Gemakkelijk en nauwkeurig voor mechanische profilering op MicroPOST Arrays

Samenvatting

Beschreven worden protocollen voor het kwantificeren van mechanische interacties tussen aderente cellen en microgestructureerde substraten. Deze interacties zijn nauw verbonden met essentiële celgedragingen, waaronder migratie, proliferatie, differentiatie en apoptose. De protocollen presenteren een open-source beeldanalysesoftware genaamd MechProfiler, die de bepaling van betrokken krachten voor elke micropost mogelijk maakt.

Samenvatting

Celcultuur substraten met geïntegreerde flexibele microposts stellen een gebruiker in staat om de mechanische interacties tussen cellen en hun directe omgeving te bestuderen. Met name de cel-substraat interacties zijn van belang. Tegenwoordig zijn micropost arrays een goed gekarakteriseerd en gevestigd methode met een breed scala aan toepassingen die zijn gepubliceerd in het afgelopen decennium. Er lijkt echter een aarzeling te zijn onder biologen om de techniek aan te passen vanwege het langdurige en uitdagende proces van micropost fabricage, samen met het gebrek aan eenvoudig toegankelijke software voor het analyseren van beelden van cellen die met microposts interageren.

De krachtaflezing van microposts is verrassend eenvoudig. Een micropost gedraagt zich als een veer waarbij de cel ideaal op het uiteinde is bevestigd. Afhankelijk van de grootte oefent een cel kracht uit vanuit zijn cytoskelet via een of meerdere focale adhesiepunten op de micropost, waardoor de micropost wordt gebogen. De hoeveelheid vervorming correleert direct met de toegepaste kracht in richting en grootte. Het aantal microposts dat door een cel wordt bedekt en de post vervormingspatronen zijn karakteristiek en maken het mogelijk waarden zoals kracht per post en vele biologisch relevante parameters te bepalen die “mechano-profilering” van celfenotypen mogelijk maken.

Een handige methode voor mechano-profilering wordt hier beschreven, die de eerste generatie van kant-en-klare, commercieel verkrijgbare microposts combineert met een in-house ontwikkelde softwarepakket dat nu toegankelijk is voor alle onderzoekers. Als demonstratie van een typische toepassing werden enkele beelden van botkankercellen genomen in helderveldmicroscopie voor mechano-profilering van cellijnmodellen van metastase. Deze combinatie van commerciële tractiekrachtsensoren en open source software voor analyse maakt voor het eerst een snelle implementatie van de micropost array techniek mogelijk in routinematig labwerk dat wordt gedaan door niet-deskundige gebruikers. Bovendien maakt een robuuste en gestroomlijnde analyseproces het mogelijk voor een gebruiker om een groot aantal micropost beelden op een zeer tijd-efficiënte manier te analyseren.

Inleiding

Mechanisch gevoelige cellen gebaseerde assays mogelijk maken onderzoeken hechtende cellen met een breed toepassingsgebied dat de centrale rol kunnen spelen in de mechanica celbiologie weerspiegelen. Deze toepassingen richten zich vaak op de onderliggende mechanismen die subcellulaire processen of whole-cell gedrag sturen. Enerzijds kunnen externe omgevingsfactoren zoals extracellulaire matrix samenstelling of matrix stijfheid dramatische invloed op de mechanische en biologische reactie van een cel. ¹ Hetzelfde kan worden waargenomen na toepassing van vele klassen van farmaceutisch werkzame verbindingen, waarvan de gevolgen zijn vaak gekenmerkt gebruik celkweekmodellen. ² Anderzijds genotypische eigenschappen, zoals die veroorzaakt door spontane of experimenteel geïnduceerde genetische mutaties, kunnen duidelijke veranderingen in cel fenotype die zijn geassocieerd met veranderingen in het cytoskelet structuur en functie induceren. ³ Deze voorbeelden zijn slechts enkele van de vele mogelijkeOnderwerpen waarvoor mechanische fenotypering van cellen is relevant, en al deze zijn nuttig onderzocht met MicroPOST arrays.

