Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

Summary

Dit protocol maakt gebruik van driedimensionale (3D) beeldvorming en analyse technieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. De technieken zijn van toepassing op andere situaties waar een fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van een subset van gegevens uit een ander fluorescent signaal.

Abstract

Het doel van dit protocol is het bestuderen van de mitochondriën binnen intraepidermal zenuwvezels. Daarom, 3D imaging en analyse technieken werden ontwikkeld om isoleren van zenuw-specifieke mitochondriën en evalueren van ziekte-geïnduceerde veranderingen van de mitochondriën in de distale uiteinde van sensorische zenuwen. Het protocol combineert fluorescentie immunohistochemistry, confocal microscopie en 3D beeld analysetechnieken om te visualiseren en te kwantificeren van zenuw-specifieke mitochondriën. Gedetailleerde parameters worden gedefinieerd in de procedures om een concreet voorbeeld van het gebruik van deze technieken te isoleren van de zenuw-specifieke mitochondriën. Antilichamen werden gebruikt voor het label van de zenuw en mitochondriale signalen binnen weefselsecties van huid punch biopsieën, die werd gevolgd door indirecte immunofluorescentietest te visualiseren zenuwen- en mitochondriën met een groene en rode fluorescerende signaal respectievelijk. Z-serie beelden werden verkregen met confocale microscopie en 3D analysesoftware werd gebruikt voor het verwerken en analyseren van de signalen. Het is niet nodig om te volgen de exacte parameters beschreven binnen, maar het is belangrijk overeenstemming te zijn met degene die zijn gekozen door de kleuring, acquisitie en analyse stappen. De sterkte van dit protocol is dat is van toepassing op een breed scala aan omstandigheden waar één fluorescent signaal wordt gebruikt voor het isoleren van andere signalen dat anders onmogelijk zijn zou om alleen te bestuderen.

Introduction

Mitochondriën dienen vitale cellulaire functies waarin het produceren van energie van de cel, calcium, en de regulering van necrotisch en de apoptotic cel dood^1,2,3te bufferen. Het zenuwstelsel heeft een hoge stofwisseling ten opzichte van het lichaam⁴ suggereren dat neuronen een hoge mate van cellulaire energie in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP genereren) door middel van mitochondriale ademhaling. Een heleboel documenten van bewijs dat neuronale functies zijn afhankelijk van ATP⁵, met name op de synapsen⁶. Daarom is de verdeling van de mitochondriën binnen neuronen is belangrijk.

In de afgelopen 10 jaar die een heleboel informatie is gebleken dat de drugshandel en het couperen van neuronale mitochondriën is sterk gereguleerd. Motor eiwitten zijn betrokken bij de verdeling van de mitochondriën naar specifieke cellulaire compartimenten gedurende het neuron. Handel in mitochondriën is vooral belangrijk omdat de neuronen project axonen en dendrites ver weg van het soma. Kinesin motor eiwitten directe voornamelijk anterograde (weg van het soma) handel in mitochondriën langs microtubuli terwijl dynein motor eiwitten directe retrograde (richting het soma) beweeglijkheid^{7,8,9 , 10}. er zijn cellulaire signalen zo'n Mitochondriale membraanpotentiaal en geleiding van de impuls die invloed hebben op de aanwezigheid en de richting van mitochondriale mensenhandel^11,12,13.

Naast het vervoer van mitochondriën, zijn er gespecialiseerde eiwitten te lokaliseren mitochondriën naar specifieke cellulaire compartimenten die hoge energie-eisen, zoals de knopen van Ranvier en synapsen^8,14, hebben ¹⁷. In feite de meeste mitochondria binnen axonen zijn niet-sporenvormende^9,13,18. Gespecialiseerde eiwitten zoals syntaphilin anker mitochondriën tot microtubuli langs axonen terwijl andere eiwitten anker mitochondriën tot aan de actine cytoskelet^19--²¹. Groeifactoren en ionen zoals calcium zijn ter ondersteuning van de stopzetting van de mitochondriën verkeer te lokaliseren hen aan regio's waar ze de benodigde^21,22,23zijn gemeld.

