Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Samenvatting

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Samenvatting

Aangezien gespecialiseerde mobiele immuuncellen, planten gebruiken hun gelokaliseerd geprogrammeerde celdood en Systemic Acquired Resistance zich te verdedigen tegen de pathogene aanval. De bijdrage van specifieke Arabidopsis gen de gehele installatie immuunreactie kan specifiek en kwantitatief bepalen van het pathogeen groei binnen het geïnfecteerde weefsel geëvalueerd. Voor meer dan drie decennia is de hemibiotrophic bacterie Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) op grote schaal toegepast als het model ziekteverwekker naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de Arabidopsis immuunrespons te onderzoeken. Ziekteverwekkers in het blad weefsel te leveren, hebben meerdere enting methoden is vastgesteld, bijvoorbeeld, spuit infiltratie, dip inenting, spray, vacuüm infiltratie en vloed inenting. Het volgende protocol beschrijft een geoptimaliseerde injectiespuit infiltratie methode om virulente Psm ES4326 leveren in bladeren van volwassenbodem geteelde Arabidopsis planten en nauwkeurig scherm voor verbeterde ziektegevoeligheid (EDS) in de richting van deze ziekteverwekker. Bovendien kan dit protocol worden aangevuld met meerdere pre-behandelingen verder te ontleden specifieke immuun gebreken binnen verschillende lagen van de verdediging van planten, met inbegrip van salicylzuur (SA) -Triggered Immuniteit (STI) en MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Inleiding

Door hun sessile aard zijn installaties voortdurend bedreigd door een overvloed aan ziekteverwekkers vertonen verschillende leefstijlen en voedingswaarde strategieën ^1. Om een eerste benadering, biotrofe ziekteverwekkers behouden hun gastheer in leven om voedingsstoffen te halen, terwijl necrotrofe ziekteverwekkers actief geheim toxines en enzymen aan gastheerweefsel doden en voeden zich met de dode cellen ^1. Een andere groep van ziekteverwekkers, genaamd hemibiotrophs begint hun infectie uiteraard met biotrofe podium en verschuift naar de necrotrofe podium op een bepaalde drempel van pathogeen accumulatie ² bereiken. Om zich te verdedigen tegen deze micro-organismen, planten hebben een ingewikkelde aangeboren immuunsysteem uitgerust met meerdere toezichtmechanismen het pathogeen aanval detecteren en trigger ontwikkeld gelokaliseerde geprogrammeerde celdood ³ en systemische verworven resistentie (SAR) ^4. Lopend onderzoek is gericht op het karakteriseren van de essentiële signaling componenten en cross-gesprekken binnen de plant immuunsysteem ^5.

Zoals in de "Zig-Zag" model ⁵ voorgesteld, de eerste laag van de plant aangeboren immuunrespons vereist de aanwezigheid van plasma-gelokaliseerde receptoren Pattern Recognition (PRRS) om de invasie van microben te detecteren. PRRS kunnen Microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMPs) erkennen en vast MAMP-Triggered Immunity (MTI) ^6. Naast het induceren van een transcriptionele opregulatie van genen die coderen voor antimicrobiële PR proteïnen ^7, MTI leidt tot een verscheidenheid van gebeurtenissen die de groei van pathogenen, waaronder de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en Reactive stikstofspecies (RNS), afzetting van callose aan de celwand arrestatie alsook de activering van meerdere kinase signaalwegen ^8.

Tot nu toe zijn verscheidene MAMPs geïdentificeerd aan MTI veroorzaken bij Arabidopsis, waaronder bacteriële flg22 ⁹ (Een 22 aminozuur fragment afgeleid van flagelline), elf18 ¹⁰ (18 aminozuren van de bacteriële vertaling elongatiefactor Tu) en een structureel celwandcomponent Peptidoglycanen ^11. Om een succesvolle infectie vast te stellen, hebben een aantal gespecialiseerde pathogenen de mogelijkheid om geheime virulentie effector eiwitten geëvolueerd in de intracellulaire en intercellulaire ruimten, en dus MTI onderdrukken en trigger Effector-Triggered Susceptibility (ETS) ^12,13. Zo kan virulentie effectoren mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) fosforylatie cascades van MTI inactiveren om de ziekteontwikkeling bij het ​​geïnfecteerd weefsel ^14-16 induceren. Tijdens de dynamische co-evolutie tussen gastheren en pathogenen, planten ontwikkelde ook de tegenaanval strategie om de effector-eiwitten herkennen en verzwakken de ziekteverwekker virulentie moleculen ^17. Deze directe of indirecte effector erkenning wordt gemedieerd door ziekteresistentie (R) ¹⁸ eiwitten. De meeste tboord zijn lid van de NB-LRR (Nucleotide Binding en leucine-rijke herhalingen) gezin ^19. De perceptie van een avirulent effector door een R-eiwit lokt een sterkere en bredere immuunrespons gekenmerkt als Effector-Triggered Immunity (ETI) ^20. Naast het induceren van de expressie van verdedigingsgenen ²¹ en de productie van metabolieten verdediging ^22, ETI leidt vaak tot een snelle gelokaliseerde geprogrammeerde celdood genoemd overgevoeligheidsreactie (HR) het pathogeen mag niet in het aangrenzende weefsel ³ te beperken.

Naast de gelokaliseerde geprogrammeerde celdood ²³ planten zijn in staat tot het initiëren van een langdurige en systeembrede immuunreactie genoemd Systemic Acquired Resistance (SAR) ^4. Bij provocatie met biotrofe pathogeen, plantencellen leiden tot de biosynthese en de accumulatie van een endogeen plantenhormoon salicylzuur (SA) en PR proteïnen in zowel lokale en systemische weefsels ^24. DezZijn werkwijze wordt een verhoogde staat van paraatheid bereikt de geïnfecteerde bladeren die het mogelijk maakt de montage sneller verdedigingsresponsen bij een volgende infectie door een breed spectrum van pathogenen ^24. SA en zijn synthetische analogen zoals benzo- (1,2,3) -thiadiazol-7-carbothiozuur S methyl ester (BTH) en 2,6-dichloroisonicotinic acid (INA) kunnen chemisch induceren salicylzuur (SA) -Triggered Immunity (STI) op externe applicatie ^24. Nonexpressor van pathogenese verwante genen 1 (NPR1) wordt voorgesteld als een van de SA receptoren en werkt als een belangrijke transcriptionele regulator during SA-gemedieerde verdediging respons in zowel lokale als systemische weefsels ^21,25,26 zijn. Er is overtuigend aangetoond dat NPR1 nodig voor SAR inrichting en het verlies van NPR1 leidt tot dramatische gevoeligheid richting Pseudomonas syringae ^25.

Om op grote schaal te karakteriseren van de moleculaire bijdrage van plantaardigecomponenten in de plant-pathogeen interacties, zijn meerdere bioassays ontwikkeld om specifieke afweer gebeurtenissen te meten, met inbegrip van ROS barsten ^27, callose afzetting ^28, defensie genen expressie en accumulatie van hun eiwitproducten ^21. Hoewel deze individuele testen inzicht kunnen geven in een specifieke vorm van de plant immuunrespons, geen ervan zijn echter in staat de volledige afweerreactie op het hele plant niveau te vertegenwoordigen. Omgekeerd kwantificering van pathogene groei na infectie geeft een algemene inschatting van de immuunrespons op het organismale niveau. Daarom is de ontwikkeling en optimalisatie van een nauwkeurige en zeer gestandaardiseerde pathogeen inoculatie test is kritisch voor tanken onderzoek en ontdekkingen op het Arabidopsis immuunreacties.

Pseudomonas syringae, een Gram-negatieve bacterie, werd geïdentificeerd als fytopathogenen kunnen veroorzaken ziekte bij een reeks van plantaardige gastheren Arabidops²⁹ is. Als modelplant-pathogeen-systeem, de Arabidopsis - P. syringae interactie is op grote schaal toegepast om de moleculaire mechanismen te begrijpen onderliggende verdediging van planten reacties ^29. Tot nu toe meer dan 50 P. syringae pathovars zijn geïdentificeerd op basis van hun vermogen om verschillende plantensoorten ³⁰ infecteren . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst ^DC3000) 31 en P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) ³² zijn de twee meest gebruikte en uitgebreid gekarakteriseerd virulente stammen. Afgezien van wordt erkend door de plant en triggeren de MTI reactie, Pst DC3000 en Psm ES4326 kunnen uitscheiden virulente effector eiwitten aan MTI onderdrukken en leiden ETS aan de pathogeen groei ^31,33 bevorderen.