Op het moment van dit schrijven, hebben ongeveer 200 artikelen gepubliceerd beschrijven cel-MicroPOST interactie. Deze werken bespreken theoretische aspecten van MicroPOST afbuiging principes en praktische instructies voor de vervaardiging ervan. Het eerste artikel beschrijft de interactie van cellen en flexibele MicroPOST arrays werd gepubliceerd door Tan en collega's in 2003. ⁴ In tegenstelling tot de klassieke trekkracht microscopie (TFM), waar continue zachte substraten worden gebruikt voor het schatten nanonewton schaal cel contractiliteit, Tan et al. beschrijft een werkwijze met meerdere dicht bij elkaar gelegen verticale balken van silicone elastomeer. De belangrijkste voordelen van deze techniek blijken uit twee belangrijke functies. Eerst teneinde de cel-substraat schijnbare stijfheid veranderen men hoeft alleen de MicroPOST afmetingen te veranderen terwijlde substraatsamenstelling overigens gelijkblijvende en aldus verschillen in oppervlakte topologie en chemie vermijden. Tweede micropalen handelen als individuele veren die discreet kan worden geanalyseerd met geweld en ruimtelijke resoluties over de volgorde van de afzonderlijke focale adhesies en kan de analytische uitdagingen die inherent zijn aan een soortgelijk onderzoek door standaard TFM zijn verminderen.

Vandaag is de waaier van toepassingen voor MicroPOST arrays veel groter is dan alleen het in kaart brengen van de krachten voor een paar enkele cellen. Bijvoorbeeld, Akiyama meldt het gebruik van een geïsoleerde dorsale vaatweefsel uit mottenrupsband als een actuator voor een MicroPOST array teneinde een insect spier-powered autonome micro-robot ontwikkelen. ⁵

De meeste gepubliceerde aanvragen van micropalen gericht op studies van medische aandoeningen zoals infecties of kanker. Zo zijn MicroPOST arrays gebruikt om de kracht genereren van gebundelde type IV pili van Neisseria gonorrh bestuderenOEA kolonies die is gekoppeld aan signaalcascades verbeteren infectie. ⁶ Anderen hebben gebruikt om micropalen borstkankercellen behandeld met farmaceutische samenstellingen gericht op de cytoskelet bestuderen. ⁷

Afbuiging van een MicroPOST wordt vaak beschreven met behulp van klassieke bundel theorie voor een cantilever met een end load veronderstelling dat de cel hecht alleen het uiterste puntje van de MicroPOST. Hier is de uitgeoefende kracht F die een afbuiging δ veroorzaakt afhankelijk van de MicroPOST's "buigstijfheid" k en wordt berekend door:

(1)

met E, I en L zijn de Young's modulus, oppervlakte traagheidsmoment en straallengte resp. Echter, de resultaten van deze vergelijking geven slechts een algemene benadering van de krachten op het werk sinds balk snijden en buigen als substraat kromtrekken niet in ac worden genomentellen. Gezien het feit dat micropalen zijn meestal gemaakt van zachte materialen zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) -gebaseerde siliconenrubber deze factoren moeten worden opgenomen. . Schoen et al aangetoond dat er zo'n correctiefactor op basis van de verhouding van de MicroPOST (L / D) en de Poisson verhouding v de overeenkomstige polymeer ⁸ wordt gegeven door.:

(2)

Met T _tilt (v) een kantelbare coëfficiënt die fitting parameter a = 1,3 zoals kan worden gevonden in hetzelfde artikel omvat:

(3)

Dat betekent MicroPOST de gecorrigeerde stijfheid k _corr is het product van de zuivere buigstijfheid k = k _{buigen en} de correctiefactor corrgegeven door:

(4)

Daarom moet cel kracht berekeningen worden uitgevoerd met de meer verfijnde variatie van vergelijking (1) leest nu:

(5)

De impact van de correctie wordt meer duidelijk zodra typische waarden voor MicroPOST afmetingen worden gebruikt. Bijvoorbeeld, een 15-micron lang MicroPOST met een cirkelvormige dwarsdoorsnede en een diameter van 5 urn gemaakt van PDMS-gebaseerde siliconen rubber tot een correctiefactor van 0,77 en dus een gecorrigeerde berekening zou de uitgeoefende krachten cel overschatten met 23%. Dit wordt nog ernstiger voor micropalen met kleinere aspect ratio.

