Multifunctionele, Micropipet-gebaseerde methode voor opname en het stimuleren van bacteriële mechanosensitieve Ion Channels in Droplet Interface dubbellagen

Summary

Bacteriële mechanosensitieve kanalen kunnen worden gebruikt als mechanoelectrical transducers in biomoleculaire inrichtingen. Droplet-interface dubbellagen (DIB), cel-geïnspireerde bouwstenen om dergelijke apparaten, vertegenwoordigen nieuwe platforms op te nemen en te stimuleren mechanosensitieve kanalen. Hier tonen we een nieuwe micropipet gebaseerde werkwijze voor het vormen van DIB, waardoor de studie van mechanosensitieve kanalen onder mechanische stimulatie.

Abstract

MscL, een grote geleidbaarheid mechanosensitieve kanaal (MSC), een alomtegenwoordige osmolyt ventiel dat helpt bacteriën overleven abrupte hypo-osmotische schokken. Ontdekt is en grondig bestudeerd met de patch-clamp techniek bijna drie decennia. De sleutelrol van het vertalen aangebracht op het celmembraan in respons permeabiliteit spanning maakt het een sterke kandidaat te functioneren als mechanoelectrical omzetter artificiële membraan gebaseerde biomoleculaire toestellen. Die als bouwstenen dergelijke apparatuur kan druppeltje interface-bilagen (DIB) worden gebruikt als een nieuw platform voor de integratie en stimulering van MscL kanalen. We beschrijven hier een micropipet gebaseerde methode DIB vormen en meten van de activiteit van de gebruikte MscL kanalen. Deze methode bestaat uit een lipide omhuld waterige druppeltjes verankerd aan de uiteinden van de twee tegengestelde (coaxiaal gepositioneerd) borosilicaatglas micropipetten. Als druppels in contact worden gebracht, een lipidebilaag interfacegevormd. Deze techniek biedt controle over de chemische samenstelling en de grootte van elke druppel, alsmede de afmetingen van de bilaag interface. Met een van de micropipetten bevestigd aan een harmonische piezoelektrische actuator biedt de mogelijkheid om een ​​gewenste oscillerende stimulus leveren. Door middel van analyse van de vorm van de druppeltjes tijdens deformatie, kan de spanning gecreëerd op het grensvlak worden geschat. Met deze techniek wordt de eerste activiteit van MscL kanalen in een DIB-systeem gerapporteerd. Naast MS-kanalen, kunnen de activiteiten van andere soorten kanalen worden bestudeerd met behulp van deze methode, waaruit blijkt dat de multi-functionaliteit van dit platform. De hier gepresenteerde methode maakt het meten van fundamentele membraaneigenschappen, verschaft een grotere controle over de vorming van symmetrische en asymmetrische membranen en is een alternatieve manier te stimuleren en studie mechanosensitieve kanalen.

Introduction

In het afgelopen decennium is de assemblage van artificiële lipidendubbellagen aanzienlijk gevorderd door de ontwikkeling van de druppel-interface dubbellaag methode. Bekend als stabiel en robuust, DIB zichzelf opgelegd als alternatief model systemen om de klassieke geschilderde (Mueller) en gevouwen (Montal-Mueller) vlakke dubbellagen ^1. Hoewel het idee van het gebruik van druppels te lipidendubbellagen creëren dateert uit de jaren 1960 ^2, is het niet aan populariteit gewonnen tot voor kort. De eerste succesvolle poging werd gerapporteerd door Takeushi groep ^3, gevolgd door verscheidene studies tonen dubbellaagsformatie via een netwerk van druppels door de Bayley groep ^4-6. Meer recent, werden inkapseling technieken voorgesteld door de Leo groep ^7-9, die het concept van het gebruik van DIB's als bouwstenen van nieuwe stimuli-responsieve materiaal systemen ¹⁰ pionier. In eerdere studies, hebben DIB hun vermogen om te reageren op de elektrische ^9,11, chem bewezeniCal ^10,12, en optische stimuli ^13. Verschillende biomoleculen met verschillende stimuli-responsieve functionaliteiten zijn effectief gestimuleerd wanneer opgelost in het DIB ^10,14. In het licht van deze succesvolle pogingen een belangrijke vraag wordt opgeworpen: zou de DIB reageren op mechanische stimulus waar nodig biomoleculen zijn opgenomen? Het grensvlak krachten die op een DIB verschillen van die in andere bilaag systeem ^15,16. Daarom kan de spanning in de bilaag bezit van de druppels worden geregeld door de spanning op het water-lipide-olie interfaces; een concept niet van toepassing met de geschilderde of gevouwen bilayer systemen.

MscL kanalen, alom bekend als osmolyt vrijkomen kleppen en fundamentele elementen van de bacteriële celmembraan, te reageren op verhoogde membraan spanning ^17,18. Bij hypo-osmotische schok, meerdere kanalen die in het membraan van een kleincellig ¹⁹ kan een mas genererensive permeabiliteit reactie op snel ionen en kleine moleculen vrij te laten, bespaart bacteriën uit lysis ^20. Biofysisch wordt MscL goed bestudeerd en in de eerste plaats gekenmerkt door de prominente patch clamp techniek ^21-23. Betrouwbare structurele modellen uitleggen MscL's gating mechanisme ^24,25 worden voorgesteld op basis van zijn homoloog de ​​kristalstructuur ^26,27, het modelleren van ^28, en de resultaten van uitgebreide experimenten ^24,29-31. Onder een aangelegde spanning van ~ 10 mN / m, de gesloten kanaal dat bestaat uit een dichte bundel van transmembraan helices, transformeert in een ring van sterk gekantelde helices vormen van een ~ 28 een met water gevulde geleidende poriën ^21,24,32. Ook is vastgesteld dat de hydrofobiciteit van de strakke poort, geplaatst op het snijpunt van de binnenste TM1 domeinen, bepaalt de activeringsdrempel van het kanaal ^33. Dienovereenkomstig bleek dat door het verminderen van de hydrofobiciteit van de poort, het tension drempel kan worden verlaagd ^22. Deze eigenschap van MscL mogelijk gemaakt het ontwerp van de verschillende bestuurbare kleppen ^34, voornamelijk voor drug delivery doeleinden. Voor alle genoemde eigenschappen en op basis van de fundamentele rol van het vertalen celmembraan overmatige spanningen in elektrofysiologische activiteiten, MscL maakt een goede pasvorm als mechanoelectrical transducer in DIB's.

In dit artikel presenteren we een originele-micropipet gebaseerde methode om DIB vormen en meet de activiteit van de opgenomen MscL kanalen onder mechanische stimulatie. Wij rapporteren voor het eerst de reactie van DIB mechanische stimulus en de functionele reconstitutie van de V23T laagdrempelige mutant van MscL in DIB ^35.

Het experimentele systeem bestaat uit lipide omhulde waterige druppeltjes verankerd aan de uiteinden van twee tegengestelde borosilicaatglas micropipetten. Als druppels in contact worden gebracht een lipidebilaag interface is formed. Deze techniek biedt controle over de chemische samenstelling en de grootte van elke druppel (bulk), alsook de afmetingen van de bilaag interface. Bovendien kan asymmetrische membranen met verschillende lipidesamenstellingen in elk blad gemakkelijk worden gevormd. Met een van de micropipetten bevestigd aan een harmonische piëzo-elektrische actuator, biedt de mogelijkheid om een ​​voorgeprogrammeerde enkelvoudige cyclus of oscillerende stimulus toepassen. De spanning wordt geleverd aan de artificiële membraan door het samendrukken van beide druppels ondersteunen. Door druppel vervorming, de wateroppervlakken lipide-olie interfaces verhogen en tegelijkertijd de hoek tussen de druppeltjes af, waardoor een toename van de membraan spanning en voorbijgaande MscL activatie. Door middel van analyse van de vorm van de druppeltjes tijdens deformatie, kan de spanning gecreëerd op het grensvlak worden geschat. Hoewel de focus in dit artikel op de mechanisch-transductie eigenschappen van de DIB, ook benadrukken dat andere soorten biomoleculen zoals alamethicin kunnen worden geactiveerd door deze multifunctionele platform. We presenteren hier alle technische aspecten bereiden, assembleren en metingen met deze nieuwe werkwijze een stap voor stap manier.

Protocol

1. Bereiding van PEG-DMA Hydrogels

1. Selecteer een geschikte meet- / mengen container (fles, beker, enz.) Voor de toepassing. Reinig het grondig met water en zeep, en veeg het daarna met pluizende tissue ruitenwissers.
2. Draag handschoenen om te voorkomen dat besmetting van het glaswerk met olie uit de vingertoppen. De container spoelen met voldoende gedeïoniseerd water om schoonmaakmiddel te verwijderen.
3. Veeg de container met pluisvrije weefsel om zich te ontdoen van het water te krijgen, dan spuit met isopropylalcohol (IPA, 99,5%) en veeg tot schoon. Plaats het in een vacuümkamer om alle IPA volledig verdampen. Reinig de rest van het laboratorium apparatuur die wordt gebruikt in de hydrogel vormingsproces met gedestilleerd water.
4. Ter voorbereiding van een 40% (w / v) PEG-hydrogel DMA oplossing Weeg 4 g poly (ethyleen-glycol) dimethacrylaat (PEG-DMA; MW = 1000 g / mol) polymeer met een laboratoriumschaal.
5. Plaats de gewogen PEG-DMA in de kolf en warmte met behulp van een sonicator bad bij 45-55 ° C totdat de vaste PEG-DMA is vloeibaar. Tijdens het proces, hebben betrekking op de opening van de kolf met Parafilm / vetvrij papier om water buiten te houden.
6. Nadat de PEG-DMA is vloeibaar, voeg bufferoplossing (500 mM KCI, 10 mM MOPS, pH 7,0) tot totaal volume bereikt ~ 10 ml (genoeg voor meerdere experimenten een periode van zes maanden).
7. Voeg verharder in 0,5% (w / v). In dit geval, voeg 0,05 g van het hardingsmiddel aan het mengsel 10 ml. Plaats de kolf terug in de ultrasoonapparaat bad en laat de componenten op te lossen in oplossing (ongeveer 10 min, 250 watt).

Opmerking: Als het hardingsmiddel toegevoegd aan de oplossing, zal de hydrogels harden (stollen) indien blootgesteld aan een lichtbron gedurende een voldoende tijdsduur. Te helpen bestrijden dit, wikkel de flacon / container met zwarte tape en bewaar het op een donkere plaats. Deze oplossing kan worden bewaard gedurende enkele weken bij kamertemperatuur (22 ° C).

2. Voorbereiding van liposOMES

1. Maak 10 ml van een 2 mg / ml lipide door toevoeging van 10 ml buffer (500 mM KCI, 10 mM MOPS, pH 7,0) met 20 mg 1,2-diphytanoyl- sn-glycero-3-fosfocholine (DPhPC) synthetische lipiden gekocht als gevriesdroogd poeder. Zorg ervoor dat zowel lipide blaasjes en bufferoplossing worden grondig gemengd (het mengsel moet homogeen en wazig kijken wanneer alles wordt opgelost).
2. Freeze (-20 ° C) en volledig ontdooien de nieuwe lipide mengsel in totaal zes keer. Laat het mengsel ontdooien bij kamertemperatuur, niet in een verwarmde omgeving.
3. Met behulp van een commercieel verkrijgbare extruder, extruderen van de lipiden door het forceren van het gehele lipide suspensie eerst door een 0,4 um polycarbonaat membraanfilter en vervolgens zes maal door een 0,1 urn membraanfilter. Dit proces levert deeltjes met een diameter nabij 100 nm (gelijk aan de poriegrootte van de filter).

OPMERKING: Andere lipiden en lipide-ratio's kunnen worden bereid met behulp van deze mijThOD. Liposomen worden bewaard bij 4 ° C gedurende enkele weken.

3. MscL Isolatie en Reconstitutie

1. Streak een temperatuur agarose plaat, die 100 ug / ml ampicilline, E. MJF465 coli-cellen met een plasmide dat het pB10b V23T MscL gen uitgebreid met een 6-His tag op het 3 'uiteinde (C-uiteinde). Laat de plaat kweek overnacht (12-16 uur) bij 37 ° C in een stationaire incubator. De plasmide wordt geselecteerd en vastgehouden in cellen met 100 ug / ml ampicilline in standaard LB-medium. De volgende dag plaats 20 ml LB medium met 100 ug / ml ampicilline in een kweek vesicle (een 50 ml kolf of welke beschikbaar is voor de cultuur houden). Neem de plaat die 's nachts werd gekweekt en selecteer een kolonie van de plaat over te dragen (te enten) naar de voorbereide 20 ml LB media met een steriele inenting stick. Laat de kweek 20 ml overnacht (12-16 uur) groeien bij 37 ° C bij 250 rpm in een schudincubator.
2. Schenk de 20 ml overnechts cultuur in 2-4 L van LB-medium. Ampicilline is niet meer nodig. Schud de kolven in een schudincubator bij 250 rpm bij 37 ° C totdat _OD600 0,5 bereikt. Add Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) tot een uiteindelijke concentratie van 0,6 mM en de kweek laat gaan nog een uur (OD ₆₀₀ = 0,8-1,0).
3. Zet de kolven op het ijs aan de culturen relaxen en dan het verzamelen van de bacteriën door centrifugeren. Gebruik zes 400 ml conische buizen (of zoveel als toegestaan ​​door de rotor gebruikt) en centrifugeer gedurende 5-8 minuten bij 7438 xg wat genoeg is om de bacteriën te pelleteren. Giet het supernatant en herhaal de procedure totdat alle cellen van de media worden geoogst. Het aantal spins nodig is afhankelijk van de hoeveelheid van de cultuur die is gegroeid en de rotor gebruikt. Voor een 2 L cultuur Het is alleen nodig om spin down de cellen eenmaal. Breng alle geoogste cellen in een centrifugebuis.
4. Resuspendeer de celpellets in ~ 20 ml French press buffer (100 mM KPi en 5 mM _MgCl2, pH 7,4). De schorsing moet dichte (zoals room of melk) zijn. Onmiddellijk voor Franse indrukken van de suspensie toevoegen van de proteaseremmer fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) tot een eindconcentratie van 2 mM en meng krachtig.
5. Franse pers van de cultuur, in een 35 ml Franse druk cel, op 10.000 tot 16.000 psi. Spin down de schorsing te scheiden van de ongebroken cellen bij 7438 xg, 10 min bij 4 ° C.
6. Doe de supernatant in een aparte buis en aan te vullen lysozym en DNase (0,2 mg / ml elk). Laat bovenstaande tuimelen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

OPMERKING: DNase is optioneel; het vermindert de viscositeit van de hoge snelheid centrifugatie. Lysozyme is kritisch; verteert de restanten van celwanden en helpt bij het verhogen van de opbrengst van het membraan extractie uitgevoerd met een mild niet-denaturerend detergens.

7. Verdeel het supernatant mengsel in twee ultracentrifuge buizen en draaien ze op106,883-153,911 xg (afhankelijk van de rotor) bij 4 ° C gedurende 40 min. Na centrifugatie wordt het supernatant gedecanteerd en de bruine pellet onderin (de totale membraanfractie) kan in de buis worden ingevroren voor langdurige opslag (- 80 ° C) of voor directe eiwitzuivering.
8. Bereid 0,5-1 L High imidazool buffer: 100 mM NaCl + 500 mM imidazool, titreren tot pH 7,2-7,4 met geconcentreerd HCl. Merk op dat imidazol is een goede buffering stof op zich.
9. Bereid 0,5-1 l Laag imidazool buffer: 100 mM NaCl, 15 mM imidazool +, door het geschikt verdunnen van de hierboven buffer 100 mM NaCl. Geen pH aanpassing vereist.
10. Neem 100-150 ml van elke buffer in afzonderlijke flessen en voeg 1% (w / v) b-octyl- glucopyranoside (OG). Roer de oplossing goed en filteren het door een 0,22 pm filter. Deze oplossingen zijn de lage en hoge imidazool chromatografie oplossingen.
11. Bereid Extractiebuffer, neem 50 ml Low-imidazool buffer en voeg 3% (w / v)OG en filteren de buffer.
12. Gebruik membraan pellets van 0,5-2 g vers gewicht voor eiwit isolatie. Voeg 5-7 ml extractiebuffer, resuspendeer de pellet en homogeniseren in een 30 ml met de hand aangedreven glas-zuiger homogenisator. Met 5-10 zachte bewegingen maken een homogene suspensie zonder klonten. Wees voorzichtig, is shear stress bekend dat eiwitdenaturatie veroorzaken.
13. Spin down de onoplosbare deeltjes (mid-range centrifuge, een vaste hoek rotor, 38,478-68,405 xg bij 4 ° C gedurende 15 min). Ondertussen, neem 3 ml Ni NTA-parels (6 ml suspensie) en was ze eenmaal met de lage-imidazool buffer (w / o OG) door schudden ze in een 15 ml schroefdop buis. Laat de parels op de bodem is (~ 5-7 min) of spin ze neer op 129-201 xg gedurende één minuut bij 4 ° C. Zodra de korrel wordt gevormd, zorgvuldig decanteer de bovenstaande vloeistof met de hand en herhaal de procedure. Equilibreer de bolletjes met 2-3 ml 3% OG extractiebuffer.
14. Meng het gehomogeniseerd mengsel (membraan pellet en extractie buffer) van 3.12 met 3-3,5 ml Ni NTA-parels. Laat de mix tuimelen in een schroefdop buis gedurende 60 minuten (batch-loading). Spin de kralen neer op 201 xg (30 sec), decanteren van de bovenstaande vloeistof met de hand, en was de kralen met 1% OG low-imidazoolbuffer keer. Pellet de kralen als in 3,13 weer en resuspendeer ze in 20-30 ml vers low-imidazool buffer.
15. Pack een kleine kolom (uitgerust met een bovenste stroom adapter) met de Ni NTA kralen, en laat de kralen te regelen door het openen van de kraan te laten het extract stroom door (niet toestaan ​​dat de kralen te drogen). Was de kralen met een hoeveelheid van 10 ml lage imidazoolbuffer (1% OG) met de afsluiter geopend.
16. Laad de chromatografie machine met zuivere lage en hoge imidazol buffers ongeveer 25 ml van elk van de machine bepaald debiet (verschilt per machine); Dit gebeurt door het passeren van de lage-imidazool buffer via het systeem eerst. Zero de optische recorder bij OD ₂₆₀ (baseline). Merk op dat de buffer is heel anders dan water, omdat laagwaardige imidazool heeft impurities die UV absorberen. Steek de stroom adapter aan de kolom en bevestig deze aan de machine.
17. Was de kolom opnieuw met lage-imidazool buffer (bij 1 ml / min) totdat de OD van de stroom door komt de basislijn bereikt (10-20 ml kan duren). Dit verwijdert de niet-gebonden eiwitten uit de kolom.
18. Breng een lineaire gradiënt van imidazool 20 tot 500 mM, gedurende 30 min bij 1 ml / min. Beginnen met het verzamelen 4 ml fracties bij OD ₆₀₀ toont een stijging. De eerste twee fracties vol losjes gebonden eiwitten, terwijl MscL-6His elutie begint bij ~ 40% van het lineaire verloop. Het merendeel van het eiwit wordt in fracties 3-8.
    Opmerking: een lineaire toename van de OD wordt waargenomen als gevolg van de toenemende% imidazool.
19. Verzamel de fracties 3-4, 5-6 en 7-8 samen. Eventueel concentreer de fracties afzonderlijk. Concentreer de fracties 6-10 voudige gebruikt centrifugale filters. Na 20 min centrifugeren op 804 xg en 4 ° C, voorzichtig resuspendeer de geconcentreerde proteïneoplossing,het eiwit heeft de neiging vast te houden aan het filter.
20. Intrekken 50 ul fracties, meng ze met SDS-monsterbuffer, en controleer eiwitzuiverheid gebruik PAGE gel elektroforese.
    OPMERKING: MscL migreren als een vage band van ongeveer 17 kDa aan de bodem van de gel.
21. Gebruik de geconcentreerde fracties met het eiwit met een eiwit assay kit kwantificeren, na instructies van de fabrikant. Een typische opbrengst uit 0,8 g membraanpellet is aan 0,2 mg zuiver eiwit in de gecombineerde fracties.
22. Reconstrueren V23T MscL in DPhPC liposomen door middel van dialyse. Neem een 10 mg / ml oplossing van chloroform DPhPC en 0,5 ml monster (bijvoorbeeld 5 mg lipide) ervan in drie disposable rondbodem (12 x 130 mm) glazen buizen. Droog het lipide onder stikstofstroom en verwijder de restanten van chloroform onder vacuum (4-6 uur).
23. Voeg 15 20 mg poedervormig OG de droge lipide in elke buis, oplossen in 2 ml dialyse buffer (100 mM KCl, 5 mM KPi, pH 7,2), vortex, en mildly ultrasone trillingen. De OG opgelost lipiden moet een heldere oplossing te vormen.
24. Voeg geconcentreerde V23T MscL oplossingen voor elke buis te realiseren 1: 100, 1: 300 en 1: 1000-eiwit tot lipideverhoudingen en vortex goed. Knippen en wassen drie stukken (~ 12 cm lang) van dialysebuizen (MWCO 8000, 7,5 mm diameter, hebben drie paar genummerde clips klaar.)
25. Plaats de gesolubiliseerde lipide-eiwitmengsels in de buis, de uiteinden met klemmen zorgvuldig sluiten en dialyseren tegen 2 L buffer (100 mM KCl, 5 mM KPi, pH 7,2) gedurende 48 uur bij 4 ° C met vier veranderingen van de buffer elke 12 uur. Na dialyse, de proteo-liposomen zijn klaar.

Opmerking: De liposoomoplossing kan worden aangevuld met 2 mM NaN3 (natriumazide) en bewaard bij 4 ° C. Vermijd bevriezen.

4. Productie van het oliereservoir

1. Boor twee tegenoverliggende gaten (1,0 mm) helemaal door de wand van een 2 inch diameter, 1,5 cm lang cyl acrylicinder op 1 cm van de bodem (figuur 1A).
2. Boor twee 4 mm gaten concentrisch met het eerder geboorde gaten 1 mm. De diepte van de gaten moet 1 mm elke (zorg ervoor dat niet helemaal te boren). Deze openingen zijn gemaakt om de rubber pakkingen passen.
3. Plaats en lijm twee rubberen dichtingen met 1 mm binnendiameter in de grotere gaten om te voorkomen dat olie lekt.
4. Lijm de bewerkte cilinder een 10 cm x 10 cm dunne acrylplaat met elke multifunctionele epoxy (figuur 1).

Op de dag van het experiment:

5. Bereiding van elektroden

1. Snijd een 7 cm lengte van twee 250 pm diameter zilver draden, en vervolgens onder te dompelen hun tips in bleekwater gedurende twee uur op een zilver-chloride (AgCl) coating te vormen. Een grijze kleur geeft aan dat een AgCl coating is gevormd (Figuur 2E).
2. Met behulp van een glassnijder, split een 10 cm lang, 1 / 0,58 OD / ID mm borosilicate klasse capillary in twee 5 cm haarvaten.
3. Met behulp van een 34 gauge Microfil naald vul de haarvaten van de PEG-DMA hydrogel. Om te voorkomen dat de gehydrateerde hydrogel van zwelling van het capillair, houdt een 3 mm speling aan de uiteinden en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de haarvaten.
4. Plaats de Ag / AgCl elektroden in de hydrogel gevulde capillairen (Figuur 2E).
5. Hard de PEG-hydrogel DMA via vrije radicaal fotopolymerisatie bij blootstelling aan UV licht gedurende 2 min bij 1 W met UV-spot pistool.

6. Instellen van de Experiment

NB: Het experiment is opgezet in het kader van een kooi van Faraday geaard om een ​​massa-aansluiting op de patch versterker.

1. Bevestig een van de micropipetten om een rechte micro-elektrode houder die een mannelijke connector (Figuur 2E) heeft.
2. Sluit de micro-elektrode houder aan de headstage van de patch versterker (Figuur 2A). Om de hea sluitendstage aan de grond, soldeer een 18 gauge geïsoleerde koperdraad om een ​​passende connector voor de headstage.
3. Monteer de headstage op een 3-assige handleiding micromanipulator. Bevestig de headstage montageplaat (het moet worden gekocht, samen met de micromanipulator of op maat gemaakt in een machine winkel) aan de micromanipulator en sluit vervolgens de headstage op de montageplaat met behulp van geschikte schroeven.
4. Bevestig de tweede micropipet op de lineaire actuator via een lab gemaakt connector en monteer vervolgens beide aan een tweede micromanipulator (Figuur 2B). De micropipetten moeten elkaar te verzetten, uitgelijnd, en horizontaal geëgaliseerd. Let op: het merk en de stijl van de manipulatoren er niet toe doen.
5. In een glazen flesje, mix 0,1 ml van de DPhPC liposomen met 0,01 ml van de V23T MscL proteoliposoom oplossing.

OPMERKING: Deze stap is nodig om het eiwit tot lipideverhouding (~ 0,0002), die kritiek is voor de vorming van een stabiele lipide bilaye verminderenr.

6. Met behulp van een 34 gauge Microfil naald, vul de tips van beide micropipetten met proteoliposoom oplossing (figuur 3A).
7. Plaats reservoir boven een rechtopstaande microscoop en voer de micropipetten door de tegenoverliggende openingen 1 mm (figuur 2B). OPMERKING: elke microscoop konden zo lang op de druppels duidelijk kan worden gezien worden gebruikt.
8. Vul het reservoir naar het oppervlak met hexadecaan (99%). De hexadecaan geen verdere zuivering nodig.
9. Aan de kogelvormige druppels bij het uiteinde van de micropipetten vormen, gebruikt een 3 10 urn diameter borosilicaatglas micropipet, gemonteerd op een 3 micromanipulator om verdunde V23T MscL proteoliposoom oplossing (~ 0,00052 ml) aan de uiteinden van de micropipetten afgeven en vormen de druppeltjes (Figuur 3).
10. Om de grootte van de druppels (door het verlagen of verhogen van het volume) als gewenst en laat ze rusten 10 minuten voor de monolagen volledig vormen (FIGUUR 3).
11. Breng de druppels in contact wordt dubbellaagsformatie die binnen 1 tot 2 min.

7. Instellen van de software en apparatuur

1. Bereid de software door te draaien op de computers, microscoop, piëzo-elektrische oscillator controller, functie generatoren, patch-versterker, en de low-noise data-acquisitie systeem.
   OPMERKING: elke patch versterker kan worden gebruikt en de volgende instructies zijn specifiek voor degene die we gebruikt, en die is opgenomen in de materialen en apparatuur lijst.
2. Op het voorpaneel van de patch versterker, zet u de "Mode" knoppen om VHOLD / IHOLD en V-klem.
3. Op het voorpaneel zet de "Lowpass" Bessel Filter tot 1 kHz en Output Gain 2.
4. Stel de "Configuration" om volledige cel β = 1.
5. Zorg ervoor dat de rest van de knoppen zijn ingesteld op nul of in de neutrale stand.
6. Proef alle DIB huidige metingen op 5 kHzmet een 1 kHz Bessel anti-aliasing filter.
7. Het uitvoeren van software door te dubbelklikken op het pictogram op het bureaublad.
8. Klik op 'Configure> Digitizer "om de" digitizer "dialoog te openen, en klik op de knop" Wijzigen ".
9. In de "Change digitizer" dialoog te selecteren "Digidata 1440 Series" in de lijst "Digitizer Type".
10. Klik op de knop Scannen om de digitizer detecteren.
11. Klik op "OK" om de "Change digitizer" dialoog te sluiten, en klik vervolgens op "OK" om de "digitizer" dialoog te verlaten.
12. Klik op 'Configure> Lab Bench ".
13. In het tabblad Input Signalen van het lab Bench, selecteert Analog in een onder Digitizer Channels. Zet de schaal factor 0,002.

8. De vorming van de lipidedubbellaag

1. Met behulp van een BNC-kabel, sluit de uitgang van awaveform generator om de externe opdracht ingang vooraan ingeschakeld (op het paneel van de data-acquisitie systeem achter). Stuur dan een 10 Hz, 500 mV pk tot pk driehoekige golfvorm aan de headstage.
2. Met behulp van de micromanipulator, beweeg het glas micropipetten horizontaal tot druppeltjes in contact te brengen totdat ze iets aanraken en wacht bilayer dunner optreden (meestal rond de 1-2 min) (Figuren 3C en 3D).

OPMERKING: Progressie van de bilaag vormingsproces kan visueel worden waargenomen door de microscoop en kan worden gevolgd door stroommetingen (figuur 4).

3. Pas de bilaag grootte (~ 250 urn diameter) door het regelen van de positie van de druppel aangebracht op de actuator, met de micromanipulator. Opmerking: de bilaag maat kunnen visueel door de microscoop worden geschat. Deze methode maakt het voor de onderzoeker om de grootte van de bilaag regelen door eenvoudigbewegen de druppels met de micromanipulators.

9. Dynamische excitatie en MscL Gating

1. Nadat de bilaag gevormd en is stabiel (dat wil zeggen de dubbellaag niet breekt of geleidend), het stimuleren van de druppeltjes door toezending van een sinusvormig signaal met een functiegenerator.
2. Om de MscL eiwit opgenomen in de bilaag te stimuleren, om een ​​sinusvormige golfvorm met een 175 urn piek-tot-piek amplitude, 0,2 Hz en 50% duty cycle voor de piëzo-elektrische servo-controller. (Diverse soorten golfvormen kunnen worden gestuurd met verschillende amplitudes, frequenties en duty cycle)

10. Verwerking en interpreteren van resultaten

1. Sla de huidige meting, opgenomen met de data-acquisitie systeem, .ABF formaat. Gegevens importeren (in .ABF formaat) naar Matlab met behulp van een functie bestand "abfload", vervolgens analyseren en verwerken van de gegevens. De "abfload" bestand is beschikbaar voor gratis online.
2. Schatting tHij spanning in de bilaag en gebieds uitbreiding van de druppels, met video's van de druppel tijdens de volledige bediening cycli die worden opgenomen met behulp van een geschikte camera.
3. Werkwijze's in Matlab, door verwerking van losse frames gebruikt beeldverwerkingstechnieken op het gebied van de water / olie-interface, evenals de hoek tussen de druppeltjes te schatten. Opmerking: het gebruik van een 2D raamwerk uit de video, detecteert het water-olie-interface (dat wil zeggen de rand van de druppel) en een schatting van de oppervlakte van revolutie.

Results

Figuren 1 en 2 tonen de experimentele opstelling en uitrusting om eiwitactiviteit te nemen in de loop van mechanische stimulatie van de lipide dubbellaag membraan. Elektrische ruis in onze metingen te minimaliseren, is het werkstation geplaatst in een lab gemaakt kooi van Faraday, geaard om een ​​massa-aansluiting op de Axopatch 200 B versterker.

De vorming van een stabiele isolerende lipide bilaag is een belangrijke stap in deze studie. In deze opstelling, een lipide monolaag assembleert het olie / water grensvlak van de waterige druppeltjes ondergedompeld in een bad van een organisch oplosmiddel. Wanneer druppels in contact worden gebracht, wordt overtollige olie verwijderd, en de tegenstander lipide monolagen dun om een ​​twee-molecuul dik lipidedubbellaag. De meest voorkomende techniek die op bilaag karakterisering voltage-clamp. Met voltage-clamp, is de spanning over de bilaag op een constante waarde, terwijl de stroom wordt gemeten. Figuur 4 portretteert een typische real-time huidige opname van de initiële dubbellaagsformatie. Het kennen van de specifieke capaciteit (~ 0,6 uF / cm ^{2) 5} van de DPhPC lipide bilaag, zou de oppervlakte van de gevormde dubbellaag berekend. De dubbellaag gebied kan worden bestuurd door de positie van de druppels (Figuur 4A). Met de piëzo-elektrische actuator, kunnen verschillende golfvormen (sinus, vierkant, driehoekig, enz.) Op verschillende frequenties, amplitudes en werkcycli worden toegepast op de druppeltjes horizontaal en axiaal oscilleren hen en daardoor kunnen bilaag spanning en ruimte worden gewijzigd (Figuur 4B).

Wanneer de DIB mechanisch gestimuleerd, terwijl een constante DC potentiaal over het membraan, een lage drempelwaarde (gain-of-function) V23T mutant van MscL genereert betrouwbare activiteiten waaronder voornamelijk sub-geleidende toestanden en soms volledige opening events (figuur 5) . Deze eventen zijn identiek aan die zijn opgenomen met de patch-clamp techniek uit intacte E. coli binnenste membranen en liposomen gereconstitueerd met het gezuiverde V23T MscL. De resultaten in figuur 5 tonen dat gating ontstaat als reactie op een toename van de spanning, omdat alle stroompieken waargenomen op maximale compressie. Bij piek compressie, de relatieve areal uitbreiding van de druppeltjes maximaal is en dus spanning op het grensvlak maximaal is.

Alamethicin, een voltage-gated ionkanaal en een van de meest bestudeerde peptiden verhoogt de membraanpermeabiliteit wanneer een DC spanning wordt aangelegd over het membraan ^36. Het vermogen van de lipide bilaag interface transmembranaire eiwitten en peptiden gastheer wordt getest door het uitvoeren van spanning gating stroom opnames via alamethicin peptide. Alamethicin gemengd met de fosfolipide-oplossing tot een eindconcentratie van 100 ng / ml. Figuur 6 toont de actuele metingen onder spanningsklem (115 mV). De druppeltjes in dit experiment uit elkaar getrokken om kleine bilaag interface en dus hogere weerstand en kleinere capaciteit te bereiken. De gating gedrag van de Alamethicin peptide weergegeven door discrete stappen stroom (figuur 6). Het histogram aan de rechterkant van de grafiek geeft het verloop geleiding van het basisniveau (0,0962 nS), die in feite de eerste geleidbaarheid van het kanaal zelf.

Figuur 1:. Een schematische beschrijving van de belangrijkste onderdelen en de afmetingen van het oliereservoir Het oliereservoir wordt geproduceerd in de werkplaats op Virginia Tech. Het bestaat uit een machinaal cilindrische acrylbuis vastgelijmd aan het oppervlak van een acrylplaat. De afmetingen en het ontwerp kunnen worden aangepast aan verschillende toepassingen of meer dan twee micropipetten tegemoet./53362/53362fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2:. Experimentele opstelling en micropipetten preparaat (A) De standaard werkplek voor het vormen, mechanisch stimuleren en karakteriseren van de interface bilagen omvat een microscoop, 3-assen manipulatoren, een digitale camera, piëzo-elektrische oscillator, trillingsisolatie tafel, en een kooi van Faraday (niet laten zien). (B) De experimentele opstelling bestaat uit twee tegengestelde PEG-DMA hydrogel gevuld micropipetten horizontaal geplaatst in een bad van hexadecaan olie. Elk van de micropipetten bevat een Ag / AgCl elektrode elektrische verbinding. Een derde micropipet gevuld met proteoliposoom oplossing wordt gebruikt om de druppels bij het uiteinde van de andere micropipetten vormen. (C) Het DIB huidige respons kan worden gemeteneen combinatie van de pleister versterker en ruisarme meetsysteem. (D) een gesloten showing waterige druppeltjes gevormd aan het uiteinde van de micropipetten. (E) Ag / AgCl elektroden door dompelen het uiteinde twee 250 urn zilveren draden in bleekwater. De elektroden worden vervolgens door twee borosilicaatglas capillairen gevuld met PEG-DMA hydrogel, die wordt uitgehard met UV-licht te stollen. Directe micro-elektrode houder met mannelijke connector wordt gebruikt om één van de micropipetten om de headstage van de pleister versterker.

Figuur 3:. Beelden illustreert de vorming van bilagen druppel-interface (A) A 10 micrometer micropipet gevuld met proteoliposomen wordt geplaatst onder de microscoop in de nabijheid van de micropipet tips. Met behulp van een injectiespuit verbonden met de micropipet, afzien kleine volumesvan de proteoliposomen bolvormige druppeltjes gewenste volume te vormen. Laat de monolaag vorm doordat de druppels te zitten voor tien minuten. Breng de druppels in contact; de bilaag zal vormen immers olie op het grensvlak wordt geëlimineerd. (B) Terwijl de dubbellaag wordt gevormd, kan de chemische samenstelling op beide zijden van de interface worden geregeld door het injecteren van gewenste chemicaliën behulp van een micro-sized micropipet. (C) De druppels op het moment van het eerste contact. (D) de druppeltjes bij de lipide dubbellaag wordt gevormd.

Figuur 4: Real-time metingen tonen de initiële verdunning en daaropvolgende expansie van de interface (A) Current gemeten in de loop van dubbellaagsformatie door toepassing van een driehoekige elektrische potentiaal.. De grootte van de gemeten stroom is direct evenredig met de capaciafstand en daarmee het gebied van de bilaag interface. Hoe dichter de druppels worden samengebracht, hoe groter de oppervlakte van de interface en vice versa. (B) bij toepassing van mechanische excitatie, het gebied van de bilaag-interface verhoogt en verlaagt op dezelfde frequentie als stimulerend signaal.

Figuur 5:. Real-time metingen tonen de respons van de bilaag mechanische excitatie en de gating van de V23T mutant van MscL De vorm van de huidige respons sinusvormig, betreffende een sinusvormige verandering van de bilaag capaciteit als gevolg van de bilaag wijzigen. De stroompieken, die zich op de top van elke cyclus, duiden sub-geleiding gating van de V23T mutant. Een polaire plot geeft verder aan dat gating optreedt op de piek van de compressie, die een toename van de spanningen in de bilaag-interface weerspiegelt.

Figuur 6:. De huidige metingen onder spanning klem en bijbehorende histogram van geleiding niveaus voor gating activiteit van opgenomen Alamethicin kanalen De gating gedrag van de Alamethicin peptide wordt aangetoond door middel van de discrete stapsgewijze verhoging van de stroom. De geleiding niveaus passen heel goed bij eerdere metingen uitgevoerd door onze onderzoeksgroep op Virginia Tech ^7.

Discussion

Mechanosensation betekent een van de eerste zintuiglijke transductie routes die vrijkomt bij levende organismen. Met behulp van dit fenomeen voor het bestuderen en begrijpen van de mechanisch-elektrische eigenschappen van de DIB, is een cruciale stap in de richting van functionele stimuli-responsieve materialen. Het gaat om de integratie en activering van mechanosensitieve kanaal MscL in het DIB als mechanoelectrical transducer en een spanningsmeter spanning toename van de lipide bilaag-interface detecteert. Op een andere nota, kan de functie van MS kanalen worden geregeld door middel van de fundamentele materiaaleigenschappen van lipidendubbellagen waaronder dikte, intrinsieke kromming, en samendrukbaarheid. Gezien het voorgaande is de micropipet gebaseerde techniek een waardevol instrument waarmee de onderzoeker de mogelijkheid om MS kanalen DIB bestuderen en geeft inzicht in de structuur van de lipide bilaag, en de lipide-eiwit interacties.

In de afgelopen drie decennias, patch-clamp was de primaire methode voor MS kanalen bestuderen, aangezien het klemmen van zowel de spanning en spanning. Echter, patch-clamp vereist omvangrijke uitrusting en niet geschikt voor miniaturisatie, een eigenschap die nodig is voor de engineering van sensorische en conversie apparaten. DIB vanwege hun eenvoud, stabiliteit en compactheid vormen een geschikte omgeving om de activiteit van MscL bestuderen. Hier breiden wij eerdere ontwikkelingen in de DIB formatie technieken stellen een micropipet gebaseerde techniek, met de mogelijkheid om de grootte van de druppels en dubbellaag-interface, de chemische samenstelling van elke druppel en de spanning aan het grensvlak via dynamische stimuleringsstuureenheid. De techniek bestaat uit het verankeren waterige druppeltjes, met proteoliposomen, de uiteinden coaxiaal tegenoverliggende glazen capillairen. De druppels worden in een bad van organisch oplosmiddel geplaatst en toen in aanraking gebracht een lipide bilaag vormen aan het grensvlak.

De micropipetten zijn aan piezoelectric oscillatoren, waardoor horizontale verplaatsing van de druppels. Dynamisch comprimeren van de druppeltjes, resulteert in een toename van grensvlakspanning aan het water oliegrensvlak en dus een toename van bilaag spanning. Twee belangrijke aspecten onderscheiden deze methode van de vergelijkbare en recent gepubliceerde contactgegevens bubble dubbellaag (CBB) techniek ^37. De hierin gepresenteerde techniek is de grootte van de bilaag gecontroleerde behulp micromanipulators en daarmee de omvang van de druppeltjes constant blijven, in tegenstelling tot de werkwijze CBB. Bovendien, het CBB techniek vraagt ​​om drukpompen, die in de in dit document maakt het eenvoudiger en gemakkelijker te bouwen werkwijze nodig zijn.

We kunnen nemen en te stimuleren bacteriële MscL voor het eerst zonder het gebruik van een pleister pipet of chemische modificaties ^38. Aangezien het systeem vergemakkelijkt de vorming van sterke asymmetrische lipide dubbellaag membranen, ze beter bootst de lipid asymmetrie gevonden in biologische membranen. Dit stelt ons in staat om de effecten van gecontroleerde membraan samenstelling of asymmetrie studie over de activiteit van MscL. Bovendien, door middel van beeldverwerkingstechnieken, helpt deze methode schatting van de spanning in de bilaag interface. Deze techniek helpt bij het begrijpen van de principes van interconversie tussen massa en oppervlaktekrachten in het DIB, vergemakkelijkt de metingen van fundamentele membraaneigenschappen, en verbetert het inzicht van MscL reactie op spanning membraan.

Hoewel deze methode neemt een stap dichter naar een biomoleculaire stimuli-responsieve materiaalsysteem en een verschillende fysiologische omgeving MscL studie, zijn er beperkingen aan het systeem. Spanning in dit systeem kan niet worden vastgeklemd door de aanwezigheid van de lipide reservoir in de vorm van liposomen in elk druppeltje, die de neiging heeft ook spanning op de olie / water interface. Derhalve thans mechanosensitieve kanalen gestimuleerdin DIB slechts in een dynamische regime. De aanwezigheid van luchtbellen in het systeem aanzienlijke invloed op de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de experimenten. Luchtbellen in de hydrogels kunnen verliezen als de elektrische aansluiting leiden.

Hoewel we beschrijven het gebruik van de micro-pipet methode voor het stimuleren van MscL, kan de techniek worden gebruikt om andere typen MS kanalen bestuderen en heeft het potentieel om te worden gebruikt door onderzoekers voor verschillende biomoleculen te bestuderen. Zo is gelijkaardige opstelling gebruikt in ons lab de mechanoelectrical respons van een kanaalvrije droplet-interface dubbellaag membraan te bestuderen. Verschillende eiwitten kunnen worden aangemaakt en geactiveerd met behulp van deze zeer gecontroleerde opstelling, waarbij in overweging dat de reconstructie omgevingen van elk biomolecuul variëren. De werkwijze beschreven in dit artikel raakt aanzienlijk ruimere toepassingsmogelijkheden die alleen beperkt tot de verbeelding van de onderzoeker.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filter	Corning	430624
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)	Avanti Polar Lipids	850356P	Aangeschaft als gelyofiliseerd poeder
34-gauge microfil	World Precision Instruments	MF24G-5
400 mL Centrifuge bottels	ThermoFisher	3141	Nalgene
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz	Keysight Technologies	33220A
Ampicillian	ThermoFisher	BP1760	ACS Grade
Avanti® Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610000
Axio Scope.A1	Carl Zeiss	-
AxioCam HSm	Carl Zeiss	-
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	-
BCA protein assay kit	Pierce	23225
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator	Digi-Key	BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Dialysis tubing	7 Spectra/Por	132113	MWCO 8000, 7.5 mm diameter
DigiData 1440A system	Molecular Devices	-
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
DPhPC	Avanti	850356C
E-625 PZT Servo-Controller	Physik Instrumente	E-526
FPLC System	Pharmacia Biotech	-
HCl	J.T. Baker	9535-33
Hexadecane, 99%	Sigma-Aldrich	544-76-3
Homoginizer	Wheaton	357426	15 mL
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513
IPTG	Affymetrix	17886
IRGACURE® 2959	IRGACURE®	555047962
Isopore Membrane Filters	EMD Millipore	VCTP02500
Isopropyl Alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACS Grade
KH2PO4	Mallinckrodt	7100	ACS Grade
Kimble-Chase	Kontes	420401-1515	Flex-Column
LED-100 UV Spot Curing System	Electro-Lite, corp.	81170
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Manual Patch-Clamp Micromanipulators	Thorlabs	PCS-520N
MgCl2	ThermoFisher	M33	ACS Grade
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MEH1S
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000
MOPS, minimum 99.5% titration	Sigma-Aldrich	M1254-100G
N2 Gas	Airgas	UN1066
NaCl	EMD	SX0420-1	ACS Grade
Ni NTA agarose beads	Qiagen	1000632
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID	McMaster-Carr	8486K545
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator	Physik Instrumente	P-601
PAGE gel	Bio-Rad	456-9033
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film	Parafilm®	PM999
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate	Polysciences, Inc.	15178-100
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk	Sterlitech Corporation	PCTB0425100
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405-500G
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves	VWR International	CA89-38-272
Replacement Gasket 1.0mm	World Precision Instruments	GO1-100
SDS	Sigma-Aldrich	L5750
Silver wire	GoodFellow	147-346-94	Different diameters kunnen worden gebruikt afhankelijk van de toepassing
Sodium Azide	Affymetrix	21610
Test tubes	ThermoFisher	14-961-27	12 x 130 mm
Tryptone	ThermoFisher	BP1421
Ultracal 30K	Millipore	UFC803024	Amicore Ultra 30 MWCO
VWR Light-Duty Tissue Wipers	VWR International	82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner	VWR International	13089
Water Purifier	Barnstead	D11931
Yeast	ThermoFisher	BP1422
β-octylglucopyranoside	Anatrace	O311S