Fysieke Isolatie van Endospores van milieu monsters door Gerichte Lysis van vegetatieve cellen

Samenvatting

Er werd een methode ontwikkeld om bacteriële endosporen uit complexe microbiële gemeenschappen te isoleren om op maat gemaakte kweek- of moleculaire studies van deze groep bacteriën uit te voeren.

Samenvatting

Endosporevorming is een overlevingsstrategie die voorkomt bij sommige bacteriën uit het phylum Firmicutes. Tijdens de endosporevorming gaan deze bacteriën een morfo-fysiologische rusttoestand in die de overleving onder ongunstige omgevingsomstandigheden verbetert. Hoewel endosporevormende Firmicutes een van de meest frequent verrijkte en geïsoleerde bacteriegroepen zijn in kweekstudies, ontbreken ze vaak in diversiteitsstudies op basis van moleculaire methoden. De weerstand van de spoorkern wordt beschouwd als een van de factoren die de herstel van DNA uit endosporen beperken. We ontwikkelden een methode die gebruikmaakt van de hogere weerstand van endosporen om ze te scheiden van andere cellen in een complex microbiële gemeenschap door middel van fysische, enzymatische en chemische lysismethoden. De endospore-voorbereiding die zo wordt verkregen, kan worden gebruikt voor hercultivering of voor downstream-analyse zoals aangepaste DNA-extractie geoptimaliseerd voor endosporen en daaropvolgende DNA-sequencing. Deze methode, toegepast op sedimentmonsters, heeft de verrijking van endosporen mogelijk gemaakt en na sequencing heeft het een grote diversiteit aan endospore-vormers in zoetwatermeersedimenten onthuld. We verwachten dat de toepassing van deze methode op andere monsters een vergelijkbaar resultaat zal opleveren.

Inleiding

Het doel van dit werk is om een ​​protocol voor de scheiding van bacteriële endosporen van vegetatieve bacteriële cellen in het milieu monsters. De vorming van bacteriële endosporen een overlevingsstrategie, gewoonlijk veroorzaakt door verhongering gevonden in een aantal bacteriële groepen die tot phylum Firmicutes ^1. Endospore-vormende bacteriën zijn goed bestudeerd, vooral omdat een aantal stammen zijn ziekteverwekkers en dus van medisch belang (bijvoorbeeld Bacillus anthracis of Clostridium difficile). Milieu stammen van endospore-vormende bacteriën zijn geïsoleerd uit vrijwel elke omgeving (bodem, water, sedimenten, lucht, ijs, menselijke darm, dieren gut, en meer) ^1-3. Daarom Firmicutes zijn de tweede meest voorkomende stam in cultuur collecties ^4.

Door hun sterke buitenste cortex en beschermende kern eiwitten, kan endospores extreme omstandigheden, variërend fr overlevenOM verdroging te hoge straling, extreme temperaturen en schadelijke chemische stoffen ^5. Deze opmerkelijke weerstand maakt het een uitdaging om DNA uit endospores ^6-8 halen. Dit verklaart waarschijnlijk waarom ze zijn over het hoofd gezien in het milieu sequencing studies ^9,10. Andere methoden, zoals de concentratie van endospores milieumonsters door fluorescente antilichamen ^11, kwantificatie van dipicolinezuur (DPA) in grond en sediment ^{13 12} flowcytometrie ¹⁴ of pasteurisatie en daaropvolgende kweek ^15,16 zijn gebruikt om endosporen halen of kwantificeren milieu monsters. In de afgelopen jaren, geoptimaliseerde DNA-extractie werkwijzen en specifieke moleculaire primers te richten endospore-specifieke gensequenties ontwikkeld ^10,17-20. Dit heeft bijgedragen aan meer biodiversiteit onder deze groep van bacteriën ²¹ onthullen en heeft ook geleid tot toepassingen in de industrie en de geneeskunde voor de detectie van endosporesBijvoorbeeld in melkpoeder ^19.

De hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op het verschil in weerstand tegen schadelijke fysisch-chemische omstandigheden (zoals warmte en detergenten) van bacteriële endosporen opzichte van vegetatieve cellen. Om vegetatieve cellen in een monster te vernietigen, we achtereenvolgens toepassen warmte, lysozym en lage concentraties van detergenten. De tijd en de sterkte van deze behandelingen zijn geoptimaliseerd om geen sporen te vernietigen, maar voor alle vegetatieve cellen lyseren. Sommige cellen in een milieu celpool meer resistent dan andere, dus om de kans op het vernietigen van alle vegetatieve cellen verhogen we drie behandelingen toegepast. Het voordelig nieuwheid van deze werkwijze is dat de endosporen na de behandeling nog steeds intact en kan worden gebruikt voor verdere stroomafwaartse analyses. Deze omvatten DNA-extractie, kwantitatieve PCR (qPCR) en amplicon of metagenomic sequencing (gericht op met name de groep van endospores en dus het verminderen van diversity, terwijl het verhogen van de dekking). De endosporen kan ook worden gebruikt voor stroomafwaartse cultuur- of kwantificatie met behulp van fluorescentie microscopie, flow cytometrie, of detectie van DPA. Een belangrijk kenmerk van deze methode is dat door een onbehandeld monster met een behandeld monster, kan men de hoeveelheid en de diversiteit van endosporen afleiden in een milieumonster naast de component die overeenkomt met vegetatieve cellen.

Protocol

1. Bereiding van chemicaliën en apparatuur

1. Voeg 500 ml van een 1% natriumhexametafosfaat (SHMP) (NaPO _{3) n-oplossing} en te steriliseren in de autoclaaf.
2. Steriliseren nitrocellulose (NC) filters (poriegrootte 0,22 pm, een diameter van 47 mm) in de autoclaaf in gesloten glazen petrischaaltjes.
3. Steriliseren NC filters (poriegrootte 0,22 pm, diameter 25 mm) in de autoclaaf in gesloten glazen petrischaaltjes.
4. Weeg en noteer het leeggewicht van de steriele 50 ml buizen (met pet op) (één tube per monster).
5. Bereid Tris-EDTA-buffer (TE-buffer) 1x: maak oplossing van 10 mM Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethaan) en 1 mM EDTA buffer. Stel de pH tot 8 en steriliseer in de autoclaaf.
6. Bereid lysozym oplossing (20 mg / ml) door het oplossen van 0,02 g lysozym in 1 ml TE-buffer. Idealiter maken fris elke keer. Bewaren bij 4 ° C voor niet meer dan 1 week.
7. Bereid fysiologische oplossing door het oplossen van 8 g / L natriumchloride(NaCl) in gedestilleerd water. Steriliseren in autoclaaf.

2. Scheiding van biomassa uit sediment

1. Voeg 3 g sediment monster vooraf gewogen steriele 50 ml buizen met behulp van ethanol gevlamd metalen bolletjes. Voer deze in een schone, UV gesteriliseerde bioveiligheid kast om besmetting te voorkomen.
2. Voeg 15 ml van een 1% steriele (autoclaaf) SHMP oplossing voor het monster met een steriele afgestudeerd buret. De SHMP oplossing kan ook worden gefilterd om besmetting te voorkomen.
3. Homogeniseer het sediment en SHMP oplossing met een vloeibare verstrooier / homogenisator (bijvoorbeeld Ultra-Turrax homogenisator). 70% ethanol-of stoom steriliseren de dispersie rotor vóór gebruik. Voer het homogeniseren gedurende 1 min bij 17.500 rpm. Laat het monster 2 minuten rusten en herhaal het homogeniseren gedurende 1 minuut bij dezelfde rotorsnelheid.
4. Laat het monster staan ​​voor 10 min. Bij deze stap, zal de zwaarste deeltjes (mineralen) te beslechten. De cellen en de organische bestanddelen van het monster evenwel wziek in oplossing blijven. Daarna breng de bovenstaande oplossing (met cel biomassa) in een schone 50 ml tube, terwijl de zorg het sediment pellet niet te verstoren.
5. Om het sediment pellet toe weer 15 ml van een 1% steriele (autoclaaf) SHMP oplossing met behulp van een steriele afgestudeerd buret. Dan stappen herhalen 2.3 en 2.4. Deze herhaling zorgt voor de scheiding van de maximale hoeveelheid cellen en organische deeltjes van de minerale component van het sediment. Het supernatant van deze tweede scheiding kan worden samengevoegd met de supernatant uit de eerste scheidingszone.
   Opmerking: De volgende stappen worden allen uitgevoerd op het supernatant (cel bevattende biomassa). De minerale component (sediment pellet) worden weggegooid.
6. Centrifugeer het monster bij 20 xg gedurende 1 min. Deze stap verhoogt de g-kracht genoeg om kleine minerale deeltjes bezinken, terwijl de biologische cel materiaal blijft in oplossing. Na centrifugeren breng de bovenstaande oplossing (bevattende cel biomassa) in eenschoon 50 ml buis. Gooi het mineraal pellet.
7. Bepaal het eindvolume van de oplossing bevattende biomassa door weging van het monster. Het gewicht bepaling wordt voorkomen dat het monster over te dragen aan een maatcilinder en vermindert het risico op besmetting.

3. Het verzamelen van biomassa op filtermembraan

1. Bereid filtratie-eenheid (47 mm diameter membranen) en vacuümpomp. Steriliseer de filtratie-eenheid ofwel de autoclaaf of (indien Pyrex glas) door besproeien met 70% ethanol en vlammen met een bunsenbrander. Laat het afkoelen voordat u verder gaat met het protocol.
2. Voeg steriel NC membraan naar de filtratie-eenheid met behulp van ethanol gevlamd gesteriliseerde pincet.
3. Voeg de helft van de supernatant monster (van stap 2,6) op de membraanfiltratie-eenheid en het verzamelen van cellen op het membraan met behulp van de vacuümpomp.
4. Wanneer de vloeistof volledig is door het filter, stop de vacuümpomp en verwijder het membraan met behulp ethanol-vlam gesteriliseerd pincet. Plaats het membraan in een steriele petrischaal.
   1. Snijd het membraan in de helft gebruik van ethanol gevlamd gesteriliseerd schaar. Naar elke helft van het membraan om een ​​aparte 2 ml buis. Eén helft van het membraan wordt gebruikt voor DNA-extractie en analyse van het volledige bacteriële gemeenschappen. De andere helft van de filter wordt opgeslagen bij -80 ° C en dient als backup.
5. Plaats nieuwe NC membraan op de filtratie-eenheid en het verzamelen van biomassa uit de tweede helft van het monster volume (van stap 2.6) met behulp van de vacuümpomp.
6. Wanneer de vloeistof volledig is door het filter, stop de vacuümpomp en verwijder het membraan met behulp van ethanol gevlamd gesteriliseerde pincet. Plaats het gehele membraan in een afzonderlijke 2 ml buis. Dit monster wordt gebruikt voor de behandeling endosporen scheiden van vegetatieve cellen. Het monster kan worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik.

4. Lysis van vegetatieve cellen

1. Voer debehandeling endospores van vegetatieve cellen te scheiden van de biomassa eerder verzamelde op een NC membraan (stap 3.6).
   1. Indien het membraan werd bevroren, laat het op kamertemperatuur 10 minuten te ontdooien. Plaats dan het membraan in een steriele petrischaal en snijd het (ongeveer 4 keer) in kleinere stukken met behulp van ethanol gevlamd gesteriliseerd schaar. Plaats dan alle membraanfilter stukken in een steriele 2 ml buis.
2. Voeg 900 ul 1x TE (Tris-EDTA) buffer (zie 1.5) aan de buis met het monster membraan en meng goed door de vortex. Bij deze stap wordt de biomassa uit het membraan in de TE-bufferoplossing.
3. Plaats de buis in een incubator bij 65 ° C gedurende 10 min en 80 rpm. Daarna verwijdert de buis uit de incubator en laat het afkoelen gedurende 15 minuten.
4. Voeg 100 ul vers bereide lysozyme (zie 1.5) tot een eindconcentratie van 2 mg / ml te bereiken. Laat de lysozym niet toe te voegen voordat het monster is afgekoeld tot 37 ° C, omdat dit zou kunnen degrade het enzym.
5. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 60 min en 80 rpm, de optimale voorwaarden voor lysozym vegetatieve cellen lyseren.
6. Na lysis is voltooid, voeg 250 gl 3 N natriumhydroxide (NaOH) en 250 pl 6% natriumdodecylsulfaat (SDS) oplossing van het monster. Door toevoeging van deze, het monstervolume bereikt 1,5 ml en er is een eindconcentratie van 0,5 N NaOH en het uiteindelijke concentratie van 1% SDS.
7. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 60 min en 80 rpm. Het toevoegen van de basis en wasmiddelen zal helpen bij het laatste cellysis. De concentratie van deze detergentia is geoptimaliseerd om geen endosporen schaden, terwijl lyseren vegetatieve cellen.
8. Bereid een steriele filtratie-eenheid die 25 mm diameter membraan houdt de autoclaaf, of (indien Pyrex glas) besproeien met 70% ethanol en vlammen met een bunsenbrander. Laat het afkoelen.
9. Plaats een 0,2 urn NC membraan (25 mm diameter) van de filtratie-eenheid met behulp van ethanol vlam gesteriliseerde pincet.
10. Voeg het monster van stap 4.7 op het membraan en filtreren van de vloeistof met de vacuümpomp. Wanneer vloeistof door voorbij is, schakelt de vacuümpomp. Bij deze stap wordt de vegetatieve gelyseerd celmateriaal verwijderd, aangezien het niet op het membraan vastgehouden. Slechts endosporen wordt op het membraan achterblijven.
11. Voeg 2 ml steriele fysiologische oplossing te wassen resterende detergenten en filteren de vloeistof met behulp van de vacuümpomp.
12. Wanneer vloeistof volledig is gefilterd, schakelt de vacuümpomp. Laat het membraan op de filtratie-eenheid.

5. DNase behandeling

Opmerking: Voer de DNase behandeling direct op het filter membraan. Het is belangrijk dat het filtersysteem niet lekt en de vacuümpomp uitgeschakeld.

1. Voeg 450 ul van steriel water, 50 pl DNase reactie buffer (1x) en 0,5 ul DNase enzym direct op het filter membraan en laat het staan ​​voor 15 min. Als het mogelijk is, doe dit de spijsvertering in een kamer die een beetje oorlogmer dan gemiddeld RT, aangezien het enzym beter werkt bij een temperatuur van 25 ° C en hoger.
   Opmerking: Houd de bunsenbrander vernietiging van het filtersysteem verhoogt ook de temperatuur en heeft het extra voordeel van het houden van de steriele omgeving, dus minder kans op contaminatie van de monsters.
2. Wanneer de DNase spijsvertering is voltooid, zet vacuümpomp om het enzym uit het monster te verwijderen.
3. Afwassen resterende enzym door het toevoegen en het filteren van 1 ml fysiologische oplossing.
4. Als er vloeistof volledig voorbij is, schakelt vacuümpomp en verwijder het filter membraan dat endospores met steriele pincet en leg het in een steriele petrischaal.
   Opmerking: Het monster afgescheiden endospores is nu klaar voor downstream analyse. Bewaar bij -20 ° C indien gebruikt voor DNA-extractie of alternatief bij 4 ° C indien voor kweekdoeleinden.

Resultaten

De hier gepresenteerde resultaten zijn eerder verschenen ^10,21. Verwijzen wij u naar die artikelen voor de milieu-interpretatie en bespreking van de gegevens.

De algemene procedure wordt samengevat in figuur 1 en komt overeen met drie stappen: eerst de scheiding van biomassa uit sediment of andere milieu-matrix; tweede, de vernietiging van vegetatieve cellen; en ten derde de stroomafwaartse analyse van de afgescheiden endosporen. Downstream analys...

Discussie

De weerstand van endosporen externe agressieve fysisch-chemische factoren (bijvoorbeeld temperatuur of detergenten) werd gebruikt om een methode om bacteriële endosporen scheiden van vegetatieve cellen milieumonsters bedenken. Dit is de eerste uitgebreide methode endosporen van milieumonsters te isoleren op een niet-destructieve wijze. Vorige methoden te kwantificeren, sporen of endospores in monsters te analyseren gebaseerd op de meting van specifieke proxies voor endosporen zoals dipicolinezuur of specifieke ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Whatman nitrocellulose membraanfilters, 0,2 μm poriegrootte, 47 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  60-00-4
Lysozym uit kippeneiwitje	Sigma-Aldrich	62971 Fluka	poeder, CAS  12650-88-3
Ultra-Turrax homogenisator T18 basic	IKA	3720000
Glazen filterhouders voor 47 mm membranen, Pyrex glas	EMD Millipore	XX10 047 00
Chemische vacuümpomp	Millipore	WP6122050	220 V/50 Hz
Manifold bemonsteringsfiltratie voor 25 mm membranen	Millipore	1225 Sampling Manifold	polypropyleen
Dnase	New England Biolabs	M0303S	Rnase vrij
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  1310-73-2
Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma
Whatman nitrocellulose membraanfilters, 0,2 μm poriegrootte, 25 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich