlaten van het monster. Ze worden geplaatst in de filter kubus tussen het doel en de microscoop buis lens.

Ruim filters: Afhankelijk van het type laser employé d laser schoonmaken filters met een smalle transmissiebandbreedte in de laserstraal direct na de laser verlaat moet worden geplaatst.

Notchfilterszijn ontworpen om effectief te absorberen laserlicht met een smalle bandbreedte en zenden alle andere licht. Ze worden geplaatst in de uitstoot weg te filteren elke valse laserexcitatie licht. Echter, notch filters werken alleen bij 0 ° inkomende hoek. Als de bandbreedte van de inkeping filter is zeer scherp, de verschillende inkomende hoeken mag niet meer worden weerspiegeld. Blokkering van gecollimeerde laser laserlicht wordt niet beïnvloed, maar back-verstrooid licht kan niet efficiënt worden belemmerd van de camera bereiken.

Gemotoriseerde filter wielen uitgerust met de juiste filters wielen kunnen gemakkelijk worden geplaatst in de excitatie en emissie route en laat eenvoudig schakelen tussen verschillende lichtintensiteiten (wanneer uitgerust met ND filters) of TL-kanalen (wanneer geplaatst in de voorkant van een xenon of kwik booglamp voor ratiometrische calcium beeldvorming of voor de camera te selecteren voor de emitterende fluorofoor).

50:50 kubus straalsplitser cEen worden gebruikt om laserstralen gesplitst in twee afzonderlijke excitatiebundel paden en ook te combineren voor de periscoop.

Straalsplitser (emissie-pad): Voor snelle beeldacquisitie zonder enige noodzaak voor fysieke filter veranderingen, de uitstoot bundel wordt gesplitst in een blauw-verschoven en rode-verschoven kanaal. In principe kan beam splitters worden gebouwd door toepassing van een dichroïsche wig of een stel spiegels en een dichroïsche spiegel om de emissiebundel scheiden in een golflengte-afhankelijke wijze. Twee emissie filters zijn nodig om het schoonmaken van de uitgezonden kanalen.

Ruimtelijke filter: Ruimtelijke filtering van de excitatiebundel is soms nodig om niet evenwijdige lichtstralen uitgezonden van lage kwaliteit laserstralen verwijderen. Een ruimtelijk filter bestaat uit twee lenzen telescoop met een klein gaatje precies in het brandpunt van beide lenzen geplaatst. Zo vals licht als gevolg van niet-parallelle delen van de laserstraal wordt efficiënt geblokkeerd. Such voorwaarden moet worden voldaan bij de vaststelling van TIRF-gebaseerde microscopie. Ruimtelijke filtering toe met kleine gaatjes, die moeilijker te positioneren in het brandpunt en met kleinere focale lengten van de eerste lens. Om effecten van lensafwijkingen te verminderen is het voordelig zijn om in plaats van eenvoudige lenzen hoogwaardige en oneindig gecorrigeerde microscoopdoelstellingen met lage vergroting (10x of 20x).

Periscoop: een periscoop opstelling moeten de gefocusseerde laserbundel te vertalen in de achterkant brandvlak van het objectief, een voorwaarde voor TIRF beeldvorming. Het kan gemakkelijk worden opgebouwd uit twee twee-inch spiegels, een translationeel podium voor het instellen van de eerste spiegel en een post voor het positioneren van de tweede spiegel om de verbreed en geconcentreerd excitatie bundel in de microscoop (figuur 5) weerspiegelen.

Camera: Back-verlichte Electron-vermenigvuldigen Charge Coupled Devices (EMCCD) worden routinematig gebruikt voorde opname van de single molecule signalen. Dit is vanwege hun hoge kwantumrendement (tot 95%), hoge opnamesnelheid (tot 30 MHz) en relatief laag geluidsniveau. Afkoeling tot -80 ° C vermindert thermische ruis en wordt ondersteund door een aantal nog beschikbare EMCCD camera. Een beperking van de EMCCD technologie is dat cameraruis lineair toeneemt met zowel de camera versterking en het signaal wordt vastgelegd. Dit is niet het geval bij wetenschappelijke CMOS (sCMOS) camera's, die aanzienlijk goedkoper en werken door de speciale architectuur van de sCMOS chip veel sneller dan EMCCD camera. Maar een probleem in verband met de CMOS-technologie is dat het acquisitie heeft nog steeds een zekere mate van een kwantitatieve uitlezing op een enkel molecuul niveau, omdat elke pixel is voorzien van verschillende gevoeligheid. In principe kan dit worden gecompenseerd door middel pixel normaliseren, maar deze procedure niet gering ^11. Dit is de reden waarom we nog steeds aarzelen om opnieuwlof sCMOS camera's voor single molecule microscopie, maar gezien de snelle ontwikkeling van deze technologie, kan sCMOS camera snel de camera gekozen worden. Langzame scan CCD-camera's te vermijden-versterking gerelateerde geluidsoverlast en pixel variantie allemaal samen en ondersteunen snelste acquisitie tarieven als ze in een zogenaamde 'kinetische' modus kan worden bediend. In deze stand de hele camera chip uitzondering van een gebied van belang (ROI) wordt gemaskeerd, waardoor het mogelijk is de chip zelf dienst als opslagapparaat. Nadat het ROI loopt voor het eerst worden de resulterende kosten verschoven naar het gemaskeerde gebied van de chip beeldpuntlijn pixel regel, waar het beeld is beschermd tegen verdere blootstelling aan licht. Zodra het verschuiven van alle lijnen van de ROI in het gemaskeerde gebied is voltooid (in het sub-milliseconden), de ROI zelf is klaar voor de volgende belichting. Deze cyclus wordt herhaald totdat alle pixellijnen van de CCD chip betalen. De chip wordt vervolgens uitgelezen langzaam sterk reduced uitlezing lawaai. Bijvoorbeeld op een 1000 x 1300 pixel chip, kan 20 ROI van 50x50 pixels worden opgenomen in snelle opeenvolging. Omdat de beelden op de chip geruime tijd blijven voordat ze uitgelezen, is het essentieel om hoogwaardige maskeren waarborgen en de camera afkoelen (bijvoorbeeld met vloeibare stikstof) als middel om buitensporige thermische ruis. Sommige EMCCD camera's ondersteunen ook de kinetische modus.

Software: Timing van de lasers, luiken, AOM's en belichting evenals de juiste opslag van beelden zijn een integraal onderdeel van een succesvolle beeldvorming experiment. In principe kan veel gedefinieerde bewerkingen worden geprogrammeerd met beschikbare software pakketten die komen met de camera. Commerciële softwarepakketten ondersteunen een groot aantal hardware randapparatuur, die met weinig technische kennis kan worden geïmplementeerd.

Pulse generator, Data Acquisition (DAQ) board (met analoge en digitale output kanalen) en oscilloscoop: Een pulsgenerator is eenuitstekende keuze om triggerpulsen omzetten in pulsen van bepaalde tijd en spanning. Zo lasers kan nauwkeurig worden gecontroleerd voor uitgangsvermogen en getimed in de milliseconde tot milliseconde range. DAQ borden met analoge uitgangen te bereiken hetzelfde en zijn eenvoudig te integreren in het moederbord van de computer via de PCI-slots. Pulsduur, amplitude en frequentie worden geverifieerd met een oscilloscoop.

Behuizing van de gehele excitatiebundel pad: Om fluctuaties in de excitatie profiel toe te schrijven aan de lucht convections het hele excitatiebundel pad moet worden afgesloten van zijn lab milieu te voorkomen. Deze maatregel is vooral van belang bij het uitvoeren van TIRF microscopie. Optische componenten worden ook beschermd tegen stof en het menselijk oog van laserlicht blootstelling. Behuizingen kunnen gemakkelijk bouwen van zwart karton, die kunnen worden gekocht in de kunst aanbod winkels.

Om de vloeibaarheid van de SLB Fluorescence Recovery Na Photobleac bepalenhing (FRAP) ¹² metingen worden uitgevoerd. Voor FRAP het bestaan ​​van twee excitatie bundelbanen raden (zie figuur 3). De eerste lichtbaan is ontworpen om fluorescentie beeld van de bilaag. Dit kan in TIRF configuratie met lage lichtintensiteit. De tweede stralengang moet het mogelijk maken een korte maar intense pulse bleekmiddel en dient non-TIRF modus worden geconfigureerd, zodat het doel verlaat langs de optische as. Een ronde opening kan in de excitatie stralengang geplaatst (zie figuur 8) om een perfect rond bleekmiddel profiel met gedefinieerde randen uitsteken. Om dit beeld opening op het object vliegtuig, zou de optimale positie in het brandvlak van lens 3 (zie figuur 3). Echter, vanwege de lange brandpuntsafstand van deze lens, een opening beeld van voldoende kwaliteit kan worden opgewekt, wanneer de opening is geplaatst op iets verschoven posities.

Na uitgevoerd tHij beeldvorming experiment de ruwe gegevens moeten adequaat worden geanalyseerd. Verscheidene stap voor stap protocollen worden aangeboden, waarbij de aanpassing van de hoofdinstellingen (bv lichtsterkte en tijd, TIRF hoek) omvatten, het verkrijgen en analyseren van de data.

Protocol

1. Generatie en functionalisering van Planar SLBs

1. Het mengen van de lipiden
   1. Om te komen tot een 10% DGS NTA-Ni / 90% POPC lipidesamenstelling ontbinden 45 mg POPC en 6,9 mg DGS NTA-Ni in chloroform in een 250 ml rondbodemkolf. Houd het volume chloroform laag (slechts enkele ml) te verdampen in de volgende stap. Voor een 1% DGS NTA-Ni / 99% POPC lipidesamenstelling gebruiken 49,5 mg POPC en 0,69 mg DGS NTA-Ni.
   2. Verwijder het chloroform met een rotatieverdamper langzaam - verhoging boven omgevingstemperatuur niet nodig. Alternatief wegblazen in een chemische kap in een stroom inert gas zoals stikstof of argon. Terwijl dit doen voortdurend draaien de kolf gelijke afzetting van het drogen lipide op de onderste helft van de rondbodemkolf staan.
   3. Nadat het merendeel van de chloroform verdampt, hechten de kolf naar vacuüm O / N om het chloroform kwantitatief te verwijderen.
      OPMERKING: Deze stap is essentieel om besmetting te voorkomenvan eiwitten en cellen toxische chloroform in latere stadia en lipide bilaag vloeibaarheid te waarborgen.
2. Generatie van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) van gedroogde lipiden
   OPMERKING: Kleine unilamellaire vesikels (SUV's) liggen tussen 20 nm en 100 nm in diameter en kunnen gemakkelijk worden geproduceerd door badsonicatie. Lipid extrusie, een alternatieve methode, kan tot SUV geven en, afhankelijk van de poriegrootte van het filter aangevraagde extrusie, ook grote unilamellaire blaasjes (LUV), die 100 nm tot 1000 nm in grootte. Echter, SUV's zijn het meest geschikt voor het vormen SLBs.
   1. SUV's tot badsonicatie (in beeld):
      1. Degass PBS. Suspendeer het gedroogde lipide mengsel met 250 ml rondbodemkolf in 10 ml ontgast PBS.
      2. Vul de kolf met een inert gas zoals stikstof of argon, sluiten met een stop en sluit de kolf met een autoclaaf tape.
      3. Plaats de afgesloten kolf in een bad ultrasoonapparaat en ultrasone trillingen de lipidesuspensie eenT 120-170 W totdat het is duidelijk gedraaid. Dit duurt tussen 30 en 60 min.
      4. De voortgang van blaasjes vorming spectro-fotometrisch: Voortvloeien dat de absorptie van onverdunde emulsie in vergelijking met PBS blijft constant op 234 nm (zoals bij benadering indicator voor de lipide concentratie) nog moet aanzienlijk dalen bij 550 nm (als gevolg van verminderde lichtverstrooiing via grotere deeltjes).
      5. Om zware non-unilamellaire blaasjes, die interfereren met de vorming van een aaneengesloten SLB pellet pellet de vesicle suspensie door centrifugeren bij 150.000 xg gedurende 1 uur bij 25 ° C en vervolgens gedurende 8 uur bij 288.000 xg, 4 ° C.
      6. Filtreer de bovenstaande vloeistof door een spuitfilter met een poriëndiameter van 0,2 urn.
      7. Meet de OD bij 234 nm en 550 nm de duidelijkheid van de vesicle preparaat en de hoeveelheid lipide linkermonitor.
      8. Bewaar de vesicles bij 4 ° C onder argon of stikstof. Eventueel gebruikt vesicle suspensie te bereiden bilaagenkele maanden.
   2. SUV's door middel van lipide extrusie:
      1. Kortom, passeren de lipide suspensie verschillende keren door een filter met een poriëngrootte van 0,1 urn. Ongeacht de fabricagemethode, centrifuge de vesicle suspensie maal (1 uur, 150.000 g, 25 ° C, daarna 8 uur, 4 ° C, 288,000 g) niet-unilamellaire vesicles die zwaarder zijn pellet.
         OPMERKING: Indien opgeslagen bij 4 ° C onder inert gas, kan vesicles worden gebruikt voor dubbellaag bereiding enkele maanden.
3. Vorming van een SLB en opladen met eiwit
   1. Behandel 24 x 50 mm # 1,5 glasplaatjes met een 3: 1 mengsel van geconcentreerd zwavelzuur en 30% waterstofperoxide gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Als gevolg van de agressieve aard van het mengsel te nemen speciale zorg, dwz het dragen van een laboratoriumjas en een veiligheidsbril zoals in de video!
   2. Glasplaatjes afspoelen onder een stroom van DDH _{2 O} uit een spuit fles. Leg ze op een Teflon-stand en laat ze drogen10 tot 30 min.
   3. Verwijder het onderste glasplaatje van 8 of 16 kamers goed, vul de bodem met epoxy lijm en zorgvuldig plaats een schoon en droog glasplaatje op de lijm bedekte kamerbodem. Laat de lijm uitharden gedurende 10 min. Verwijder overtollige lijm van de bodem.
      Opmerking: Een afdichting tussen de glasplaatje en de kamer kan ook gemakkelijk worden bereikt met het gebruik van een tandheelkundige tweecomponenten silicone modeling paste die uithardt binnen 10 tot 30 min. Dit zegel is niet zo stevig als epoxy lijm, maar weerstaat regelmatige fysieke belasting. Na het experiment gemakkelijk kan worden verwijderd uit de kamer, die vervolgens opnieuw in toekomstige experimenten.
   4. Pipetteer 120 ul (60 pl) van een 10-voudige verdund PBS-lipidesuspensie in elk putje van een 8 (16) - en kamer (bereid zoals hierboven beschreven) en laat de bilaag formulier 20 min. Spoel voorzichtig de dubbellaag tweemaal met 15 ml PBS. Nadat de bilaag gevormd moet altijd ondergedompeld in buffer en nooit worden blootgesteld aan lucht.
   5. Vul elk putje helemaal met PBS, vervolgens opstijgen 330μl (8-well kamer) of 165μl (16-well kamer). Er zijn 350μl (175μl) nog in de put. 50 pl (25 pl) cocktail met His-gemerkte eiwitten verdund in PBS aan elk putje (400 of 200 ul eind) toevoegen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 60 min in het donker. Het oppervlakte-eiwit dichtheid worden aangepast door de proteïneconcentratie tijdens de incubatiestap.
   6. Spoel elk putje tweemaal met 15 ml PBS.
      LET OP: Normaal gesproken moet SLBs worden gebruikt in experimenten niet langer dan 6 uur na het opladen met eiwit. Gedurende deze periode fluorofoor herstel na fotobleken blijft tot 95% en geen verlies van bilaag geassocieerd eiwit kan worden gedetecteerd. Het eiwit dichtheid moeten vóór de proef te bepalen (zie hieronder).
   7. Optionele stap: Om te testen op niet-specifieke binding van het eiwit de DGS NTA-Ni bevattende SLB, was de SLB eenmaal met PBS dat 300 mM imidazool. De proTein moet helemaal uit komen.

2. Microscoop Setup

1. Voor het bouwen van een microscopiesysteem opsporen van de fluorescentie van één fluorochromen verwijzen naar de aanbevelingen in de inleiding.

3. Vermogen Metingen

OPMERKING: Fluoroforen kan gemakkelijk worden verzadigd met een overmaat excitatielicht. Dit versnelt fotobleken zonder verdere winst in emissie en moet dus worden vermeden. Monster verlichting de excitatie vermogensdichtheid moet direct aan het monster worden gemeten optimaliseren. Dergelijke metingen kunnen ook dienen als referentie voor toekomstige experimenten. Bovendien weten de verhouding tussen input en output laservermogen is nuttig bij de beoordeling van waar het licht is verloren in de imaging-systeem.

1. Verplaats de excitatiebundel in de verticale positie, zodat het de doelstelling bladeren in een hoek van 90 °.
2. Plaats het hoofd van de power meter op de top of de balk en meet de kracht van de straal (= P). Documenteer het resultaat.
3. Met behulp van de periscoop, draai de balk in de TIRF positie en het imago van een intacte homogene fluorescerende dubbellaag. Te bleken en CCD signaalverzadiging plaats een neutrale dichtheid (ND) filter met een optische dichtheid (OD) van 2-3 in de excitatielicht pad te voorkomen.
   1. Meet de geïntegreerde tellingen van de hele verlichte veld (= I _totaal). Ook meten van de grootte van het verlichte gebied (A = _totaal). Meet de geïntegreerde tellingen (= I _Center) van de maximaal verlichte stip en de grootte van de vlek (= A _center).
4. Meet de achtergrond signaal per pixel (= B), hetzij buiten het verlichte gebied of zonder monster verlichting.
5. Trek de achtergrond signaal van de resultaten gemeten in 3). Doe dit door het aantal pixels van het gebied in kwestie (geheel verlicht gebied of middenstip) te vermenigvuldigen met de achtergrondtellingen per pixel. (= I _totaal - _Een totaal .B en ik _centreren - _Een centrum .B).
6. Verdeel de geïntegreerde en de achtergrond gecorrigeerde signaal van het centrum ter plaatse door de geïntegreerde en de achtergrond gecorrigeerde signaal van het gehele gebied van verlichting.
   OPMERKING: Het resultaat geeft de fractie van het totale vermogen zich in het centrum van de spot (= (I _center - _Een centrum .B) / (I _totaal - _Een totaal .B)). Vermenigvuldiging van dit resultaat met de kracht P gemeten in 2) resulteert in de kracht van het licht het verlichten van de middenstip.
7. Bepaal de grootte van de plek A _{center in} μm². Voor dit deel de camera pixelgrootte in urn door de vergroting van het objectief, neemt het kwadraat van het resultaat μm² per pixel.
   1. Alternatief meet de pixelgrootte in het beeld met behulp van een micrometer geplaatst op de microscoop en neem het kwadraat van het resultaat oppervlakte per pixel. Multiply deze waarde met het aantal pixels ligt binnen de stip te komen tot de verlichte vlek gebied.
8. Verdeel het vermogen P verlichten van de stip door de grootte van de stip A _{center, μm²} de verlichtingssterkte per urn ² berekenen. Een voorbeeld wordt gegeven in figuur 6.
9. Vermogensdichtheid gemeten in niet-TIRF verlichting zijn typisch lager dan die aanwezig in TIRF verlichting ^13, die ook afhangen van de precieze hoek waarmee het laserlicht wordt volledig gereflecteerd. Om te komen tot vermogensdichtheden onder TIRF verlichting aanwezig, het geijkte fluorescerende kralen van 0,1 um diameter, zowel in niet-TIRF en TIRF. De verhouding van de kraal fluorescentie-intensiteiten gemeten in TIRF en niet-TIRF modus bedraagt ​​de omrekeningsfactor C, die de omzetting van de gemeten vermogensdichtheid waarden laat in die effectief onder TIRF verlichting (vergelijking 1).
   vermogensdichtheid _TIRF = C • vermogensdichtheid _niet-TIRF (vergelijking 1)
   met C = kraal intensiteit _{T IRF} / kraal intensiteit _niet-TIRF

4. Densiteitmetingen

1. Bepaal het gemiddelde signaal van individuele fluoroforen op een bilaag. Bilaag verbonden MHC moleculen geladen met peptiden fluorescent zijn ideaal voor dit doel omdat de proteïne: label stoichiometrie precies één. Eventueel bleekwater alle labels op de bilaag in het gezichtsveld en laat de fluorescentie herstellen enkele fluoroforen te visualiseren.
   1. Record beelden snel achter elkaar (bijvoorbeeld het toepassen van een streaming overname protocol) en het toezicht op enkele moleculen mobiliteit over meerdere frames. Voor meer informatie wordt verwezen naar figuur 7.
2. Markeer de centrale verlichting plek op de bilaag als ROI. Meet het ROI, zou de variatie in lichtsterkte dichtheid (dat evenredig is met de fluorescentie-intensiteit) idealiter minder dan 15% bedragen.
   1. Bepaal enkel molecuul en bulk fluorescentie alleen in deze ROI. Integreer het signaal van een ROI, die groot genoeg is om 99% of meer van de puntspreidingsfunctie van de interne emitter vangen. Bij toepassing van een camera met een pixelgrootte van 16-20 urn (vermeld in camera specificaties van de fabrikant), een objectief met 100-voudige vergroting en een numerieke apertuur gelijk aan of groter dan 1,45, neemt een gebied van 7 bij 7 pixels met intensiteit piek ligt in het midden van het plein.
   2. Om de achtergrond signaal te bepalen, de integratie van de graven van een naburig 7 van 7 pixel plein, dat een fluorescentie-signaal bevat. Aftrekken van de achtergrond van de enkel molecuul signaal naar de gecorrigeerde waarde voor enkel molecuul fluor te bepalenescence. Selecteer alleen signalen, die nog zichtbaar in het volgende frame.
3. Herhaal stap 4,2 vijftig tot honderden keren. Gemiddeld de achtergrond gecorrigeerde signaal. Indien gewenst, plot enkel molecuul intensiteit waarden als een histogram. Optioneel: profiteer van een geschikte plugin van open-source software-pakketten (bijvoorbeeld ImageJ) of het verwerken van de gegevens met behulp van commerciële software (bijv Metamorph, Molecular Devices). Ervaren gebruikers kunnen hun eigen analyse programma in Matlab of soortgelijke software te schrijven.
4. Plaats een grijsfilter van 2 of hoger in de excitatiepad en neemt beelden van een fluorescente bilaag-bevattende eiwitten gemerkt met dezelfde fluorofoor. Noteer de gemiddelde pixelintensiteit van dezelfde ROI voor single molecule intensiteitsmetingen. Noteer de belichtingstijd van de bulk fluorescentiemetingen. Meet dezelfde plek zonder verlichting voor de achtergrond aftrekken.
5. Om het eiwit dichtheid binnen de bi bepalenlaag, vermenigvuldig de achtergrond gecorrigeerde bulk fluorescentie gemiddelde pixelintensiteit bepaald in stap 4 door het aantal pixels per vierkante micron (bijvoorbeeld 41,5), met 100 (als een ND-filter met een OD van 2 werd gebruikt) of 1000 (als een ND filter met een OD van 3 werd gebruikt) en de blootstellingstijd in stap 2 en delen door het gemiddelde signaal enkel molecuul bepaald in stap 3, de belichtingstijd in stap 2 en het aantal fluoroforen per eiwit.

5. Het testen van de integriteit van de bilaag

1. Bereid een fluorescerend dubbellaag en plaats het op de microscooptafel zoals hierboven beschreven.
2. Pas de scherpstelling en neem een ​​beeld van de bilaag in TIRF modus. Breng een korte maar intense bleekmiddel puls in non-TIRF modus om de fluorescentie binnen een klein schijfvormig ROI ablatie.
3. Een foto van de bilaag in lage intensiteit TIRF modus onmiddellijk na het bleken en vervolgens elke 5 tot 10 seconden om de snelheid van fluorescentie herstel te volgen.
4. Move naar een ander gebied op de bilaag en volg stap 2 en 3. Neem een ​​ander beeld in lage intensiteit TIRF modus 5 minuten na het bleekmiddel puls. Bepaal de intensiteit I _{plaatsen bleekmiddel} in het bleekmiddel stippellijn vergelijken met de intensiteit vóór bleken I ₀ aan het begin van het experiment (geen bleken zou hebben plaatsgevonden) naar immobiele fractie te berekenen (IF) als volgt:
   Immobiele fractie IF (%) = (I ₀ - _Ik post _bleekwater) / (I ₀ - achtergrond) x 100,
   met achtergrond = gemeten intensiteit binnen de ROI zonder excitatielicht toegepast
   De IF moet minder dan 10% (bij voorkeur minder dan 5%) zijn.

Resultaten

De architectuur van de enkel molecuul fluorescentie microscopie wordt geschetst in aanzienlijke detail in figuur 2. Losse onderdelen zoals optische componenten en andere hardware componenten worden toegelicht in de inleiding. De optische excitatiebundel wegen, die tot op een bepaalde wijze TIRF en non-TIRF verlichting geven, worden getoond en toegelicht in Figuren 3-5. Let op de plaats van het 50:50 bundeldeler voor de eerste periscoop spiegel gepositioneerd op een micrometer vertaalbaar stadium (figuur 5). Deze bundeldeler superponeert de TIRF bundel voor beeldvorming (groen aangegeven) en de niet-TIRF beam (aangeduid in het rood) voor bleken of lokaal opening gedefinieerd light-gemedieerde activatie monster (zoals geschetst in figuur 3). De gecombineerde lichtpaden (Figuur 5, aangegeven in oranje) zijn terug te vinden via de tweede periscoop spiegel in de achterkant haven van de omgekeerde MICRoscope. Zoals uiteengezet in figuur 4 en beschreven in figuur 2, de toepassing van twee of drie bolle lenzen verbreedt de laserbundel profielen en richt de laserstralen op de achterkant brandvlak van de doelstelling tot twee gecollimeerde bundels te verlichten van het monster in TIRF en , respectievelijk in de niet-TIRF.

Een voorbeeld van gemeten intensiteitswaarden die voor de berekening van de vermogensdichtheid van het monster is getoond in figuur 6. De gemiddelde achtergrondsignaal wordt afgetrokken intensiteiten gemeten in de verlichte en centrale gebied (voor imaging), wordt bepaald in een gebied in de gezichtsveld, dat niet wordt belicht door de laserbundel (hier 7089 tellingen). De achtergrond gecorrigeerde intensiteiten van de verlichte (1684 tellingen) en het centrale gebied (4830 tellingen) wordt vervolgens vermenigvuldigd met de overeenkomstige gebied afmetingen aanleiding geïntegreerde intensiteiten (1,471 gevenx 10 ^{8 tellen} voor het verlichte gedeelte en 3,424 x 10 ⁷ telt voor het centrale gebied). De verhouding van de geïntegreerde intensiteiten binnen de centrale en verlichte gebieden geeft de fractie van het totale vermogen lichtdoorlatende het middengebied (0,23 of 23%). Zoals getoond in de film, het totale vermogen moet worden vastgesteld op het doel met behulp van een vermogensmeter in niet-TIRF verlichtingsmodus. In ons voorbeeld is ingesteld op 5 mW, waardoor aanleiding tot een vermogen van 5 mW x 0,23 = 1,15 mW binnen het centrale gebied. Aangezien 41,5 pixels hoeveelheid in ons voorbeeld 1 um ^2, het centrale gebied heeft een grootte van 7089 pixels /41.5 pixels x ² pm = 170,8 urn ^2. Verdeling van het opgenomen vermogen van de lichtdoorlatende middengebied (1,15 mW) van dit gebied (170,8 um ²⁾ geeft een gemiddeld vermogendichtheid van 0,7 kW / cm ² in het centrale gebied.

Figuur 7 is voorzien van afbeeldingen en de bijbehorende intensiteit resultaten van verworven in snelle opeenvolging enkele fluoroforen (100 frames per seconde, dat wil zeggen met een tijdsbestek van 10 msec). Voor kwantificering van de intensiteit gemiddelde signaal van een rechthoekig gebied van zeven met zeven (= 49) pixels, die het fluorescentiesignaal omvat, wordt bepaald. Verder is de gemiddelde signaal van de achtergrond wordt bepaald binnen een rechthoekig gebied van zeven met zeven pixels in de nabijheid van de single molecule signaal. De achtergrond gecorrigeerde signaal wordt vermenigvuldigd met het aantal pixels binnen het gebied (= 49) aanleiding geeft tot individuele moleculen signaal (vetgedrukt) werd verkregen.

Een representatief FRAP experiment ontworpen om de mobiliteit van SLB-geassocieerde fluorescentie gemerkte eiwitten te evalueren wordt in figuur 8. Merk in figuur 8A de herhalingssnelheidtieve gebruik van een verbreed lage intensiteit beeldvorming balk en het eenmalig gebruik van een tweede, meer smal en diafragma-gedefinieerde hoge intensiteit balk snelle fluorochroom ablatie op het nulpunt tweede keer punt. -Achtergrond afgetrokken gemiddelde intensiteiten binnen de gele cirkel, die werden genormaliseerd door de oorspronkelijke gemiddelde intensiteitswaarde vóór het bleekmiddel puls uitgezet in figuur 8B tegen de tijd om de snelheid en mate waarin fluorescentie hersteld opnemen. Zoals getoond, heeft meer dan 90% (aangegeven met de groene lijn) van de eerste dubbellaag intensiteit hersteld binnen 75 sec na fluorchroom ablatie. Bijgevolg minder dan 10% van de eiwitten ingebed in de getoonde SLB beweeglijk.

Figuur 1. Schematisch overzicht van een SLB systeem. (A) SLBs bestaan ​​uit POPC (90-99%) en de synthetische lipide DGS NTA-Ni (1-10%). Ze vormen spontaan als schone glazen oppervlakken zijn belast met SUV's, bestaande uit de overeenkomstige lipiden. (B) Eenmaal gevormd, deze SLBs kan gemakkelijk worden ingericht met oplosbare eiwitten uitgebreid, hetzij met een C- of N-terminale tag bevat twaalf histidines (12H, voor Bijvoorbeeld de co-stimulerende molecuul B7-1 en ICAM-1) of eiwit dimeren uitgebreid met twee labels met zes histidines elke (2x6H, bijvoorbeeld een αβMHC klasse II dimeer). Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.

Figuur 2. Overzicht van de excitatie en emissie stralengangen. Gas ion lasers (bijvoorbeeld Ar of Kr ^{+ +)} kan worden gebruikt voor snelle sluiting met behulp van akoestisch optische mo dulators. Lasers diodes zijn tegenwoordig verkrijgbaar in vele golflengten en vormen een uitstekend alternatief omdat ze elektronisch kan worden gemoduleerd in de microseconde-rage. Merk op dat laserstralen gemakkelijk kunnen worden met twee (dichroïtische) spiegels en gesplitst en gecombineerd met het gebruik van eenvoudige bundelsplitsers aanleiding geven tot twee of meer stralengangen. In dit voorbeeld een TIRF imaging beam (gebeurtenissen bewaken) en bleekmiddel beam (ofwel bleekmiddel fluoroforen of foto-activeren gekooid moleculen in een apertuur gedefinieerde wijze) worden gebruikt. Zowel excitatie paden kunnen onafhankelijk van elkaar door het gebruik van aanvullende rolluiken bedienen. De periscoop maakt voor het vertalen van de gerichte laserstraal in de rug brandvlak van de doelstelling om TIRF verlichting van de steekproef te genereren. De fluorescerende afbeelding kan spectraal worden gesplitst met behulp van een emissie bundeldeler vóór verwerving met gebruik van een ultragevoelige camera (bv EM-CCD of wetenschappelijke CMOS camera)..com / files / ftp_upload / 53.158 / 53158fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Aanpassen TIRF verlichting door het vertalen van de gefocusseerde bundel op de achterkant brandvlak van het objectief. Zoals het brandpunt van de laserbundel wordt verplaatst in de rug brandvlak van het objectief van het centrum naar de omtrek door middel van translocatie van de bundel (met behulp van een periscoop spiegel arrangement). Hierdoor wordt een evenwijdige bundel verlaat de doelstelling in een gekantelde belichting totdat een kritische hoek wordt bereikt waarbij totale interne reflectie gebeurt. De verdwijnende veld wordt gegenereerd op het glas-media-interface waar totale reflectie plaatsvindt. Klik hier om een grotere versie van deze fi bekijken guur.

Figuur 4. Eenvoudige optische systemen op de laserstraal zich in de achterkant brandvlak van het objectief. Drie of twee lenzen nodig zijn laserstraal verbreden en te richten op de achterkant brandvlak van de TIRF doelstelling. Twee lenssystemen bevatten minder lenzen geassocieerde fouten dan drie lenssystemen en wellicht beter geschikt voor het opwekken van de TIRF afbeeldende bundel zijn. Drie lenzen zou beter zijn als het streven naar gedefinieerd bundel verbreding en een verlichting plek met scherpe randen, als dat nodig zou zijn voor studies in dienst foto-activering of -bleaching. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

/53158fig5.jpg "/>

Figuur 5. geannoteerde foto van de stralengang achter in de fluorescentiemicroscoop. Zoals reeds in figuur 2 een riet geschetst eenvoudig te implementeren twee excitatie bundels, een in TIRF (groen aangegeven) in de andere niet-TIRF modus (aangegeven in rood). Deze worden bedekt met behulp van een 50:50 bundelsplitser (BS). Convexe lenzen (L1 en L2) worden geplaatst in de respectievelijke balken te concentreren op de achterkant brandvlak van het objectief (niet getoond). Een periscoop bestaande uit twee spiegels (M1 en M2) begeleidt beide bundels via de haven van binnenkomst in de microscoop. De eerste spiegel (M1) kan met behulp van een translatietrap (TS) kan worden (door het draaien van een micrometer schroef aangegeven) naar een van bundels in TIRF positie te verplaatsen. Zodra TIRF is vastgesteld, kan de tweede balk (gebruikt voor foto-bleken of -activation, hier aangegeven in rood), onafhankelijk van de TIRF balk worden aangepast aan de doelstelling van non-TIRF vertrekkenmodus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Meten van de kracht in het middengebied van de lichtvlek. Zoals aangegeven kozen geschikte gebieden van belang, waarbij die weerspiegelen, het gehele verlichte oppervlak (IA) en het centrale gebied (CA), waarbij later doorlopen wordt opgenomen. Aftrekken achtergrond waarden van de geregistreerde voor IA en CA en integreren van de intensiteit door te vermenigvuldigen gecorrigeerde gemiddelde intensiteiten met het aantal aanwezige in elk gebied (= geïntegreerd intensiteiten) pixels. Verdeel de geïntegreerde intensiteit van CA door die van IA te komen tot het percentage van het bundelvermogen verlichten van de CA (in dit voorbeeld: 23%). Bepaal de kracht van het licht het verlichten van de CA van de totale bundel vermogen (hier te vermenigvuldigen: 5 mW) met het aandeel verlichten van de CA (hier: 0,23). Om de grootte van het centrale gebied te bepalen vermenigvuldigt de omgeving (hier: 7089 pixel) met een pixel-voor-gebiedsgrootte conversiefactor (hier: 1 / 41,5 pm ² pixels ^-1). Om te komen tot de gemiddelde vermogensdichtheid van het excitatielicht het verlichten van de CA, verdelen de kracht (hier: 1,15 mW) door de grootte van de CA. (Hier: 170,8 um ²⁾ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. kwantificering van single molecule signalen. (A) Tijd loop van enkele fluoroforen op SLB. A 7 x 7 pixels en kleinbedrijf regio van belang (ROI, geel) is geplaatst rond het signaal voor kwantificering. Achtergrond wordt bepaald uit de naburige 7 x 7 pixelsroi (groen). (B) gekwantificeerde gemiddelde pixelintensiteiten worden vermeld. Om de enkel molecuul signaal te bepalen, zijn achtergrond waarden (groen roi) afgetrokken van signaal waarden (geel roi) en vermenigvuldigd met 49. (C) Single molecule intensiteiten van een fluorofoor worden uitgezet tegen de tijd. Merk op dat de 90 msec tijdstip wordt weggelaten als de fluorofoor is in het proces van bleken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8. fluorescentieherstel na Photobleaching (FRAP) analyse om de integriteit van de SLB bepalen. (A) FRAP werd uitgevoerd op een bilaag uitvoering IEK / MCC-Alexa Fluor 647. 10 Elk beeld van het experiment weergegeven. (B) FRAP kwantificering van de in experiment (A). De waarden geven gemiddelde intensiteiten (I) binnen de gele ROI getoond in (A) gedeeld door de oorspronkelijke intensiteit _(Io) voor het bleken. Rode data punten worden weergegeven in (A), de groene lijn geeft 0,9 herstel van de oorspronkelijke intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Enkel molecuul microscopie biedt de unieke mogelijkheid om het gedrag van de eiwitten in hun eigen cellulaire omgeving bestuderen. Moleculaire beeldvorming wordt daarom steeds aantrekkelijker om een ​​brede wetenschappelijke gemeenschap, maar veel leven wetenschappers nog steeds weg van de initiële investering in technologie en expertise verlegen. Het belangrijkste voordeel uit monteren eigen beeldvormingssysteem is dat het gemakkelijk kan worden aangepast aan de specifieke behoefte van iemand.

Zoals hier voorgesteld een niet-TIRF excitatiebundel kan eenvoudig worden geïmplementeerd naast een bestaand TIRF lichtpad als snelle en gedefinieerde foto-bleken (of -activation) fluoroforen en liganden wordt gewenst, bijvoorbeeld bij het ​​uitvoeren FRAP of ligand uncaging experimenten ¹⁴ . De invoering van een emissie bundelsplitser maakt gelijktijdig opnemen van ten minste twee en in sommige gevallen tot vier fluorescente kanalen. De lijst met extensies is in wezen slechts beperkt doorde eigen verbeelding.

Bijvoorbeeld de uitvoering van een gemotoriseerde emissie-filter wiel in de emissie-pad zorgt voor snel schakelen tussen maximaal tien verschillende fluorescerende kanalen. Bij het combineren van twee gemotoriseerde emissiefilter wielen (elk voorzien van 10 filtersleuven) in serie, tot 18 fluorescerende kanalen kunnen worden uitgelezen. TIRF-gebaseerde beeldvorming kan worden aangevuld met metingen calcium mobilisatie en Interferentie Reflection Microscopie (IRM), na integratie van een Xenon of Mercury excitatielamp pad. IRM is de voorkeurswerkwijze voor de mate waarin de cellen worden gehecht aan het glasoppervlak of een SLB en kan derhalve een kritische informatie bij de interpretatie-gebaseerde TIRF imaging visualiseren. Vaststelling van een verwijd excitatie licht met behulp van een eenvoudige dichroïsche spiegel en een extra laser van 405 nm laat uitvoeren fotoactivatie lokalisatie microscopy (PALM) of stochastische reconstructie optische microscopie (STORM), namelijk twee superresolution methodologieën met een positienauwkeurigheid onder de diffractie limiet van zichtbaar licht ^15,16.

Echter, experimentele succes is niet alleen een kwestie van de juiste hardware. Om optimaal te profiteren van geluidsarme-TIRF gebaseerde beeldvorming te nemen, moeten de cellen contact met een oppervlak op een manier die geen beperkingen oplegt op het celoppervlak of die interfereert met de fysiologie van hun plasmamembraan te maken. SLBs gefunctionaliseerd met geschikte eiwitten voor celadhesie overschrijdt goed geschikt voor dit doel, omdat alle SLB-ingebedde liganden lateraal mobiel en hun laterale positie binnen de bilaag te passen als reactie op binding en segregatie dynamiek receptor.

Om SLBs produceren in een reproduceerbare manier, is het het beste om te beginnen met een SUV van een hoge zuiverheid. Zoals hierin beschreven, is het dus essentieel om multilamellaire blaasjes, die ook geproduceerd tijdens sonicatie verwijderen twee ultracentrifugatie stappen die interfere met de vorming van aaneengesloten SLBs met hoge vloeibaarheid. SLBs hoogwaardige vorm alleen op schone glazen oppervlakken. Keer schoongemaakt glasplaatjes moet onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen in vacuüm. Belangrijk is dat SLBs nooit worden blootgesteld aan lucht omdat dit zou leiden tot de verstoring. SLB wassen omvat, zoals getoond, buffer spoelen met behulp van een serologische pipet, aangezien dit niet alleen een veilige maar ook tijdbesparende procedure.

Tijdens het oogsten en zuiveren van SLB-resident eiwitten het gebruik van detergenten worden vermeden. Dit komt omdat reinigingsmiddel mobiliteit eiwit aanzienlijk zal verminderen, zelfs indien aanwezig in kleine hoeveelheden. De behoefte aan reinigingsmiddel allemaal bij elkaar te omzeilen, is oplosbaar expressie van uitgescheiden polyhistidine-tag voorzien liganden aanbevolen in zoogdiercellen of insectencellen. Als hervouwing van E. coli inclusielichamen vereist, moet voorzichtigheid worden toegepast op detergentia effectief uit de inclusielichamen vóór de aan- en hervouwing verwijder.

Een belangrijk voordeel van het toepassen SLBs resultaten van modulaire en reconstitutive aard, waarmee specifiek ontleden de rol van een gegeven receptor-ligand interactie te celactivering en celadhesie. In dit verband is het belangrijk te vermelden dat DGS NTA-Ni aanwezig dient te zijn bij 10% binnen SLB om eiwitten concurreren om NTA-Ni bindingsplaatsen voorkomen. Bij toepassing SLBs herbergen slechts 1% of 2% DGS NTA-Ni, een vermindering van de associatie van een bepaalde polyhistidine gelabeld eiwit species kan worden opgemerkt, vooral wanneer co-incubatie van toenemende hoeveelheden van een tweede polyhistidine-gemerkt eiwit species (ongepubliceerd observatie). Dit fenomeen wordt niet waargenomen bij het werken met SLBs met 10% DGS NTA-Ni.

Hoewel we nooit waargenomen aspecifieke binding van elke polyhistidine-gemerkt eiwit getest SLBs die DGS NTA-Ni, moet deze mogelijkheid te testen bij de invoering van een eiwit voor het eerst,Daartoe adviseren wij het gebruik van SLBs verstoken van DGS NTA-Ni (het eiwit niet binden). Ten tweede, bij gebruik van een SLB met DGS NTA-Ni, het eiwit moet volledig uit te komen na het wassen van de SLB met PBS dat 300 mM imidazol.

Een ander belangrijk voordeel van het gebruik van SLBs is dat voorbijgaande interacties en signalering evenementen kunnen worden gecontroleerd met een verbeterde spatiotemporele resolutie ^17-19. Dit is ten dele omdat een driedimensionale binding materieel is beperkt tot twee dimensies beeldvorming vooral bij het opnemen in geluidsgevoelige verzwakt TIRF modus. Het gebruik van SLBs is compatibel met single molecule signaaldetectie, een voorwaarde voor een foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) of stochastische optische reconstructie microscopie (STORM), dwz superresolutiemicroscopie met een resolutie onder de diffractielimiet ^15,16. Deze speciale beeldvormende modaliteiten staat enkel molecuul Förster Resonance Energy Transfer experimenten ontworpen om afzonderlijke eiwit-eiwit interacties visualiseren in een omgeving synaptische ^20. Deze aanpak wordt in aanzienlijke detail in een Jove publicatie aangeduid als "Meten TCR-pMHC binding met behulp van een FRET-gebaseerde microscopie test" ^21.

Bij de interpretatie van SLB-gebaseerde experimenten moet men altijd in gedachten houden dat niet alle eigenschappen van een plasma-membraan van een levende cel worden gekenmerkt door SLBs, en dat een deel van de ontbrekende kwaliteiten van de fysiologie in onderzoek kunnen beïnvloeden. Immers, SLB ingebedde eiwitten vrij diffunderen en niet membraan microdomeinen georganiseerd meeste van hun cellulaire tegenhangers ^5,6,22. Geïmmobiliseerde plasmamembraan vellen afkomstig van hechtende cellen, waarbij de plasmamembraan architectuur van levende cellen in zekere mate behouden, zijn succesvol toegepast voor de opname van membraan verankerd antigenen op B-lymfocyten ²³ bestuderen. Zelfs dergelijkemembranen geen interactie met een zeer dynamische cytoskelet en hebben geen flexibiliteit als ze worden ondersteund door een stijf glasoppervlak. Gezien deze verschillen is er duidelijk behoefte aan SLBs techniek, welke middelen bieden eiwitten hokjes in een gedefinieerde wijze en die worden ondersteund door oppervlakken aanpasbare flexibiliteit of oppervlakken die hun stevigheid in reactie op lokaal toegediende lichtpulsen veranderen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
#1.5 glass slides	VWR	631-0853
250ml round bottom flask	VWR	201-1357
50:50 beam splitter cubes	Thorlabs	BS013
Acousto-opitcal modulator C1205-2	Isomet	-	alleen nodig als CW lasers, die niet gemoduleerd kunnen worden, worden gebruikt
Alexa Fluor 488-NHS	Life technologies	A-20000
Alexa Fluor 555-NHS	Life technologies	A-20009
Alexa Fluor 647-NHS	Life technologies	A-20006
autoclave tape	VWR	489-1312	of elk ander hittebestendig plakband
Avanti Mini-Extruder	Avanti Lipids	610000	alternatief voor de bath sonicator
bath sonicator QSONICA Q700	QSONICA	Q700
beam splitter	Cairn	P280/210/MLS
Büchi rotary evaporator	VWR	531-0837
camera	Andor	iXon Ultra 897	zie manuscripttekst voor alternatieven
concentarted hydrogenperoxide	Roth	9683.1
concentrated sulfuric acid	Roth	X944.2
epoxy glue	Uhu	45705	Uhu plus sofortfest 2min
filter wheel	Sutter instruments	Lambda 10-2
LabTek chambers	VWR	734-2062
laser	Toptica	-	verschillende varianten (golflengten 375 - 785 nm) zijn beschikbaar
lens	Thorlabs, Newport	-
DGS NTA-Ni (lipid)	Avanti Lipids	790404C	al in Choroform-opgelost geleverde versie van de nicekl zout variant wordt aanbevolen
POPC (lipid)	Avanti Lipids	850457C	al in Choroform-opgelost geleverde versie wordt aanbevolen
microscope Zeiss Axiovert 200	Zeiss	-
mirrors	Thorlabs	BB1-E02
optical filters	AHF, Chroma, Semrock	-	filter sets zijn beschikbaar voor veel verschillende combinaties van kleurstoffen
oscilloscope	BK Precision	2120C
phosphate buffered saline (PBS)	Life technologies	14190-136	ontgassen voor gebruik
periscope	Thorlabs	RS99/M
picodent twinsil 22	Picodent	13001000	alternatief voor de epoxylijm
power meter Lasermate-Q	Coherent	-	elke powermeter die gevoelig is in het gebruikte spectrale bereik is voldoende
pulse generator	Stanford Research Systems	SRS DG535
spatial filter	Thorlabs	KT310/M
syringe filter 0.2µm	Millipore	GVWP04700
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46	Zeiss	440782-9800-000
trichloromethane/chloroform	Roth	3313.1
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm	Thermo Fisher	45237
Sorvall ultracentrifuge	Thermo Fisher	RC M150GX
ultracentrifuge rotor	Thermo Fisher	S120-AT2
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c	Thermo Fisher	-
vacuum pump	VWR	181-0248