Functioneel ontleden de interactie tussen Arabidopsis en P. syringae, multiple0; pathogeeninfectie werkwijzen zijn ontwikkeld op basis van het pathogeen levering aanpak. Voor-grond geteelde planten, kan pathogeen worden geleverd met een spuit infiltratie, vacuüm infiltratie, dip inenting en spuit inenting ^29,34. Onlangs werd seedling vloed inoculatie assay ontwikkeld voor grootschalige schermen voeren op weefselkweekplaten volwassen jonge Arabidopsis planten ^35. Spuit infiltratie, als een van de meest gebruikte aanpak levert handmatig organisme in de apoplast via natuurlijke openingen blad genoemd huidmondjes ^29. Door deze benadering gelijke hoeveelheden P. syringae kunnen worden geïnfiltreerd in de geïnfecteerde blad en de kracht van planten immuunrespons is omgekeerd gecorreleerd met de pathogeen groei levels. Daarom kwantificering van pathogeen groei dient als een optimale aanpak van het immuunsysteem te evalueren op het hele plant niveau. Bovendien kunnen spuit infiltratie lokale en systemische weefsels te onderscheiden, die be in het karakteriseren van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen SAR ³⁶ van toepassing.

In de volgende protocol beschrijven we een geoptimaliseerde spuit infiltratie test met Psm ES4326 tot Arabidopsis mutanten voor verbeterde ziektegevoeligheid (EDS) te screenen. Dit protocol zal twee Arabidopsis genotypen in dienst: een wild-type ecotype Columbia-0 (Col-0) planten (controle) en npr1-1 verlies-van-functie mutanten (hypersusceptible) dat zal worden geïnfecteerd met virulente bacteriële stam Psm ES4326 ^37. De npr1-1 mutant draagt ​​een puntmutatie in de ankyrine-repeat consensussequentie van NPR1 molecuul, dat de sterk geconserveerde histidine tot tyrosine verandert en maakt het eiwit niet-functioneel ^25. Daarnaast is een aantal modificaties van de injectiespuit infiltratie assay beschreven die kwantificering van defecten in specifieke lagen van de immuunrespons, zoals MTI en STI toestaan.

Protocol

De volgende tekst beschrijft een stapsgewijze protocol te verrichten geoptimaliseerd Psm ES4326 spuit infiltratie test in Arabidopsis. Bekende procedures voor deze proef zijn weergegeven in een vereenvoudigd stroomdiagram (figuur 1).

1. Plant Groei Voorwaarden

1. Sow zaden
   1. Bereid 2 potten (4 in diameter, 3,75 in lange) losjes gevuld met grond en water potten door ze te weken uit de bodem O / N voor het aftappen van het overtollige water.
   2. Zaaien 50-100 Arabidopsis zaden wildtype Col-0 of npr1-1 mutant op elke pot met een gevouwen 70 mm gewicht plaat of ander papier.
   3. Dek de pot met water bespoten transparante koepel de relatieve vochtigheid oplopen tot 80-90% (Figuur 2A).
2. Incubeer de pot bij 4 ° C gedurende 72 uur om voor volledige stratificatie en synchrone ontkieming.
3. Breng de pot aan de standaard groeicondities (12 uur licht/ 12 uur donker, 21 ° C, lichtintensiteit 100 umol / ^m2 / sec, relatieve vochtigheid 40%) zodat de zaden ontkiemen. Crack de koepel naar een 2-3 genereren onmiddellijk openen na de overdracht aan de groei ruimte, die zal helpen voorkomen dat condensatie van water.
4. Wanneer het eerste echte blad van de grootte van 2-3 mm lengte bereikt, transplantatie de zaailingen uit de pot een 72-putjes vlakke gevuld met grond.
   1. Gebruik een vinger of een 1 ml pipet een 1-in diepe depressie te creëren in het midden van het bodemoppervlak van de flat.
   2. Zachtjes scheiden individuele zaailingen met zo weinig wortel schade mogelijk. Pick-up zorgvuldig zaailingen die intact wortels met een pincet te hebben.
   3. Plaats een enkel gescheiden zaailing samen met de aanhangende grond klomp transplantatie schok te minimaliseren in de depressie en zachtjes langs de omliggende grond om de depressie te vullen. Gooi de extra zaailingen en bodem in biologisch gevaarlijk afval container en afvoeren in overeenstemmingmet de plaatselijke richtlijnen voor afvalverwerking biologisch gevaarlijk afval.
   4. Zaailingen overgebracht water van boven en bedekken het vlak met een in water gesproeid transparante koepel 80-90% vochtigheidsgraad te handhaven. Houd de koepel voor 3 dagen, dan barst de koepel in de ochtend van dag 4 en volledig te verwijderen aan het einde van die dag.
      Opmerking: Zaaien kan ook worden uitgevoerd door stratificatie zaden in 1,5 ml centrifugebuizen met 1 ml 0,1% agar gedurende 48 uur bij 4 ° C, gevolgd door het overbrengen van 2-3 zaden met een glazen pipet naar een 72-putjes vlakke gevuld met grond. Flats moeten worden bedekt met een doorzichtige koepel die een week kan worden verwijderd na het ontkiemen. Extra zaailingen kunnen worden verwijderd om slechts één zaailingen per putje verlaten.
5. Waterplanten elke twee dagen door het weken flats in 1 in water gedurende 20 min, laat vervolgens het overtollige water.
   Opmerking: Het tijdsinterval voor het besproeien van planten is afhankelijk van de luchtvochtigheid groei kamer en moet vastberaden based op voortdurende observatie van de gebruiker plantengroei faciliteit. Controleer planten dagelijks om ervoor te zorgen dat ze goed bewaterd. Als slechts enkele plekken liggen te drogen, water die planten uit de top met een spuit fles.
6. Voer pathogeeninfectie testen (stap 3-5) met planten die aan of nabij ontwikkelingsstadium # 3,50 (bij rozet grootte is 50% uiteindelijke grootte), die 3-5 weken oud overeenkomt afhankelijk van de groeiomstandigheden (fotoperiode, temperatuur). Niet planten na bloeiwijze opkomst (fase # 5) te wijten aan het begin van leeftijd gerelateerde weerstand ^38,39 infecteren.

2. Voorbereiding van Cultuur Media en Platen

1. Maak 1 L B (KB) vloeibaar medium King's. Roer 20 g proteosepepton en 2 g dibasisch kaliumfosfaat trihydraat met een magnetische roerstaaf met 1000 ml gedeïoniseerd _H2O tot er geen zichtbare pellet. Aliquot 100 ml in 150 ml glazen flessen en autoclaaf op een 20-min vloeistof cyclus.
2. Bereidencultuur platen met KB vast medium.
   1. Roer 20 g proteosepepton, 2 g dibasisch kaliumfosfaat trihydraat en 15 g Agar met 1000 ml gedeïoniseerd _H2O Autoclaaf.
   2. Afkoelen het medium op een magnetische roerplaat totdat het is cool om aan te raken om toekomstige condensatie minimaliseren en afbraak van antibiotica te voorkomen. Voeg 18 ml steriel 80% glycerol en 5 ml steriel 1 M _MgSO4 aan het medium. Aangezien Psm ES4326 draagt ​​resistentie tegen streptomycine, voeg streptomycine in de afgekoelde medium tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug ml ^{- 1.}
   3. Giet de platen. Bereid twee verschillende maten van de KB media platen: 100 mm x 15 mm en 150 mm x 15 mm petrischaaltjes. De kleinere petrischaal met medium dient als de primaire bacterie kweekplaat en het grotere petrischaal dient als bacteriën tellen plaat.
      Opmerking: Om de bacteriën te tellen platen, kan rechthoekig gevormde platen worden gebruikt voor het verminderenverbruiksgoederen kosten sinds twee keer zo veel behandelingen per plaat kan worden uitgezet in vergelijking met traditionele ronde platen.
      1. Giet de platen vóór de infectie experiment. WINKEL KB medium platen bij 4 ° C gedurende 2-3 maanden na streptomycinesulfaat geleidelijk verliest de antibiotische activiteit ^40.