Traditioneel is MicroPOST beeldanalyse ook gebaseerd op geïdealiseerde balk buigen theorie. In 2005 heeft de groep die het gebruik van de MICR pionieropost arrays publiceerde een beeldanalyse-software geschikt voor MicroPOST analyse ⁹ De software vereist een softwarelicentie en de gebruiker moet drie beelden voor elke positie in te nemen.; één elk van de MicroPOST de boven- en onderkant vliegtuigen in de transmissie-modus en een andere in fluorescentie mode met de gekleurde cel. Na vergelijking van de bovenste en onderste posities voor elke MicroPOST bepaalt de software een kracht vectorveld en berekent daarmee samenhangende parameters als kracht per paal. Andere software pakketten bestaan ​​en hun analyse principes zijn kort in de desbetreffende artikelen die ze beschrijven genoemd, maar deze analytische software pakketten zijn over het algemeen niet voor iedereen beschikbaar. ^10,11

De MicroPOST matrices voor mapping cel krachten kunnen worden geclassificeerd als zijnde in een orthogonale MicroPOST layout of een hexagonaal is, waarvan de laatste het voordeel van gelijke afstand tussen alle spleten naaste micropalen. Typische micropalen have een cirkelvormige dwarsdoorsnede en de afmetingen variëren van 1,0 urn tot 10 urn in diameter en 2 tot 50 urn lengte. ⁴ echter micropalen met elliptische of vierkante doorsnede zijn ook gemeld. ^12,13

Het gebruik van PDMS-gebaseerde siliconen mengsels MicroPOST materiaal maakt voor het toevoegen van nanodeeltjes in het mengsel. Bijvoorbeeld het toevoegen van kobalt nano-staven maakt een magnetische activering van de MicroPOST en dus geeft een andere vrijheidsgraad om potentiële experimentele ontwerpen. ¹⁴ De meeste groepen produceren hun MicroPOST arrays op vlakke harde ondergronden zoals dekking van glas of in een petrischaal. Echter, Mann en collega meldde onlangs een MicroPOST matrix gevormd op een uitrekbaar membraan. ¹⁵ Dit maakt de toepassing van cel strekkrachten hechtende cellen tijdens de studie levende cellen subcellulaire dynamische responsen qua cel contractiliteit.

De alom gebruikte en meest Estabsteld werkwijze voor het maken MicroPOST arrays gebaseerd op zachte lithografie zoals beschreven in de protocollen van inzichtelijke Sniadecki en collega. ^16-18 Kortom standaard cleanroom processen worden toegepast om de microstructuren op een siliciumwafer gebruikt SU8 fotoresist genereren. Daarna volgt een kopieerproces waarbij de siliconenrubber gegoten via structuren overzetten in mallen. In een tweede stap deze schimmels worden gebruikt om de oorspronkelijke microstructuur behulp siliconenrubber op een gekozen substraat repliceren. Maar ondanks de grote en groeiende aantal publicaties in verband met de toepassing ervan, de oprichting van een productieproces voor micropalen neemt aanzienlijke hoeveelheid tijd, zelfs voor micro-technische deskundigen; er zijn veel processtappen die optimalisatie en aanpassing aan de specifieke testomgeving en MicroPOST lay-out nodig om een ​​acceptabel kwaliteitsniveau opleveren.