Samen genomen, zijn de mensenhandel en docking van mitochondriën van vitaal belang voor de werking van neuronen. Ter ondersteuning van dit, verstoring van de mitochondriale mensenhandel is in verband gebracht met verschillende neurologische aandoeningen waaronder de ziekte van Alzheimer, Amyotrofische laterale sclerose, ziekte van Charcot-Marie-Tooth, ziekte van Huntington, erfelijke spastische paraparese en optische atrofie^{15,24,25,26,27}. Recente studies hebben gericht op de mitochondriale dysfunctie en pathologie als een potentiële mechanisme voor diabetische neuropathie, de zintuiglijke verlies geassocieerd met diabetes^{28,29,30,31 3332, ,}. De hypothese is dat diabetes de verdeling van de mitochondriën in de sensorische prognoses van cutane zenuw eindigt wijzigt. Daarom werd een techniek ontwikkeld om te visualiseren en te kwantificeren van mitochondria binnen de intraepidermal zenuwvezels (IENFs), de distale uiteinden van de achterwortelganglia ganglion sensorische afferents. De techniek combineert fluorescentie immunohistochemistry van specifieke mitochondriale en zenuw fiber etiketten met confocale microscopie z-serie overname van signalen met de software van de analyse van de krachtige 3D-beeld voor het meten van de verdeling van de zenuw-specifieke mitochondriën van menselijke cutane punch biopsieën om dit doel te bereiken.

Protocol

huid punch biopten werden verkregen uit de onderwerpen die werden gerekruteerd uit een grote gemeenschap gebaseerde eerstelijnszorg netwerk op de Universiteit van Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Deze studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Michigan institutionele Review Board en naleving van de beginselen van de verklaring van Helsinki. Schriftelijke geïnformeerde toestemming was verkregen van elk onderwerp voorafgaand aan testen.

1. fluorescentie Immunohistochemistry

1. voorbereiden punch biopsieën voor intraepidermal zenuw fiber immunohistochemistry:
   1. uitvoeren 3 mm huid biopsieën door medisch personeel en plaats de hele biopsie in 1.5 mL Zamboni ' s kleefpoeders oplossing (2% paraformaldehyde, 0.3% verzadigd pikrinezuur in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4) bij 4 ° C's nachts.
   2. Spoel van monsters met een oplossing van 30% sucrose in PBS bij 4 ° C gedurende 16-24 uur of totdat het monster zinkt.
   3. Embed monsters in optimale scherpe temperatuur compound (OCT) met behulp van een cryomold. Schakel de hele 3 mm biopsie met de opperhuid naar beneden in de mal en vul de mal met ongeveer 2 mL OCT. Freeze de schimmel op gemalen droog ijs. Winkel bij-80 ° C tot gebruiksklare.
   4. Knippen 50 µm dik secties met behulp van een cryostaat Kruis en op te slaan in afzonderlijke wells van een 96-wells-plaat met behulp van 180 µL antivries opslagoplossing per putje (30% ethyleenglycol, 30% glycerol in PBS). De volgende aanwijzingen zijn voor 8 wells van een 96 goed plaat. Vlekken van secties vanuit elke biopsie-site die 200-300 µm afstand van elkaar.

dag 1:

2. Quench aspecifieke labeling van het stratum corneum:
   1. Label 96-wells-plaat zoals afgebeeld in Figuur 1.
   2. Pipetteer 150 µL van voorraad signaal versterker oplossing om niet-specifieke binding van secundaire antilichamen ^{34 , 35} in elk putje. Pipetteer secties in signaal versterker oplossing met behulp van een lus inoculating.
      Opmerking: verzorgen terwijl u werkt met het weefsel te beschadigen of scheuren van de weefselsecties vermijden. Houden in signaal versterker oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een vlakke rocker.
   3. Voorbereiden spoelen wells in rijen 2 en 3 van de 96-wells-plaat door 150 µL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen in elk putje.
   4. Zorgvuldig breng secties in rij 2 en spoel in 1 x PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Rinse een tweede keer in 1 x PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (rij 3).
3. 5% bovien serumalbumine (BSA) zijn blokkeren oplossing bereiden:
   1. bereiden 5% oplossing die 5% BSA bevat blokkeren en 0,3% Triton X 100 (TX-100) in 0,1 M PBS (Zie tabel 1) terwijl secties aan het broeden zijn signaal versterker oplossing. BSA gaat niet gemakkelijk in oplossing. Vortex oplossing tot BSA volledig oplost.
   2. Bereiden blokkerende putten in rij 4 van de 96-wells-plaat door toevoeging van 150 µL van 5% BSA blokkeren oplossing in elk putje.
   3. Breng secties in individuele putjes van 5% BSA blokkeren oplossing en incubeer secties in 5% BSA blokkeren oplossing voor 1-2 h bij kamertemperatuur op een vlakke rocker.
4. Bereiden 1% BSA spoelen oplossing en verdunning van de primaire antilichamen:
   1. voorbereiden 1% spoeldouche-oplossing met 1% BSA en 0,3% TX-100 in 0,1 M PBS (Zie tabel 2) terwijl de afdelingen zijn broeden in 5% BSA blokkerende oplossing. BSA gaat niet gemakkelijk in oplossing. Vortex oplossing tot BSA volledig oplost.
   2. Verdund primaire antilichamen in 1% BSA spoeldouche oplossing terwijl secties aan het broeden zijn in 5% BSA blokkerende oplossing.
      1. 1500 µL van primair antilichaam oplossing maken en toevoegen aan elk goed in rij 5.
      2. Verdun de primaire antilichamen: gebruik van de zenuw-specifieke etiket, konijn polyklonale anti-eiwit gene product 9.5 (PGP9.5) op 1:1, 000. De mitochondriën-specifieke label gebruiken, muis monoklonaal anti-pyruvaat dehydrogenase E2/E3bp antilichaam (PDH) op 1:100 in 1% BSA oplossing spoelen.
5. Primair antilichaam voorbereiden:
   1. Pipetteer 150 µL van primair antilichaam in elk goed in rij 5 van de 96-wells-plaat.
   2. Secties van de blokkerende oplossing (rij 4) met het gereedschap lus overboeken naar de rij 5 met het primaire antilichaam.
   3. Wrap de plaat strak met parafilm te houden tegen het uitdrogen.
   4. Leg monsters op vlakke rocker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, en dan na een nacht bebroeden monsters bij 4 ° c op een vlakke rocker.

dag 2:

6. spoel monsters:
   1. voorbereiden spoelen putten in rijen 6, 7 en 8 van de 96-wells-plaat door toevoeging van 150 µL van 1% BSA spoelen oplossing in elk putje.
   2. Breng secties in eerste 1% BSA spoeldouche-oplossing (rij 6) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Herhaal gespoeld tweemaal meer door secties in 1% BSA oplossing spoelen in rijen 7 en 8 voor elk 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
7. Secundaire antilichamen in 1% BSA spoelen oplossing verdund:
   1. maken 1.500 µL van secundair antilichaam oplossing terwijl secties aan het broeden zijn in de laatste spoeling van 1% BSA oplossing (rij 8) spoelen.
   2. Secundaire antilichamen verdund: voor PGP9.5 (groen-fluorescerende geconjugeerd geit anti-konijn antilichaam, 1:1000), voor PDH (rood-fluorescerende geconjugeerd geit anti-muis, 1:1, 000) in 1% BSA oplossing spoelen.
8. Voorbereiden secundair antilichaam:
   1. Pipetteer 150 µL van secundair antilichaam in rij 9 van de 96-wells-plaat.
   2. Voorzichtig het overbrengen van de secties van 1% BSA oplossing (rij 8) spoelen in secundair antilichaam wells (rij 9).
   3. Using parafilm, wikkel de plaat strak te houden tegen het uitdrogen. Dek af met aluminiumfolie. Leg monsters op vlakke rocker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, en dan na een nacht bebroeden monsters op 4 ˚C op een vlakke rocker.

dag 3:

9. voorbereiden schoon 1 x PBS door te filteren door een 0,22 µm filter:
   1. Pipetteer 150 µL van gefilterd 1 x PBS in rij 10, 11 en 12.
   2. Overdracht van monsters naar rij 10 en spoel in 1 x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Dekking van de 96-wells-plaat met aluminiumfolie en leg op een vlakke rocker tijdens spoelen. Herhaal 1 x PBS spoelen twee gefilterd vaker voor 1 uur bij kamertemperatuur in rijen 11 en 12.
10. Microscoop dia's voorbereiden voor de montage van weefselsecties:
    1. plaats 50 µL van gefilterd 1 x PBS op een dia.
    2. Sectie van de overdracht van 1 x PBS (rij 12) in de 50 µL drop. Plaats het gedeelte in de daling van PBS door het weefsel te ontvouwen en afvlakking het zachtjes op het glasplaatje. Verwijder overtollige PBS met een glazen pipet Voorkom verdunning van het montage-reagens. Raak niet secties met het lampglas.
    3. Pipetteer 1 - 2 druppels reagens van de montage DAPI direct boven aan het gedeelte over het gebruik van de Microscoop dia met zorg naar de richting van de sectie niet te storen. Een dekglaasje aan glas van de 50 mm x 24 mm #1.5-Microscoop zachtjes op de sectie plaatst.
    4. Schakelt alle luchtbellen die gevormd terwijl de plaatsing van het dekglaasje aan en veeg overtollige vocht uit de randen van het dekglaasje aan. Voorbereiden van een nieuwe dia en herhaal de montage-process voor elke sectie.
    5. Behandeling/droge montage media door het plaatsen van de dia's in de donkere overnachting bij kamertemperatuur. De dia's overbrengen in 4 ° C voor korte termijn (1-2 weken) of -20 ° C voor langdurige opslag (groter dan 2 weken).
       Opmerking: Negatieve controles weggelaten primaire antilichamen voor PGP9.5 of PDH in stap 1.4.2.2 en weergegeven geen te onderscheiden labeling van zenuwen of mitochondriën in de epidermis. Positieve controles werden uitgevoerd voor de PDH antilichaam om het te bewijzen etiketten alle mitochondriën (gegevens niet worden weergegeven). Positieve controles werden uitgevoerd op gekweekte primaire muisknop achterwortelganglia ganglion neuronen die zijn getransduceerde met een baculovirus aan label mitochondriën met een groen fluorescente proteïne (GFP) signaal en vervolgens vast en gekleurd met de PDH antilichaam en rode fluorescerende secundair antilichaam. Alle mitochondriën die GFP uiten waren werden samen met een label met de rode label voor PDH immunohistochemistry (gegevens niet worden weergegeven).

2. Confocale Imaging

1. uitvoeren confocal beeldvorming:
   1. Collect beelden met behulp van een laser confocal microscoop met een 40 X olie-immersie (1,25 numerieke diafragma (N.A.)) doelstelling op een omgekeerde Microscoop scannen.
      1. Op elke brandvlak sequentieel verwerven fluorescerende signalen:
         kernen: excitatie λ = 405 nm, emissie spectrale filter λ = 420-480 nm
         zenuwvezels: excitatie λ = 488 nm, emissie spectrale filter λ = 505-560 nm
         Mitoch ondria: excitatie λ = 543 nm, emissie spectrale filter λ = 606-670 nm
   2. de volgende parameters van de scan aangaan met de Microscoop software: scanfrequentie van 600 Hz met 2 frame gemiddeld en zoom voor 2.2; 12-bits intensiteit resolutie (4096 grijs niveaus).
      1. De Microscoop software voor optimale zijdelingse resolutie ingesteld (scanresolutie = 1024 x 1024) en axiale resolutie/optische segmenteren (confocal diafragma = 1 luchtige eenheid (AU) met z-stap-grootte van 210 nm).
         Opmerking: De resulterende XYZ-resolutie is 172,2 nm x 172.2 nm x 210 nm met een afbeelding van 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm.
   3. Activeren een levende scan voor het signaal van de zenuw (groen-fluorescentie) en past u de regelaar van de z-focus om te zoeken en instellen van de bovenste en lagere focal vliegtuigen in de Microscoop software die het signaal van de zenuw binnen de weefselsectie omvatten. Het totale z-bereik is doorgaans 30-50 µm voor een weefselsectie 50 µm.
   4. Het veld van de scan met de Microscoop software draaien tijdens een live scan zodat de epidermis horizontaal of verticaal in de afbeelding geplaatst is.
   5. Elk signaal afzonderlijk scannen en aanpassen van de detector (fotomultiplicator, bet) spanning en offset te minimaliseren/verwijderen een over en onder de verzadigde pixels.
      Opmerking: Scan keer met bovenstaande parameters duren ongeveer 20-40 min afhankelijk van het aantal z segmenten.

3. 3D visualisatie en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

1. isoleren van de 3D epidermis:
   1. dupliceren de originele afbeelding en gebruik de maximale intensiteit projectie (extended focus weergave) van de afbeelding te identificeren en te isoleren van de epidermis.
   2. Gebruiken een regio van belang hulpprogramma trace langs de bovenste en onderste randen van de epidermis om te verwijderen van ongewenste gebieden zoals het stratum corneum en dermis die afwezig zijn van intraepidermal zenuwvezels. Uitsnijden naar deze selectie.
2. Gebruik deconvolutie op de zenuw en de mitochondriale fluorescerende signalen:
   Opmerking: deconvolutie helpt om te herstellen van de integriteit van de fluorescerende signalen. Het herstel gebruikt in dit protocol wordt blind deconvolutie genoemd omdat het gebruik maakt van de fluorescerende signalen in de beelden om te bepalen hoeveel verspreid de signalen van hun oorspronkelijke bron (punt spread functie). Het proces verbetert de resolutie van het signaal door het opnieuw toewijzen van het signaal terug naar haar oorsprong locatie verspreid.
   1. Berekenen een punt verspreiden functie (PSF) voor de groen fluorescente zenuw signaal (groen-fluorescentie) met de volgende parameters:
      1. instelt berekende PSF confocal. Middellange refractive index ingesteld op 1.515 en numerieke diafragma te 1,25. Detector pinhole ingesteld op 1 luchtige eenheid (A.U.). Set laser excitatie golflengte op 488 nm en emissie golflengte te 515 nm.
   2. Een PSF voor het rood fluorescerende mitochondriale signaal (rood-fluorescentie) berekenen met de volgende parameters:
      1. Set berekend PSF confocal. Middellange refractive index ingesteld op 1.515 en numerieke diafragma te 1,25. Detector pinhole ingesteld op 1 AU. Set laser excitatie golflengte op 543 nm en emissie golflengte te 617 nm.
   3. Optimaliseren de zenuw- en mitochondriën fluorescerende signalen door deconvolutie met behulp van de bijbehorende spinnen bestemde hierboven vermelde en iteratieve herstel functie instellen op 100% vertrouwen en een iteratie limiet van 10 cycli.
3. Zenuw-specifieke oppervlakken maken:
   1. gebruik het " oppervlak " tool voor het maken van een harde ondergrond van de zenuwen van de deconvolved groen-fluorescerende secundaire etikettering van de PGP9.5 geïdentificeerd zenuwen.
   2. Uncheck de " gladde " functie en de absolute intensiteit-functie gebruiken om in te stellen van de drempel voor het signaal van de zenuw, aangezien het is aanzienlijk lichter dan achtergrond fluorescentie.
   De absolute intensiteit functie
   3. gebruiken om in te stellen van de drempel voor het signaal van de zenuw, aangezien het is aanzienlijk lichter dan achtergrond fluorescentie. Drempel waarde laag genoeg zijn om nauwkeurig de zenuwen.
   4. Filter uit kleine, niet-zenuw oppervlakken op basis van grootte.
      Opmerking: Indien nodig, handmatig bewerken uit extra niet-zenuw oppervlakken binnen de " bewerken " tabblad door de controltoets om meerdere objecten en hen vervolgens te verwijderen met de Delete-toets.
4. Isoleren zenuw-specifieke fluorescerende mitochondriale signaal:
   1. Klik op het tabblad bewerken van het oppervlak van de zenuw te bekijken het " masker eigenschappen " functie. Het oppervlak van de zenuw gemaakt in stap 3.3 wordt gebruikt voor het isoleren van mitochondria binnen deze zenuwen uit de buurt van mitochondriale signalen die is gekoppeld aan de keratinocyten.
   2. Als de " alle masker ' knop opent een " masker kanaal " venster, kies het deconvolved rood-fluorescerende-signaal van de trekkracht onderaan menu onder " kanaalselectie " voor de mitochondriale signaal.
   3. Klik in het vak te zetten een vinkje het " gedupliceerde kanaal alvorens masker " optie.
   4. Klik op de radio knop voor de " constante binnen/buiten " optie masker-instellingen en klik in het vak om een vinkje het " instellen voxel buitenoppervlak te " optie en typ in voor de waarde 0,00. Klik o.k. knoop om te maken van het nieuwe kanaal waarmee mitochondriale signalen binnen de oppervlakte van de zenuw.
5. Maken mitochondriën-specifieke oppervlakken:
   1. gebruik het " oppervlak " tool voor het maken van een harde ondergrond van de mitochondriën van de zojuist gemaakte fluorescerende kanaal van de zenuw-specifieke mitochondriale signalen van stap 3.4.
   2. Uncheck de " gladde " functie en selecteer de " achtergrond van aftrekken " functie om in te stellen voor de drempel. Deze functie gebruikt lokaal contrast rond de mitochondriale signaal om te identificeren van de mitochondriën van achtergrond.
   3. Set drempelwaarde laag genoeg om te nauwkeurig identificeren mitochondriën. In dit voorbeeld werd de lagere drempel vastgesteld op 2.000 voor een 16-bits (65.536) schaal.
   4. Filteren mitochondriale oppervlakken op basis van grootte. In dit voorbeeld die de voxel limiet is ingesteld op 1.0 voxels, wat is de laagste mogelijk te beperken. Indien nodig, handmatig bewerken uit niet-mitochondriën oppervlakken binnen de " bewerken " tabblad door de CONTROL-toets ingedrukt om meerdere objecten te selecteren en ze vervolgens te verwijderen met de Delete-toets.
      Opmerking: Soms, zal de software oppervlakken die niet gekoppeld aan een te onderscheiden fluorescerende mitochondriale signaal zijn maken. In deze gevallen is het mogelijk om hen met de " bewerken " tab.
6. Exporteren en berekenen van de Morfometrische waarden voor analyse:
   1. exporteren van waarden voor de zenuw en mitochondriale oppervlakken van de " statistieken " tabblad voor verdere analyse met elektronische spreadsheetsoftware.
   2. De volume-waarden voor zowel de zenuw en de mitochondriale oppervlakken exporteren.
   3. Het aantal individuele zenuwvezels aanwezig in elke afbeelding tellen en de waarde opnemen in de elektronische spreadsheet.
   4. Voor elke afbeelding, het berekenen van de volgende mogelijke waarden voor analyse in het elektronische werkblad:
      1. som van de volumes voor alle oppervlakken van de zenuw.
      2. Filter uit zenuw-specifieke mitochondriale oppervlakken onder een volume van minder dan 0,02 µm ³ en bin de oppervlakken door grootte. Bijvoorbeeld het gebruik van opslaglocaties zoals 0.02 - 0,04 0,04 - 0,08, 0.08 - 0.16, 0.16 - 0.32, 0.32 - 0.64, 0.64 - 1,28, 1.28-2,56, groter dan 2.56 µm ³.
         Opmerking: De ondergrens van mitochondriale volume is ingesteld op 0,02 µm ³ op basis van eerder gepubliceerde hoeveelheid mitonchodria ^{36 , 37 , 38}.
      3. Tellen het aantal zenuw-specifieke mitochondriale oppervlakken binnen elke opslaglocatie en het totale aantal oppervlakken over de opslaglocaties (0.02 - groter dan 2.56 µm ³).
      4. Bereken het percentage van de zenuw-specifieke mitochondriale oppervlakken in elke opslaglocatie. Gebruik de telling per bin gedeeld door het totale aantal mitochondriën oppervlakken.
      5. Som van de volumes voor alle zenuw-specifieke mitochondriale oppervlakken.
      6. Berekenen van het aandeel van de zenuw met mitochondriale signaal door het verdelen van het totale zenuw oppervlakte volume door de som van alle mitochondriale oppervlakte volumes.
      7. Het aantal mitochondriën per zenuw volume berekenen door het verdelen van het totale zenuw oppervlakte volume door de graaf van alle mitochondriale oppervlakken.

Results

Visualisatie en kwantificering van mitochondriën in menselijke IENFs

Fluorescentie immunohistochemistry zorgt voor de gelijktijdige labeling van meerdere signalen binnen de menselijke huid biopsieën te visualiseren van zenuwen, mitochondriën en kernen. Een 96-wells-plaat is een handige manier om te organiseren van de stappen in de procedure immunohistochemistry. Figuur 1 laat zien d...

Discussion

Dit protocol is ontworpen om te isoleren, te kwantificeren en te analyseren, de grootte en de distributie van zenuw-specifieke mitochondria binnen IENFs in 3D van menselijke huid biopsieën. Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. De zwevende fluorescentie immunohistochemistry is ontworpen om vlekken en analyseren van meerdere signalen in elk monster, een meer veelzijdige methodologie voorziet exploratief onderzoek^44,45. Deze procedure zorgt voor ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Zamboni's Fixatieve	Newcomer Supply, Middleton, WI	1459A	2% paraformaldehyde, 0,2% verzadigde picrinezuur in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4
10x Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (PBS)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP399-4	Om 1x PBS te maken
Image-iT FX Signaal Versterker	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	I36933	Verbetert Alexa Fluor kleurstoffen signalen door niet-specifieke bindingen te verminderen
Anti-Eiwit Gen Product 9.5 Antilichaam (Konijn Polyklonaal)	Proteintech Group Inc. Rosemont, IL	14730-1-AP	Afgekort als PGP9.5, vervangt niet langer verkrijgbare AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antilichaam
Anti-Pyruvat Dehydrogenase E2/E3bp Antilichaam (Muis Monoklonaal)	abcam, Cambridge, MA	ab110333	Afgekort als PDH
Geit anti-muis Secundair antilichaam Alexa Fluor 594-conjugaat	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11034	Rood-fluorescent geconjugeerd secundairantilichaam
Geit anti-konijn Secundair antilichaam Alexa Fluor 488-conjugaat	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11032	Groen-fluorescent geconjugeerd secundairantilichaam
Albumine, uit Rund Serum	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A7906-100	Afgekort als BSA
Triton X- 100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T9284	Afgekort als TX-100
0,22 µm Filter	EMD Millipore, Billerica MA	MILLEX GP SLGP 033NS	0,22 µm Millipore filter
Parafilm M	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	13-374-10	Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Niet-gekalibreerd Lus	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	22-032092	Inoculating Lus door Decon LeLoop (MP 199-25)
96-putjes Testplaat	Corning Incorporated, Corning, NY	3603	96-putjes platte bodemplaat
Prolong Gold antifade reagens met DAPI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	P-36931	DAPI kleuring van kernen
Microscoop Dekglas 50 x 24 mm	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-544E	Dekglazen
Superfrost Plus Microscoop Glazen	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-550-15	Microscoop Glazen
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscoop	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5	Confocal Microscoop
Volocity x64 Software	Perkin Elmer, Waltham, MA	versie 4.4.0	Volocity software wordt gebruikt voor Stappen 3.1 en 3.2 in het protocol voor beeldverwerking
Imaris x64 3 Dimensionale Analyse Software	Bitplane, Concord, MA	versie 7.7.1	Imaris software wordt gebruikt voor Stappen 3.3 tot 3.5 in het protocol voor beeldanalyse
Excel	Microsoft, Redmond, WA	versie Office 2013	Excel spreadsheet software wordt gebruikt voor Stap 3.6 in het protocol om morfometrische kenmerken samen te vatten
Optimum Snij Temperatuur Compound	Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA	4583	Afgekort als OCT
Leica Cryostaat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL	CM1850	Cryostaat voor het snijden van 50 µm secties
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	C10600	Gebruikt als een positieve controle om mitochondriën te labelen met een groen fluorescent signaal