3. Enhanced ziektegevoeligheid (EDS)

1. Dag 1 - Streak bacteriën op de plaat
   1. Twee dagen voor de EDS-test, streak Psm ES4326 van -80 ° C glycerol voorraad op een KB-Strep bacteriële cultuur plaat en incubeer bij 28 ° C gedurende 24-48 uur.
2. Dag 2 - initiëren vloeibare cultuur en waterplanten
   1. Inleiding van de vloeibare cultuur in een steriele reageerbuis met 4 ml vloeibare KB medium dat 50 ug ml ^{- 1} streptomycine en schudden bij 250 rpm, 28 ° CO / N.
      Opmerking: Voor EDS infectie assay, met behulp van 6 planten per genotype is aan te bevelened. Voor STI en MTI assays, zijn 6 planten per genotype per behandeling aanbevolen. Voor de bacterie entmateriaal, wordt aanbevolen een verse vloeibare kweek met een optische dichtheid gebruiken λ _600nm tussen 0,3 en 0,6.
   2. Markeer de bladstelen van bladeren nummer 5 en 6 met een stomp einde waterproof marker voor gemakkelijke identificatie van geïnfecteerde weefsel bij bemonstering (figuur 1). Om de opening van huidmondjes verbeteren en de ingang van pathogeen oplossing in het blad te vergemakkelijken, de planten water goed door het weken de vlakke van de bodem voor 20 min, laat vervolgens het overtollige water.
      Let op: U kunt ook betrekking hebben op de flat met een transparante koepel en laat deze in het water voor 2-4 uur op de stomatale opening te verhogen.
   3. Dag 3 - Pathogen verdunning en spuit infiltratie
      Opmerking: pathogeeninfectie de ochtend- uren optimaal pathogeen proliferatie en ontwikkeling van de meest uitgesproken ziektesymptomen op gevoelige genotypes. Moeite doen om het infecteren houdenion timing consistent effect van circadiane ritmen en diurnale genregulatie ^41,42, hetgeen helpt de variatie tussen experimentele replicaties elimineren.
      1. Pellet de bacteriële kweek in een microcentrifuge 1,5 ml buis bij 9600 xg gedurende 2 min bij RT en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de bacteriële pellet met 1 ml steriel 10 mM _MgCl2.
         Opmerking: Magnesium kationen kan de beweeglijkheid en de hechting van P. verbeteren syringae ^43. Of gebruik MgSO ₄ bij dezelfde concentratie. Steriel water een aanvaardbaar alternatief voor het Mg zoutoplossingen.
      2. Verdun de bacteriesuspensie met 9 ml van 10 mM _MgCl2 in een 50 ml centrifugebuis en meet de optische dichtheid (OD) van bacteriën met een spectrofotometer bij λ = 600 nm. Verdun de bacteriën met 10 mM _MgCl2 tot de uiteindelijke OD _{600 nm} = 0,0002 voor EDS infectie assay.
      3. Infiltreren het bladmet 1 ml stomp uiteinde naaldloze injectiespuit (algemeen bekend als de insulinespuit) de verdunde bacteriële oplossing bevat.
      4. Vul niet de spuit tot de volledige capaciteit. Vullen met 0,5-0,6 ml mogelijk te maken voor een veel betere controle tijdens de infiltratie proces.
      5. Maak de onderkant van het blad bovenop wijsvinger en vervolgens voorzichtig de bladeren positie met behulp van de duim passen. Plaats de spuit verticaal tegen het bladoppervlak om ervoor te zorgen dat de druk gelijkmatig wordt verdeeld. Probeer de hoofdnerf gebied tijdens de infiltratie te voorkomen blad schade te beperken.
      6. Duw de zuiger langzaam naar de bacteriële oplossing te infiltreren; vloeistof binnenkomst in de bladmesofylcellen wordt gevisualiseerd zoals aangegeven door de donkere bladkleur. Poging om het gehele oppervlak van het blad infiltreren. Als dit niet wordt bereikt in een enkele poging, kies een andere infiltratie plek en herhaal het bovenstaande totdat het gehele bladoppervlak is bedekt beschreven acties.
      7. Eenmaal voltooid, voorzichtig deppen het blad met absorberend weefsel om de extra ziekteverwekker oplossing te verwijderen. Inspecteer de geïnfecteerde blad weefsel voor schade.
         Opmerking: De ronde spuit beeld niet getoond na de infiltratie is voltooid.
      8. Laat de geïnfiltreerde planten te drogen voor 1-2 uur alvorens terug te keren ze in hun oorspronkelijke groeiomstandigheden. Vervolgens spuit een heldere koepel met water en bedekken de geïnfecteerde planten gedurende 2 uur, daarna barst de koepel te genereren 2-3 openen en laat het op gedurende de rest van de infectie experiment.
         Let op: Omdat P. syringae is geen lucht pathogeen, is er geen verspreiding van het infectieuze agens andere planten gekweekt op dezelfde locatie. Echter, als een extra voorzorgsmaatregel, vermijd contact tussen geïnfecteerde planten en andere experimentele installaties in de buurt. Die de flat met een transparante koepel zal de ziekteverwekker virulentie verhogen en te versnellen progressie van de ziekte. Denodig voor deze stap en de optimale duur van de periode bekleding moet worden bepaald op basis van de vochtigheidsgraad van de gebruiker plantengroei faciliteit.
   4. Dag 5 - Pre-droog de media platen
      1. Neem de 150 mm x 15 mm KB platen uit de koude opslag eenheid en droog alle reeds bestaande condensatie van water op het bord. Droge platen door ze bij kamertemperatuur ongeveer 24 uur. Om dit proces te versnellen, plaats ze in een laminaire stroming kap met de deksels gebarsten 30-60 min.
         Opmerking: Deze stap is essentieel voor de vorming van circulaire druppel op het oppervlak van de plaat in de volgende stap.
   5. Dag 6 - Het kwantificeren van de pathogeen groei
      Opmerking: De volgende pathogenen kwantificering procedure kan worden uitgevoerd op vroegere tijdstippen na infectie met gelijke hoeveelheden bacteriën worden afgegeven in het blad, vooral wanneer planten bladmorfologie veranderd bevestigen.
      1. Verwerk de geïnfecteerde weefsel na de opkomstchlorose aangegeven door de vergeling van het geïnfecteerde weefsel in de gevoelige genotypes, maar vóór de ontwikkeling van necrotische laesies (figuur 2B).
         Opmerking: Voorgestelde bemonsteringstijd drie dagen na de inoculatie pathogeen. Aangezien pathogeen groei is afhankelijk van een aantal omgevingsfactoren, de duur van de incubatie kan variëren binnen een bereik van 2 ½-3 ½ dagen en moet worden bepaald door zorgvuldige observaties van de infectie progressie gebruiker plantengroei faciliteit.
         1. Bereid 6 slijpen buizen voor elk genotype (figuur 1). Plaats een roestvrij staal slijpen bal en voeg 500 ul steriele 10 mM _MgCl2 in de elke buis.
         2. Maak de besmette blad van de plant en punch een blad schijf met een 1-hole papier punch (figuur 1).
            Opmerking: Om de sampling error minimaliseren, probeer elk bemonsterd blad punch op dezelfde positie. Bemonstering van het blad schijf uit de topvan het blad wordt aanbevolen.
         3. Willekeurig plaatsen 2 bladschijven (van twee verschillende planten) in elkaar slijpen buis met behulp van een tang.
         4. Verzegelen de buis en homogeniseren van het weefsel met een high-throughput homogenisator op maximale snelheid (1600 slagen per minuut) gedurende 10 min. Herhaal deze procedure indien nodig totdat het weefsel is goed gehomogeniseerd en de oplossingen die groen te wijten aan chlorofyl vrijlating uit de besmette bladeren.
      2. Tijdens het wachten op de homogenisering, vul de eerste 6 rijen van een 96-well cultuur plaat met 180 ul 10 mM _MgCl2 met behulp van een multi-channel pipet en een pipetteren reservoir.
      3. Na het malen overdracht 20 ul Ondergrond weefselsuspensie in de eerste rij van de 96-well plaat en meng door herhaaldelijk pipetteren vloeistof en neer. Als kleine fragmenten van weefsel verstoppen de tip, klem hem met 2-3 mm te helpen het juiste volume van de oplossing te verwerven.
         1. Om voldoende ruimte voor de druppel te verstrekken over de top of de plaat ruimte het weefsel van verschillende genotypen in alternatieve rijen (figuur 1). Om een ​​tien-voudige seriële verdunning te bereiden, overdracht 20 ul vloeistof in de tweede rij en herhaal deze procedure tot de zesde verdunning.
      4. Overdracht 20 ul van de oplossing uit de 96-well plaat op de 150 mm x 15 mm KB plaat behulp verdeeld pipetpunten (figuur 1). Werkzaamheden van de verdunde suspensie naar de meest geconcentreerde.
         Opmerking: Vanuit meest verdund meest geconcentreerde overbodig is pipetpunten tussen de verdunningen wijzigen. Wanneer de plaat goed voorgedroogd, dient de doorgegeven druppel intact bovenop het medium blijven tot geabsorbeerd (gewoonlijk 15-30 minuten). Droogtijd varieert met de RT en vochtigheid.
      5. Droog de plaat bij RT met deksel gebarsten. Zodra geen vloeistof meer kan worden waargenomen op de plaat oppervlak, sluit het deksel, omkeren en incubeer de plaat bij RT of een 28 ° C incubator.
      6. Incubeer platen voor 40-60 uur totdat de kolonies zichtbaar. Controleer of de groei van de platen geeft de voorspelbare 10-voudige afname van kolonievormende eenheden (cfu) (figuur 2C). Tel de bacteriën voordat ze overwoekeren en kolonies fuseren. Bepaal het aantal bacteriën in de laagste verdunning overlappende kolonies heeft. Gewoonlijk de gewenste verdunning te tellen wordt tussen 10-50 kolonies bevatten.
         Opmerking: Variatie aanwezig bij de technische repliceert zijn; derhalve de laagste verdunning van elke duplo afzonderlijk bepaald.
      7. Om de niveaus van bacteriële proliferatie berekenen document het nummer van de regel (R) en het aantal bacteriën in schriftelijk elke technische duplo (T). Bepaal het aantal kolonievormende unit - cfu / bladschijf door de formule: cfu / bladschijf = (T × 10 ^R / 20) x 500/2
      8. Typ de gegevens in de volgende spreadsheet sjabloon om produce een grafiek (figuur 1) (voor spreadsheet data-analyse template-bestand, zie tabel 2). Elk gegevenspunt wordt weergegeven als het gemiddelde van zes technische replicaten op een logaritmische schaal. Foutbalken 95% betrouwbaarheidsinterval van het gemiddelde (n = 6).
         Opmerking: Het berekenen van 95% betrouwbaarheidsintervallen te worden aangepast aan het aantal technische replicaten.

4. SA-Triggered Immunity (STI)

1. Dag 1: Volg dezelfde procedure zoals beschreven in stap 3.1.
2. Dag 2: Naast de planten water en inleiding van de vloeibare bacteriële kweek (stap 3,2), resistentie induceren door externe toepassing van SA derivaat natriumsalicylaat ^21.
   Opmerking: Pure SA heeft een slechte oplosbaarheid in water en vereist voorafgaande pH aanpassen, dus het is niet aanbevolen voor deze test.
   1. Om SA-gemedieerde verdediging tegen P. induceren syringae en prime de planten voor toekomstige infectie ^21,24, spuiten planten met een fijne nevel van 1 mM natriumsalicylaat of H _{2 O} (als mock) 16-24 uur voordat de ziekteverwekker infectie.
3. Dag 3: Bereid ziekteverwekker verdunning tot OD _{600 nm} = 0.001 en duw de bacteriën in de gehele bladoppervlak door spuit infiltratie (stap 3.3).
4. Dag 6: Voor pathogeen kwantificering en telproces, volgt u de procedure zoals beschreven voor de EDS-test (Stappen 3.4 en 3.5). Plaat en tel de H _{2 O} en natriumsalicylaat - voorbehandelde monsters afzonderlijk. Voor wildtype Arabidopsis, wordt een 1-2 log vermindering pathogeen groei verwacht in het natriumsalicylaat - voorbehandeld planten.

5.-MAMP Triggered Immunity (MTI)

Opmerking: In deze test gebruiken wij Arabidopsis wildtype Col-0 en mutant FLS2 en efr planten. FLS2 en EFR zijn plasma-gelokaliseerde Pattern Recognition Receptoren (PRRS) dat flg22 en elf18 kan herkennen, respectively ^9,10. Verlies van elk PRR resulteert in de ongevoeligheid voor het specifieke type MAMP, hetgeen wordt aangegeven door ongewijzigde pathogeen groei van de mutant volgende externe MAMP voorbehandeling en spuit infiltratie PSM ES4326.

1. Dag 1 en 2: Volg dezelfde procedure als beschreven in stap 3,1 en 3,2.
2. Dag 3: MAMP voorbehandeling en pathogeeninfectie
   1. Om de MAMP-Triggered immuniteit vast te stellen, voor te bereiden 1 uM oplossing van flagelline epitoop flg22 of EF-Tu epitoop elf18 en spuit-infiltreren het in het gehele bladoppervlak 4 uur voordat de pathogeen infectie (Stappen 3.3.3-3.3.6). Dit zal zorgen voor inductie van MAMP gemedieerde afweer tegen P. syringae en prime de planten voor toekomstige infectie ^6,37.
      Opmerking: publiek beschikbaar microarray gegevens bleek de maximale transcriptie herprogrammering van MAMP-responsieve genen gebeurt er 4 uur na flg22 of elf18 behandeling ^37,44. Aldus 4 uur is aanbevolenduur van de MAMP voorbehandeling die resulteert in het bereiken van een duidelijk verschil in de pathogeen groei tussen MAMP behandeld Col-0 en FLS2 en efr mutanten.
   2. Verwijder de extra MAMP oplossing met absorberend tissue en laat de planten blootgesteld aan de vloeistof absorptieproces in het blad versnellen. Ter compensatie van de verwonding vanaf injectiespuit druk infiltratie, infiltreren H ₂ O in de bladeren van controleplanten.
   3. Bereid pathogeen verdunning tot OD _{600 nm} = 0,001 en duwen de bacteriën in het totale bladoppervlak van MAMP / H ₂ O voorbehandeld leaf injectiespuit infiltratie (stap 3,3).
3. Dag 6: Voor pathogeen kwantificering en telproces, volgt u de procedure zoals beschreven in stap 3.4 en 3.5. Plaat en tel de H _{2 O} en MAMP-voorbehandelde monsters afzonderlijk. In wild-type Arabidopsis, een 1-2 log reductie in pathogeen groei wordt verwacht in de MAMP voorbehandeld planten, met ietwat sterkeER vermindering gemedieerd door flg22 vergelijking met elf18.

Resultaten

Het protocol dat we hier beschrijven vertegenwoordigt een geoptimaliseerde P. syringae spuit infiltratie assay om de immuunrespons in Arabidopsis planten kwantitatief te evalueren. Zoals weergegeven in figuur 1, wordt de injectiespuit infiltratie van Psm ES4326 gevolgd door pathogeen extractie en kwantificering via seriële verdunningen en kolonies enumeration.

Zoals beschreven in stap 3 in het protocol tekst kan Enhanced ziektegevo...

Discussie

Met afnemende beschikbare landbouwgrond en toenemende bevolking, zijn onderzoekers over de hele wereld uitgedaagd met dringende behoeften voor verbetering gewas. De opbrengst kan sterk worden beïnvloed door verschillende biotische en abiotische stress. Onder hen, pathogeeninfectie is een van de belangrijkste oorzaken van gewasopbrengst verminderen, verantwoordelijk voor ongeveer 12% verlies in de VS alleen ^45. Om dit probleem op te lossen, heeft enorme onderzoek gedaan in het model Arabidopsis - P. syring...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MetroMix 360	Grosouth	SNGMM360
Large pots	Grosouth	TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts	Grosouth	LM1206
11x 21 Flats with no holes	Grosouth	LM1020
11x 21 Flats with holes	Grosouth	LM1020H
Vinyl propagation domes	Grosouth	CW-221
Proteose Peptone	Fisher Scientific	DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate	MP Biomedicals	151946
Agar	Fisher Scientific	A360-500
Streptomycin sulfate	Bio Basic Inc	SB0494
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	R80150
Rectangular plate	Fisher Scientific	12-565-450
MgCl2 Hexahydrate	Bio Basic Inc	MB0328
Glycerol	Bio Basic Inc	GB0232
MgSO4	Bio Basic Inc	MN1988
1 ml syringe	Fisher Scientific	NC9992493
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A
Grinding tubes	Denville Scientific	B1257
Caps for grinding tubes	Denville Scientific	B1254
Stainless steel grinding ball	Fisher Scientific	2150
96-well plate	Fisher Scientific	12-556-008
Sodium Salicylate	Sigma Aldrich	s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)	Genescript	Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	Genescript	Made to order
Hole puncher	Staples	146308
Biophotometer plus	Eppendorf	952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer	Fisher Scientific	02-215-503
Accu spin micro centrifuge	Fisher Scientific	13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl)	Eppendorf	3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl)	Eppendorf	3122 000.060
Pipette (20µl)	Eppendorf	3120 000.038
Pipette tips	Fisher Scientific	3552-HR
Sharpie permanent marker	Staples	507130
1.5 ml tube	Eppendorf	22363204
Forceps	Fisher Scientific	08-890