Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we de principes voor het ontwerpen en uitvoeren van een multi-kleurig lijn-traceringsexperiment met behulp van R26R-Confetti muizen. We bieden een specifiek protocol voor het volgen van hoornvliesepitheelcellen die kunnen worden aangepast voor andere weefsels van belang.

Samenvatting

Lijntraceringsexperimenten bepalen de oorsprong, het lot en het gedrag van cellen in een specifiek weefsel of organisme. Deze techniek is al vele decennia met succes toegepast en heeft baanbrekende ontdekkingen opgeleverd in de ontwikkelingsbiologie. Meer recentelijk werd het door stamcelbiologen overgenomen om verschillende stamcelpopulaties te identificeren en te volgen met minimale experimentele tussenkomst. De recente ontwikkelingen in muisgenetica, de beschikbaarheid van een groot aantal muisstammen en de vooruitgang in fluorescentiemicroscopie maken de eenvoudige ontwerping van krachtige lijntraceringssystemen mogelijk voor verschillende weefsels met basisexpertise, met behulp van commercieel verkrijgbare hulpmiddelen. We hebben onlangs gebruik gemaakt van deze krachtige methodologie om de oorsprong en het lot van stamcellen aan het oogoppervlak te onderzoeken met behulp van de R26R-Confetti muis. Dit model biedt een meerkleurig genetisch systeem voor de expressie van 4 fluorescerende genen op willekeurige wijze. Hier beschrijven we de principes van deze methodologie en bieden we een aanpasbaar protocol voor het ontwerpen van lijntraceringsexperimenten; specifiek voor het hoornvliesepitheel evenals voor andere weefsels.

Inleiding

Tijdens de embryonale ontwikkeling, weefsels en organen morfogenese plaatsvinden door middel van een nauwkeurig programma dat in termen van celproliferatie, migratie en lineage specificatie ^1-4 kunnen worden beschreven. Deze biologische processen zijn betrokken bij het handhaven van volwassen weefsel homeostase, hetwelk stamcel regeneratie. Lineage tracing, de identificatie en opsporing van de nakomelingen van een specifiek type cel populatie, levert een belangrijk instrument voor het bestuderen van embryogenese en stamcel homeostase. Inderdaad wordt steeds vaker gebruikt in vele gebieden van onderzoek. Bijzonder, lineage tracing werd een essentieel hulpmiddel bij het identificeren van de oorsprong en het lot van de stamcellen in homeostase en de ontwikkeling van kanker. Dit is omdat het essentiële informatie over de cel gedraagt ​​in het kader van het intacte weefsel of organisme, met minimale experimentele interventie verschaffen, in tegenstelling tot cel isolatie en in vitro kweek of TransplantatieOp die kunnen leiden tot ongewenste vertekening.

Traditioneel kleurstoffen zoals vetoplosbare carbocyanine die integreren in het plasmamembraan van cellen, werden gebruikt voor lineage tracing. Hoewel deze soorten experimenten succes hebben geleid tot belangrijke ontdekkingen en gevormde rudimentaire concepten ontwikkelingsbiologie ^5,6, ze hebben een aantal beperkingen, zoals de moeilijkheid om de specificiteit van doelcellen controle, het ongewenste effect van de kleurstof op celgedrag en de verdunning van het label in de tijd. Nucleotideanalogon etikettering benaderingen zijn ingeschakeld documenteren van het bestaan ​​van slow-cycling "label behoud van cellen" die vermoedelijk overeen met stamcellen ^7,8 rusttoestand. Hoewel deze techniek de aanwezigheid van langzaam delende cellen op basis van proliferatie kinetiek gedurende een beperkte tijdsperiode konden aantonen kon geen wezenlijke inzicht over de functionaliteit van stamcellen. Een optimale lineage tracing methdologie dient het effect van etikettering op de eigenschappen van de gemarkeerde cellen, het nageslacht of de buren te minimaliseren. Bovendien zou het gunstig zijn om controle op het etiket inductie, namelijk de mogelijkheid om de celpopulatie label per fase en tijdsafhankelijke wijze als in een enkele cel (klonale) te vervullen. Een stabiele en onomkeerbare labeling methode die wordt doorgegeven aan alle nakomelingen van de cel grondlegger van belang dat het etiket in de tijd worden vastgehouden en niet naar naburige cellen.