Commerciële MicroPOST arrays zijn nu beschikbaar in een kant-en-to-gebruik ("off-the-shelf") formaat met een constante hoge kwaliteit. Als zodanig zijn ze een alternatief voor de complexe en tijdrovende productieproces vereist ter plaatse produceren. In dit artikel werd een commercieel verkrijgbaar MicroPOST serie gebruikt voor het in kaart brengen cellulaire krachten afbeelding één helder-veld microscopie gebruikt. Nog belangrijker is dit artikel beschrijft en documenteert een volledig functionele open-source software genaamd MechProfiler, die beschikbaar zijn voor download als aanvullend materiaal om dit manuscript is. Een actief gehandhaafd versie van de software is ook te vinden op http://www.orthobiomech.ethz.ch.

De combinatie van een "off-the-shelf" test en een compatibele open-source analyse software aanzienlijk verlaagt de ingang hindernis om nauwkeurige TFM experimenten te bereiken. Onderzoekers zonder toegang tot ofwel clean room faciliteiten of de ontwikkeling van software ervaring met succes kan analyseren cellulaire krachten. Het stelt een gebruiker om zich te concentreren op het mechanosensitivity assay uitgang in plaats van de technologie zelf, en maakt trekkracht metingen beschikbaar om een ​​bredere gemeenschap. Bovendien is dit een belangrijke stap op de weg naar volledig automatische screening van MicroPOST arrays effenen.

De MechProfiler analyse software verwerkt afbeeldingen in bestandsformaat tiff, png, bmp en jpg. De beelden kunnen worden gemaakt met behulp van fluorescentie, fase contrast of fel-veld lichtmicroscopie. Het standalone programma loopt samen met de vrije Matlab Compiler Runtime (verkrijgbaar bij: Figuur 12) en de onderliggende algoritmes mogelijk maken gestroomlijnde beeldverwerking, waarmee de gebruiker om beelden met één of meerdere cellen te verwerken ongeveer 1 min. Verder kunnen deze cellen ofwel levend of "vast".

De MechProfiler software kan aanzienlijk verhogen gegevensanalyse throughput beroept op reproduceerbaarheid van de kwaliteit commerciële MicroPOST arrays, meer bepaald de standaard & #8220, niet afgebogen "-positie van elk record in de array kan worden aangenomen tegenover een ideale rooster (fabricageafwijkingen voor het raster in de arrays gebruikt voor deze studie minder dan 100 nm).

Kortom men opent een selectie van beeldbestanden voor analyse, gewassen ze naar de regio van belang, bepaalt de ambten waarop cellen of die moeten worden weggegooid, bepaalt de post posities, berekent de doorbuiging / krachten tegen de ideale raster, en ten slotte slaat alle cel-specifieke gegevens met de mogelijkheid voor de export, met inbegrip van een standaard kantoor spreadsheet.

Protocol

1. het kweken van cellen op MicroPOST Arrays

Opmerking: Alle stappen moeten in een bioveiligheid kast worden uitgevoerd om de steriliteit te waarborgen. De hier gegeven volumes zijn voor T25 celcultuur flessen. Het celkweekmedium recept en cellen zaaidichtheid zijn geoptimaliseerd voor botkanker cellijnen HuO9 en M132.

1. Bereid een celkweek voor het zaaien op een MicroPOST array.
   1. Inspecteer de celkweek kwaliteit door het plaatsen van de kolf op een standaard lichtmicroscoop. Ervoor zorgen dat de cellen een normale groei en morfologie door het schatten hoeveel van de kweekfles bodem bedekt. Een dekking van 70% -80% weerspiegelt een gezonde groei. Besteed aandacht aan het bedrag van de drijvende cellen als zij vertegenwoordigen dode cellen en / of een begroeide cultuur.
   2. Trypsinize cellen door het verwijderen van medium en wassen met 4 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer. Voeg 0,8 ml 1x trypsine / Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en incubeer bij kamertemperatuur totdat de cels los te die ongeveer 2-4 minuten duurt. Controleer het proces met de microscoop en tik soms de kolf voorzichtig naar loskomen ondersteunen.
   3. Voeg 5 ml celkweek medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) / F12 met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptavidine (Pen / Strep)) om de reactie te stoppen en wassen residuele cellen die nog zitten op de bodem van de fles. Pipetteer vervolgens deze suspensie op en neer meerdere malen om een ​​homogeen mengsel te krijgen. Zorg ervoor dat alle oplossingen in de oorspronkelijke groeigebied van de kolf pipet om een ​​effectieve loskomen krijgen.
   4. Breng de celsuspensie in een 15 ml buis en centrifugeer met behulp van een tafelblad centrifuge bij 0,5 xg gedurende 3 min.
   5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml medium op en neer te pipetteren 5 keer. Zorg ervoor dat de generatie voorkomen van bellen tijdens het doen.
   6. Bepaal celdichtheid met behulp van een cel telkamer en een licht Micrpe. Controleer de celsuspensie in cel telkamer voor mobiele aggregaten en ervoor te zorgen dat slechts enkele cellen hebben voor de volgende experiment. Pipetteer weer omhoog en omlaag meerdere keren de cellen de neiging om aggregaten te scheiden vormen.
   7. Verdun de celsuspensie met voldoende medium een ​​celoplossing van 25.000 cellen / ml te verkrijgen. Meng het goed door het omkeren van de gesloten buis meerdere malen.
2. Bereid een MicroPOST array voor cel zaaien.
   Kritische noot: niet pipet op de MicroPOST serie direct als dit zou kunnen schadelijk zijn voor de micropalen, vooral wanneer ongewenste luchtbellen worden geïntroduceerd. Bovendien, zorg ervoor dat de MicroPOST reeks droogt nooit uit als optredende capillaire krachten leiden tot het instorten van de micropalen.
   1. Plaats het glazen substraat met de matrix MicroPOST boven in een putje van een 12-wells plaat met behulp van een pincet en nat door toevoeging van 1 ml ethanol (99%). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20-30 sec.
   2. Verdun de ethanolstapsgewijs door toevoeging van ongeveer 1 ml steriel gedeïoniseerd water (DI water) aan de put kant en aanzuigen ongeveer 1 ml met behulp van een overdracht pipet of aspiratorinrichting. Herhaal deze stap ten minste 3 maal.
   3. Vervang de DI-water met PBS-buffer op dezelfde wijze door het toevoegen en aspireren ongeveer 1 ml. Herhaal deze stap 3 keer.
   4. Vervang de PBS-buffer met medium door het toevoegen en aspireren ongeveer 1 ml medium. Herhaal deze stap 3 keer.
3. Pipetteer 1 ml celoplossing (25.000 cellen) bovenop elkaar bereide MicroPOST array. Close multiwell-plaat en overgebracht naar een incubator (5% _CO2, 37 ° C). Laat de cellen hechten en te groeien op de top van micropalen voor 6 -7 uur.
4. Controleer de hechting proces af en toe met behulp van een licht microscoop. Controleer dat de meeste van de cellen lijken verspreid over meerdere micropalen.

2. Bevestiging & kleuring Cellen

Opmerking: Alle stappen envolumes hier gegeven zijn voor een enkel putje van een 12-wells plaat. Aanbevolen verwerken niet meer dan vier van de twaalf putjes tegelijk om uitdroging van de putjes te voorkomen na afzuigen van elke vloeistof, die zal leiden tot een instorting van de micropalen.