Recentelijk genetische benaderingen cel labeling ontwikkeld. In deze systemen kunnen celspecifieke promoters worden gebruikt voor Cre recombinase expressie activeren teneinde een loxP-geflankeerd wegversperring de expressie van reportergenen te verwijderen en zoals groen fluorescent eiwit of Β-galactosidase reporter genen ^9-13. Deze benadering maakt niet alleen het volgen van cellen en hun nageslacht, maar maakt ook celolation en moleculaire karakterisatie. Cell volgen op enkele cel niveau werd mogelijk door inductie van de expressie van een fluorescente reporter gen. Een belangrijke beperking van dit systeem is dat slechts bij zeer lage percentage van cellen gemerkt is het mogelijk om te scheiden en traceren individuele klonen. Om deze beperking veelkleurige reporters kan worden overwonnen. Bij het ​​gebruik van multicolor etikettering, kan het volgen van differentiële lot van naburige cellen in dezelfde niche efficiënt ^14-17 worden bereikt. Recentelijk diverse Brainbow (Br) allelen werden ontwikkeld voor lineage tracing experimenten, waardoor een stochastische expressie van meerdere fluorescente reporter genen met gebruikmaking van de Cre / lox-systeem. De Cre / lox-systeem bestaat uit het Cre recombinase enzym dat herkent en bindt aan specifieke DNA-sequenties zoals loxP sites. Na de binding van Cre recombinase, plaatsspecifieke recombinatie, waardoor het verwijderen van sequenties loxP geflankeerd resulting willekeurige expressie van verschillende fluorescerende eiwitten (het mechanisme wordt hieronder beschreven). Een verscheidenheid van Br lijnen zijn beschikbaar voor gebruik (zie reviews ^16,18,19). De belangrijkste verschillen tussen de Br stammen omvatten (i) verschillen in het aantal fluorescerende genen in de cassette, variërend van 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) tot 4 (Br1.1, Br2.1) fluorescent genen (ii) de aanwezigheid van wederzijds georiënteerd lox locaties aan gen inversie (Br2.0-2.1) maken, (iii) het soort gebruikte lox plaatsen, en (iv) de expressie of stilte van fluorescente genexpressie vóór Cre activatie. Het onlangs gevestigde Br3 biedt een verbeterde werkwijze voor meerkleurige beeldvorming van neuronen. Een van de belangrijkste kenmerken van deze transcriptie is dat het een nieuwe reeks van fotostabiele gefarnesyleerde fluorescerende eiwitten, die een nog kleuring van de fijnste neuronale processen ²⁰ mogelijk te maken bevat.

Belangrijk is, kunnen verschillende versies van Br cassettes neuronale specifieke bevatten Thy1 promoter of alomtegenwoordig tot expressie CAG (CMV) promoter. Tenslotte, terwijl sommige van de Br transgene muizen kan een enkele Br transgen bevatten, andere kunnen bestaan ​​uit meerdere transgene kopieën, waardoor de productie van een enorm aantal mogelijkheden om kleurcombinaties uit te drukken in elke cel (zie bijvoorbeeld ^16).

In onze studie gebruikten we de R26R-Confetti muis die de Br 2,1 cassette ²¹ bevat. Br2.1 is speciaal ontworpen om Cre-gemedieerde DNA inversies en niet alleen uitsnijdingen vanwege de onderlinge oriëntatie van de loxP-plaatsen (figuur 1) mogelijk maken. Zo kunnen deze inversie / uitsnijding gebeurtenissen die leiden tot kleurverandering zolang Cre huidige ¹⁶ blijven. Daarom een ​​induceerbare Cre tijdelijke expressiesysteem is essentieel voor betrouwbare cell tracking behulp Br2.1. In figuur. 1, de Br2.1 bevat een alomtegenwoordige CAG promotor gevolgd door loxP geflankeerd Neo ^R -cassette, die fungeert als een transcriptionele wegversperring, die wordt gevolgd door 4 fluorescerende reporter genen coderend voor groen (GFP), geel (YFP), rood (RFP) en cyaan (CFP) fluorescerende eiwitten, gelegen in twee tandems. Geen fluorescentie wordt vóór Cre activatie expressie. Inductie van Cre recombinase veroorzaakt het verwijderen van de neo-R cassette waarvan de willekeurige expressie van één van de 4 fluorescerende eiwitten in een bepaalde cel. Het eerste segment bevat loxP-geflankeerd GFP en een omgekeerde YFP, terwijl het tweede segment bevat loxP-geflankeerd RFP en een omgekeerde CFP. Deze DNA-segmenten kunnen continu worden geïnverteerd (via loxP dat in omgekeerde richting), of uitgesneden, zolang Cre recombinase aanwezig is. Daarom moet een voorbijgaand en gecontroleerd Cre transgene gebruikt. De Br2.1 cassette biedt een uitstekend systeem voor het onderscheid tussen overlappende uitstoot op signaal locatie: de uitdrukking van YFP en RFP is cytoplasma, de GFP is kernenergie en het GVB is gebonden aan het celmembraan. GFPen RFP emissies worden gemakkelijk gescheiden door conventionele fluorescentiemicroscopie. Om YFP / GFP / CFP emissie scheiden, wordt een spectrale confocale beeldvormingssysteem nodig. Al met al, de Br2.1 cassette maakt de willekeurige, induceerbare, en weefsel specifieke expressie van één van de vier verschillende fluorescerende genen in elke gerichte cel. In feite, wanneer een groter aantal kleurcombinaties nodig, kan homozygote muizen die 2 allelen van Br2.1 in voorkomen, hetgeen resulteert in de expressie van 2 kleurenmarkeringen voor elke cel en het verhogen van het aantal mogelijke kleurencombinaties 10 ^22. Enkele Br muizenstammen mogelijk de expressie van een veel groter aantal mogelijke kleurencombinaties sinds meerdere kopieën van de cassette geïntegreerd in hun genoom ^16. Maar in de meeste gevallen, de vier kleurencombinaties die door één Br2.1 allel volstaan. Volgens het protocol hier verschaft, kan men deze methode tot stand met behulp van een relatief eenvoudige opzet van spectral microscopie met weinig of geen noodzaak tot kalibratie.

Hier geven we een aanpasbare protocol voor het gebruik van de R26R confetti-muizen die één Br2.1 allel bevatten, lineage tracing experimenten van het hoornvliesepitheel. Deze transgene muizenstam is gebruikt voor het bestuderen van de oorsprong en bestemming van de colon ^21,23 en corneale epitheliale stamcellen ^22,24, de aanwezigheid van stamcellen activiteit darmkanker ²⁵ en voor het karakteriseren nieren podocyte bij focale segmentale glomerulosclerose (FSGS) ^17.

Protocol

Ethiek Verklaring: In deze studie dierlijke zorg en het gebruik werden gelijkvormigheid aan het ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research. Alle experimenten werden goedgekeurd door de lokale ethische commissie.

1. Kies een geschikte Cre-recombinase uitdrukken Mouse Strain

1. Uit het grote aantal Cre transgene lijnen verkrijgbaar ²⁶ en afhankelijk van het beoogde weefsel te onderzoeken, kiest een Cre transgene muizenstam waarin het Cre recombinase gen wordt gecontroleerd door een promoter die specifiek is voor het weefsel van belang. In het geval tijdelijke controle nodig is, kies dan een induceerbare Cre lijn.
   Let op: We kozen voor de tamoxifen induceerbare K14-Cre ^ERT transgene specifiek label limbale en cornea epitheliale stamcellen / voorlopercellen ^24. Merk op dat er verschillen kunnen zijn tussen stammen, zoals Di Girolamo en medewerkers gerapporteerd limbale specificiteit zonder cornea uitdrukking voor hun K14-Cre ^{ERT 22.} Een voordeel van het gebruik induceerbare Cre transgene muizen dat het de inductie van lineage tracing veelzijdig tijdframes.

2. Kies een geschikte Br Muis Strain

1. Kies de juiste Br cassette, afhankelijk van de onderzoeksvraag en beschikbaar Cre lijn ^16,18,20.
   1. Als een niet-induceerbare Cre muis stam wordt gebruikt, kies een Br cassette die niet toestaat continu DNA inversies / excisies en daarmee aanleiding geven tot dead-end producten (bijvoorbeeld Br1.0 of Br1.1) ^16.

3. Steek de transgene lijnen van Interest

1. Voor de hier getoonde protocol, steek de homozygote R26R Confetti-stam (Br2.1 / Br2.1) met de homozygote Cre ^ERT stam (Cre ^ERT / Cre ^ERT) naar hemizygoot nakomelingen krijgen (Br2.1 / +; Cre / +) die klaar zijn voor mono-allelische lineage tracing omdat ze bevatten allemaal een enkele Br2.1 allel en zijnenkele Cre allel.
   Opmerking: Om de efficiëntie van de etikettering te verhogen, kan men muizen die twee Cre allelen (Br2.1 / +; Cre / Cre) bevatten genereren, terwijl twee Br2.1 allelen (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) zou verhogen kleurencombinaties (zoals beschreven in ^22).

4. Cre-recombinase Inductie

Opmerking: De toediening van tamoxifen bij deze experimenten werd uitgevoerd door dagelijkse intraperitoneale injectie uitgevoerd voor de duur van 3-4 dagen om de translocatie van Cre recombinase ^ERT te induceren in de kern van limbale cornea en basale K14-positieve stam / voorlopercellen epitheelcellen. Het volgende protocol kan worden gebruikt voor het injecteren van vier muizen. Alternatief topische applicatie van Tamoxifen het oogoppervlak levert hogere efficiëntie. De Tamoxifen oplossing in het donker bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week. Verwarm de oplossing voor gebruik.

1. Weeg 100 mg Tamoxifen en oplossen in 5 ml maïsolie naarvormen een 20 mg / ml oplossing tamoxifen.
2. Injecteer 200 ui Tamoxifen (4 mg) oplossing intraperitoneaal tot 8 weken oude muizen gedurende 3-4 opeenvolgende dagen.
   Opmerking: De Tamoxifen oplossing kan in het donker bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week. Verwarm de oplossing voor gebruik.
3. Voor topicale toediening: weegt 60 mg Tamoxifen en oplossen in 1 ml maïsolie een 60 mg / ml tamoxifen te vormen. Vortex en stel de oplossing in een schuddend waterbad gehandhaafd op 65 ° C totdat het wordt duidelijk laat het in het bad tot gebruik.
   1. Zorgvuldig toepassing 100 ul van de oplossing in elk Tamoxifen oogoppervlak van de muis.

5. Tissue Voorbereiding voor Imaging

1. Opoffering dieren met behulp van isofluraan (2% verdampt zuurstof) anesthesie (bevestiging juiste verdoving door het gebrek aan reflexen) gevolgd door CO ₂ inhalatie op geschikte tijdstippen na injectie en Tamoxifen colteer de relevante weefsel.
   1. Voor deze experimenten ophelderen ogen op de volgende tijdstippen: 1, 4, 8, 12 en 16 weken na injectie Tamoxifen. Bereiken enucleatie met behulp van gebogen pincet. Druk op de oogleden waardoor de oogbol om pop uit de oogkas. Plaats de tang achter de oogbal die de oogzenuw. Trek de oogbol en verwijder.
      Opmerking: In dit stadium, zoals hieronder beschreven weefsels worden bereid voor wholemount analyse van gemerkte cellen. Regelmatige ingevroren weefselcoupes kunnen ook worden bereid, in PFA gefixeerd en afgebeeld zoals hieronder beschreven (zie paragraaf 6 en ^22).
2. Plaats elk oog in een 60 mm schaal gevuld met PBS.
3. Onder een stereomicroscoop behulp van een tang houdt het oog nabij de oogzenuw van de cornea naar beneden en gebruik een scalpel om de oogzenuw, spier- en bindweefsel te verwijderen en een kleine snede in het achterste gedeelte van het oog.
4. Met behulp van de lente een schaar zorgvuldig te vergrotengesneden laten de lens pop uit en verwijder de iris met behulp van een tang.
5. Plat de cornea door 4-5 radiale insnijdingen vanaf het midden naar de omtrek met behulp van een scalpel.
6. Gebruik een scalpel om overtollig perifere weefsels snijden buiten de limbus.
7. Fix hoornvliezen in 4% PFA gedurende 10 min, vervolgens kort wassen met PBS.
8. Incubeer monsters met DAPI gedurende 10 minuten en kort wassen met PBS.
9. Mount hoornvliezen op glasplaatjes met de epitheliale zijde naar boven. Breng een druppel fixeermiddelen bovenop het hoornvlies en deksel met een dekglas. Laten drogen slides O / N bij RT. Houd slides bij 4 ° C.

6. confocale microscopie en beeldanalyse

1. Gebruik een spectrale confocale systeem dat scheiding van YFP / GFP / CFP uitstoot mogelijk maakt. Set fluorescentie-excitatie en emissie golflengten afhankelijk van de fluorescerende eiwitten van de Br cassette. Kies de meest geschikte golflengte voor elk eiwit gericht op het minimaliseren kruisexcitatie. Kies smalle emissie varieert teneinde het lekken van signalen van de verschillende eiwitten te minimaliseren.
   1. Voor de Br2.1 cassette, gebruik dan de volgende set-up van de fluorescentie excitatie (ex) en emissie (em) als uitgangspunt: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, CFP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm en RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm.
2. Om grote weefselgebieden visualiseren met hoge resolutie verwerven tegel beeldvorming. Voor de in figuur 2A-B, beeld het gehele hoornvlies door het verkrijgen van een array van 12 x 12 beelden, namelijk resultaten verkrijgen 144 velden (512 x 512) met behulp 4 fluorescente kanalen in elk veld. Alles bij elkaar te verzamelen 576 beelden en vervolgens samen te voegen.
3. Om de lokalisatie van gemerkte cellen in verschillende diepten en structuren van het weefsel staand verwerven Z-stack beelden van verschillende gebieden van belang. Om to imago van de volledige diepte van het hoornvlies, te verwerven 8 optische secties 3 micrometer intervallen. Orthogonale uitzicht op de alsmede verzameld image projecties gebaseerd op maximale intensiteit secties kunnen worden gebouwd met behulp van conventionele imaging software ^24.

7. hoornvliesletsel gecombineerd met Tamoxifen Inductie

1. Verdoven muizen met isofluraan (2% verdampt in zuurstof) en dienen analgetica (10 mg / kg Carpofen, subcutaan). Bevestig de juiste verdoving door ongevoeligheid tot teen-snuifje.
2. Weeg 1 g poeder Tamoxifen en oplossen in 5 ml steriel DMSO tot 200 mg / ml concentratie in oplossing leidt.
3. Tamoxifen Verwarm de oplossing 65 ° C in een waterbad totdat de oplossing helder. Bewaar oplossing in het bad tot gebruik.
4. Gelden oogzalf met de onbehandelde contralaterale oog om uitdroging tijdens anesthesie te voorkomen. Heeft een dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende con heeft herwonnenbewustzijn te borstligging handhaven. Niet muizen die ogen verwonden aan het gezelschap van andere muizen hadden ondergaan, totdat volledig hersteld terugkeren. Muizen moeten nauwgezet worden gevolgd na het letsel. Indien verliezen ze meer dan 10% van hun lichaamsgewicht, lijden corneale erosie, of ongemak, wordt het experiment gestopt. Herhaal analgetica toediening elke 24 uur gedurende het gehele experiment.
5. Met behulp van een steriele spuit, zonder naald die eraan verbonden zijn; toepassing 200 ul Tamoxifen oplossing topisch over het gehele hoornvlies van een oog van elke muis.
   Opmerking: De vloeibare oplossing stolt snel aan het oogoppervlak bij KT. Het effect van hoornvliesletsel afhankelijk van de ernst van de wond. Na een toepassing van Tamoxifen / DMSO oplossing geen nadelige effecten worden waargenomen in de muizen. In het geval van herhaalde toepassingen kan het hoornvlies worden waargenomen.
6. Ga verder met het prepareren van weefsels en beeldvorming (zie parionen 5 en 6) op relevante tijdstippen. Voor de hier getoonde resultaten, offeren de muizen (zoals beschreven in fase 5.1), een week na de verwonding (figuur 2 en ^24).

Resultaten

Onlangs hebben we gericht op het identificeren van de oorsprong, de overleving en migratie van stamcellen en stamcellen van het cornea epitheel ^24. Accumulerende bewijs ondersteunt het dogma dat het hoornvliesepitheel wordt geregenereerd door stamcellen uitsluitend in het limbale gebied, een ringvormige zone in het corneale periferie. Deze theorie wordt ondersteund door in vitro en in vivo gegevens, en klinisch bewijs dat de basis verschaft voor een succesvolle baanbrekende limbale stamcellen celtherapie ^27-29. Echter, bleef dit onderwerp zeer besproken in de afgelopen jaren als gevolg van een studie op basis van limbale enten experimenten die suggereerde dat de muis limbus neemt niet deel aan het hoornvlies vernieuwing ^30. Om deze interessante hypothese te testen, lineage tracing experimenten met R26R-Confetti muizen werden uitgevoerd, om het lot van limbale en cornea epitheliale stamcellen / voorlopercellen onder steady-state condities te volgen voor maximaal 120 dagen ^24.Ogen waren enucleated en een flatscreen-mount hoornvliezen werden geanalyseerd door spectrale confocale laser scanning fluorescentiemicroscopie 10 en 120 dagen na Tamoxifen injectie. Zoals verwacht, werden sporadische kleine clusters van fluorescerende cellen door het oogoppervlak waargenomen 10 dagen na injectie, terwijl 1-4 maanden later (figuur 2B en ²⁴⁾ langwerpige stroken die zich uitstrekken vanaf de limbus richting het hoornvlies centrum langzaam ontwikkeld. Dit resultaat suggereert dat de cornea wordt geregenereerd door cellen die migreren uit de limbus naar het midden van de cornea. Vervolgens regeneratie onder verwonden voorwaarden hoornvlies werd onderzocht. Om het lot van K14-positieve limbale / hoorncellen testen onder omstandigheden verwonden tijdens induceren efficiënt cell tracking, we opgelost de Tamoxifen in dimethylsulfoxide (DMSO), die hoornvliesbeschadiging bij topicale toepassing veroorzaakt. Op deze manier zijn we erin geslaagd om een lichte verwonding veroorzaken als een enkele topische applicatie werd toegepast (figuur 2C), mo derate verwonden als extra DMSO alleen behandeling werd toegepast op de dag vóór Tamoxifen inductie of ernstige wond wanneer DMSO alleen lokaal in 2 opeenvolgende dagen werd toegepast voorafgaand aan Tamoxifen inductie.

In tegenstelling tot de dunne limbale strepen die langzaam ontwikkeld en bereikte het hoornvlies centrum binnen 4 maanden onder steady-state condities, celmigratie na letsel was snel. Opmerkelijk waren lang en dik limbale strepen reeds ontwikkeld onder deze omstandigheden binnen 7 dagen. Interessant, diversiteit kleur was soms minimaal (Figuur 2D). In onze handen, af en toe, vooral rode cellen werden geïdentificeerd in het hele hoornvlies, wat aangeeft dat de diversiteit kleur kan worden beïnvloed in de richting van specifieke fluoroforen. Deze ongewenste vertekening kan worden gekalibreerd door dosis-respons testen zoals eerder gemeld in Br1.0L ^{31 en} in Br2.1 ^21.

les / ftp_upload / 53.370 / 53370fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematische weergave van de R26R-Confetti construct. (A) De R26R confetti-construct bevat een CAG promotor voor hoge expressie niveaus, een loxP (zwarte driehoek) -flanked Neo ^R -roadblock en de Brainbow2.1 cassette op de Rosa26 locus ^16,21. De Brainbow2.1 cassette omvat twee kop-staart-loxP geflankeerd dimeren. Een dimeer bestaat uit nucleair gelokaliseerde green fluorescent eiwit (GFP) en een reverse-georiënteerde cytoplasmatisch geel fluorescerend eiwit (YFP, de omgekeerde oriëntatie wordt aangeduid - PFY). De tweede dimeer bevat cytoplasma RFP en een reverse-georiënteerde membraan-tethered cyaan fluorescente eiwit (GVB, de omgekeerde richting wordt aangeduid - PFC) ^16. (B - E) Bij het ​​Cre-recombinase activering, verschillende uitsnijding en inversie gebeurtenissen kunnen optreden; mogelijke uitkomsten zijn exemplified in B - E. De Cre-activiteit induceert stochastische herschikking van de cassette leidt tot gen verhuizingen en / of omkeringen en dus resulteert in de willekeurige expressie van één van de vier fluorescerende eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Cornea lineage tracing onder homeostase en verwondingen. R26R-confetti / K14-Cre muizen werden geïnjecteerd met 4 mg Tamoxifen zoals beschreven in het protocol. In de aangegeven tijdstippen plaatsen afgevlakt inductie hoornvliezen werden afgebeeld (A - B). Corneale verwonding gekoppeld Cre inductie werd bereikt door topische applicatie van Tamoxifen opgelost in DMSO (C - D). Mozaïek verkregen beeldendoor multichannel betegelen spectrale confocale microscopie worden getoond (A - D). In homeostase, radiale limbale strepen van langzame migrerende cellen verlengd tussen de limbus en het hoornvlies centrum. Deze strepen ontwikkelde langzaam, het bereiken van het hoornvlies centrum binnen 4-5 maanden (B). Clusters van het hoornvlies cellen waren duidelijk ook (witte pijlen, B). Daarentegen grote limbale stroken verschenen binnen één week onder condities verwonding (C). Een voorbeeld van kleurzweem verscheidenheid aan rode cellen (D). De limbale cornea-grens wordt geannoteerd door een stippellijn. Schaal bar is 500 pm. Afkortingen: GVB, cyaan fluorescente eiwit; GFP, groen fluorescent eiwit; RFP, rood fluorescerend eiwit; YFP, geel fluorescerend proteïne. Dit cijfer is aangepast van ^24. Klik hier om een grotere versie te bekijkendit cijfer.

Discussie

Lineage tracing experimenten zijn uitgevoerd voor vele jaren. De recente technologische verbeteringen en de opkomst van de Confetti muizenstammen opende nieuwe mogelijkheden voor onderzoek. Tegenwoordig kunnen onderzoekers profiteren van een groot aantal commercieel verkrijgbare weefsel-specifieke Cre lijnen knockout muizen en transgene muizen. Dit biedt de mogelijkheid voor het ontwerpen van veelzijdige experimentele systemen voor de aanpak van wetenschappelijke vragen met elementaire kennis, het vermijden van moeizame praktijk, terwijl het verstrekken van robuuste en betrouwbare gegevens.

R26R-Confetti muizen een elegant middel voor efficiënte tracking en bestuderen van de aard en het gedrag van cellen in een levend organisme. Het systeem is eenvoudig vast te stellen en geeft niet-invasieve stam traceren van afzonderlijke cellen gedurende embryogenese stamcel regeneratie onder homeostase, of onder verschillende omstandigheden, zoals letsel, ontsteking en kanker. De verkregen data biedt een robuuste description van het voortbestaan ​​van gerichte cellen, klonale cel expansie en cel migratie, in een meetbare manier. Een kritische stap is om de juiste genetische muizenstam die met zekerheid kan toestaan ​​weefselspecifieke efficiënte labeling op een bepaald ontwikkelingsstadium te kiezen. Een beperking van dit systeem is dat voor het bewaken van een levend organisme, weefsel toegankelijk en transparant moeten zijn. Evenzo volgen van een dikke weefsel in een levend dier kan alleen worden vergemakkelijkt door twee-foton of meerdere foton microscopie. Echter, cell tracking is mogelijk postmortem weefselsecties en misschien intact weefsel worden onderzocht nadat deze is getransformeerd door de transparante CLARITY werkwijze ^32,33 te worden. Een andere beperking te worden beschouwd is dat hoewel aangrenzende cellen die dezelfde fluorofoor expressie waarschijnlijk tot dezelfde klonale lijn, is het mogelijk dat zij kunnen worden verkregen uit onafhankelijke celoorsprong die willekeurig expressie dezelfde fluorescerende gen. Dit possibility wordt zeer waarschijnlijk bij het gebruik van meerdere Br allelen tal van kleurencombinaties mogelijk te maken.

In de toekomst, het combineren van de Confetti-systeem met de beschikbare genetische instrumenten (dwz, knockout, knockin en transgene muismodellen) zal de studie van de genen en hun mutaties in gezondheid en pathologie toe. Ook lineage tracing systeem onder verschillende storingen (dwz stamcel niche vernietiging, laser gemedieerde cel ablatie, behandeling met geneesmiddelen) zal nieuwe inzichten brengen op de betrokkenheid van de signaalwegen in de cel beslissingen over het lot. Uiteindelijk is de combinatorische gebruik van fluorescerende en bioluminescentie etikettering, genetische verslaggevers van signaalwegen en geavanceerde microscopie zullen onderzoekers van een robuust systeem om te leren hoe enkele cellen reageren op hun omgeving in hun eigen omgeving.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
R26R-Confetti transgene muizen homozygoot voor de Brainbow 2.1 cassette	Jackson	stam #013731
K14-CreERT muizen	Jackson	stam #005107
tamoxifen	Sigma	T5648
isofluraan USP Terrell	Piramal Critical Care
Carprieve 30	b.wt
DMSO	Sigma	D2650
DAPI	Sigma	D9542	gebruikt bij een concentratie van 4 µg/ml
Immu Mount	Thermo Scientific	9990402
LSM 510 Meta laser scanning confocal systeem aangesloten op een geïnverteerde gemotoriseerde microscoop (Axiovert 200M) uitgerust met een gemotoriseerde stage	Zeiss		De spectrale overlap tussen GFP, YFP en CFG vereist het gebruik van spectraal beeldvorming die de scheiding van de emissiespectra van de fluorescente eiwitten mogelijk maakt. Hier gebruiken we de Zeiss LSM 510 Meta spectrale confocale microscoop. De Meta detector die in dit systeem is opgenomen, heeft 32 detectorelementen die elk emissie verzamelen vanuit een golflengteband van 10 nanometer. Deze techniek, "spectraal vingerafdrukken" genoemd, stelt de gebruiker in staat om de meest adequate grenzen voor golflengtefiltering in te stellen. Er is een verscheidenheid aan spectrale confocale systemen die kunnen worden gebruikt, waaronder Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).
Zen 2009 Imaging Software	Zeiss
Duratears-oogzalf	Alcon