1. Zuig medium uit de put en was cellen 2x met 1 ml PBS-buffer. Zorg ervoor dat u een zachte kracht toe te passen tijdens het wassen met PBS tot cel puin dat zich op het MicroPOST serie tijdens incubatie te verwijderen en om de dode cellen los.
2. Fixeer de cellen met 0,5 ml 3,7% gebufferde formaldehyde-oplossing gedurende 5 min.
3. Vervang de formaldehyde-oplossing door het wassen van de MicroPOST serie 2x met 1 ml steriel DI water.
4. Vlekken op de cellen met kleurstof (0,05% Coomassie Brilliant Blue in 50% water, 40% ethanol en 10% azijnzuur) gedurende 90 sec. Was de overtollige kleuroplossing af 2x met 1 ml steriel DI water. Voeg 1 ml DI water array MicroPOST.
5. Controleer vlekken resultaat met behulp van een lichtmicroscoop. Herhaal tHij kleuring stap, als cel lichaam is te zwak om te worden gevisualiseerd.
6. WINKEL MicroPOST arrays met gekleurde cellen geplaatst in een koelkast bij 4 ° C. Ervoor te zorgen dat ze onder water te houden ten alle tijden.

3. Cell Imaging

Opmerking: Stap 4 geldt alleen voor microscopen zonder oneindig gecorrigeerd optiek.

1. Voeg 2 ml DI-water op een petrischaal met een dunne glazen bodem voor hoge resolutie beeldvorming.
2. Overdracht MicroPOST array met behulp van een pincet in de beeldvorming schaal met de micropalen omhoog.
3. Plaats de imaging petrischaal op een beweegbare fase van een lichtmicroscoop.
4. Draai de compensatiering van de gebruikte lens voor het afbeelden dat het nummer op de schaal staat voor de totale dikte van alle materialen langs de optische baan te compenseren voor de mismatch in brekingsindex van het glazen substraat, de silicone-elastomeer en de vloeistof op. Dit moet leiden tot een heldere weergave van de micropalenkernen.
5. Sluit de iris op de verlichting naar beneden tot 50% en verwijder eventuele fasecontrast ringen van het optische pad waardoor een gewone heldere-veld modus.
6. Lijn de MicroPOST array die de micropalen vormen een horizontale lijn over het veld observatie. Definieer een startpunt (bijvoorbeeld linksboven) en beweeg de petrischaal stapsgewijs over het podium het scannen van de MicroPOST serie terwijl het nemen van een groot aantal beelden.
7. Neem alle beelden met de hoogste resolutie-instelling voor de camera met een 20x of 40x objectief. Doel om een ​​cel in het midden van het beeld heeft.
8. Vegen langs de z-as door het substraat tot de MicroPOST tips zijn in focus. Gebruik de fijnafstemming nadruk wiel van de microscoop en zet hem in de richting van de nadruk op de MicroPOST bodem voor ongeveer 2-3 urn.
9. Stelt een standaard beeldvorming procedure door het nemen reeks testbeelden van een reeks sectie vegen door de beeldvorming parameters één voor één (bijvoorbeeld, belichtingstijd,iris instelling, lamp instellingen etc.). Analyseer beelden met MechProfiler en bepalen van een geschikte parameter set voor een snelle en betrouwbare analyse.

4. Image Analysis met Open Source Software "MechProfiler"

Opmerking: Alle software functies kunnen worden geactiveerd met een aanwijsapparaat met de linker muisknop. Toch zal een getrainde operator de gedocumenteerde sneltoetsen ontworpen om op de linkerhelft van het toetsenbord om een ​​efficiënte twee-handed beeldverwerking mogelijk te maken.

1. Start beeldanalysesoftware MechProfiler en open een reeks van beelden die moeten worden geanalyseerd door te klikken op "Open".
2. Steek alle parameters in de sectie "Instellingen" gegeven door de softwareontwikkelaar. Bepaal de parameters die aangepast moet worden ingesteld (bijv contour drempel en minimale afstand) volgens de gedetailleerd beschreven door de software handmatige procedures.
3. Afbeelding analyserens één voor één door te snijden ze naar het gebied van belang met behulp van "Crop" (klik en sleep met de muisknop ingedrukt). Dubbelklik in de getekende rechthoek om deze actie te voltooien.
4. Op iedere zichtbare cel outline één voor één door te klikken op "Trek cel contouren" en het gebruik van het kruis haar cursor voor tekenen met inbegrip van alle micropalen de cel is gekoppeld.
5. Gooi alle ongewenste micropalen door te klikken op "Gooi berichten" en het gebruik van het kruis haar cursor voor het tekenen. Sluit alle micropalen die tot een cel buiten het beelddeel of die afgebogen om een ​​andere reden hebben ze niet de cel van belang.
6. Start de software subroutine "Find centroïdes" door muisklik. Pas de filter instellen naast de "Find centroïdes" knop totdat alle micropalen geregistreerd, die zichtbaar is door een rood kruis in hun midden. Als de filter instelling te laag is micropalen worden genegeerd, als het te hoog multiple posities worden gemarkeerd voor een enkele MicroPOST. Houd het filter instellen constant gedurende een analyse sessie.
7. Gebruik de handleiding editing-functie "Handmatig bewerken" voor centroïden met meerdere of gemiste MicroPOST posities. Gebruik de muis kruis haar om de MicroPOST in kwestie selecteren door te klikken en te slepen over. Dubbelklik binnen de rechthoek en plaats de ontbrekende rode marker in de uitgebreide sectie beeld, dat automatisch sluit. Gooi zo'n MicroPOST wanneer deze buiten de getekende cel omtrek (zie stap 4.5) voordat u verder gaat.
8. Vind de ideale MicroPOST rooster door het activeren van de "Generate Grid" functie met een muisklik. Zorg ervoor dat de positie komt overeen met de ware MicroPOST hoofd, blijkt uit een blauwe ring, binnen de getekende cel omtrek.
9. Corrigeren misplaatste rooster maker in de cel waar nodig met behulp van de bijbehorende functie "Manuel Bewerken" met een muisklik. Gebruik het kruis haar om de MicroPOST in Qu selecterenestion door te klikken en te slepen over. Dubbelklik in het verschijnen rechthoek en plaats de ontbrekende blauwe markering in de uitgebreide sectie beeld, dat automatisch sluit.
10. Gebruik de knop "Bereken Doorbuigingen" met een muisklik om een ​​histogram van de berekende doorbuiging waarden op basis van het verschil tussen de positie van een MicroPOST's in de beelduitsnede en de gegenereerde ideale rooster krijgen.
11. Sla de volledige analyse inclusief de tabellen van waarden door een muisklik op "Opslaan".
12. Blijven de beeldanalyse, hetzij door te klikken op "Reset View 'en een ander beeld sectie of muisklik op" Next Image ", die gemakkelijk kan worden gedaan met behulp van de juiste toetsenbord cursor key analyseren.

5. Data Analysis - Mechanoprofiling

1. Open het bestand "results.xls" met een kantoor spreadsheet-programma uit de map met de beelden geanalyseerd. Het bevat de gegevens all berekende waarden waaronder alle MicroPOST doorbuigingen en standaard afgeleide maatregelen, zoals het werk (dwz substraat deformatie energie) van de geanalyseerde cel.

Resultaten

Het belangrijkste voordeel van de beschreven techniek ligt in de eenvoud en de mogelijkheden voor snelle en effectieve integratie in routine laboratoriumwerk. De combinatie van commerciële sensor arrays van hoge kwaliteit gecombineerd met open-source software geeft informatie over mechanisch-gevoeligheid die anders toegang tot de cleanroom faciliteiten en diepgaande kennis van de beeldanalyse en de ontwikkeling van software zou nodig. Figuur 1 toont de workflow van de gepresenteerde methode. Het begint ...

Discussie

Dit werk tracht het gebied van trekkracht microscopie vooraf door substantieel verlagen van technische en praktische belemmeringen voor de toegang. Deze belemmeringen van twee kanten komen. Eerst en vooral zijn de talloze niet-triviale technische uitdagingen die moeten worden overwonnen om reproduceerbaar vervaardigen en experimenteel Commissie MicroPOST array. Ten tweede, is het eveneens niet-triviale behoefte aan een betrouwbare semi-automatische analyse van cel krachten - rekening houdend dat een typisch experiment d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera