Method Article

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

DOI:

10.3791/53447

⸱

March 1st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Stem Cell & Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke hartweefselengineering kan een fundamentele impact hebben op therapeutische ontdekking door de ontwikkeling van nieuwe soortspecifieke screeningssystemen die de biofidelity van driedimensionale inheemse menselijke myocardium repliceren, terwijl ook een gecontroleerd niveau van biologische complexiteit mogelijk maken en niet-destructieve longitudinale monitoring van weefselcontractiele functie toestaan. Aanvankelijk werden humane geëngineerde hartweefsels (hECT) gecreëerd met behulp van de volledige celpopulatie verkregen uit gerichte differentiatie van humane pluripotente stamcellen, wat typisch minder dan 50% cardiomyocyten opleverde. Om echter betrouwbare voorspellende modellen van menselijke myocardium te creëren en mechanismen van heterocellulaire interactie te verduidelijken, is het essentieel om de biologische samenstelling in geëngineerde weefsels nauwkeurig te controleren.

Om deze beperking aan te pakken, gebruiken we live celsortering voor de cardiovasculaire oppervlaktemarker SIRPα en de fibroblastmarker CD90 om weefsels te creëren die een 3:1-verhouding van deze celtypen bevatten, die vervolgens worden gemengd en toegevoegd aan een collageen-gebaseerde matrixoplossing. Resulterende hECTs zijn dus volledig gedefinieerd in zowel hun cellulaire als extracellulaire matrixsamenstelling.

Hier beschrijven we de constructie van gedefinieerde hECTs als een modelsysteem om mechanismen van cel-celinteracties in celtherapieën te begrijpen, met behulp van een voorbeeld van humane beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (hMSC) die momenteel worden gebruikt in humane klinische proeven. De gedefinieerde weefselsamenstelling is onmisbaar om te begrijpen hoe de hMSCs mogelijk interageren met de endogene hartceltypen om weefselfunctie te verbeteren. Er wordt ook een bioreactorsysteem beschreven dat gelijktijdig zes hECTs parallel cultiveert, wat een efficiënter gebruik van de cellen na sortering mogelijk maakt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiale tissue engineering is sterk gevorderd in de afgelopen tien jaar, met meerdere groepen publiceren van resultaten van volledig functioneel, het verslaan van weefsels, vervaardigd van zowel muizen hartspiercellen 1-6 en, meer recentelijk, menselijke stamcel-afgeleide cardiomyocyten 7-12. Het hartweefsel vakgebied dat wordt aangedreven door twee primaire en wezen onafhankelijk doelen: 1) om exogene transplantaten die kunnen worden getransplanteerd in falende harten functioneren 4-6 verbeterd; en 2) de ontwikkeling in vitro modellen voor het bestuderen van de fysiologie en ziekte, of screeningsmethoden voor therapeutische ontwikkeling 2,7.

Drie-dimensionale (3-D) celkweek is essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe generatie screeningsmethoden, als de 3-D matrix geeft een natuurlijker cardiale micro dan traditionele 2-D monolaag celcultuur beschouwd; inderdaad een aantal aspecten van celbiologie totaal andere 2-D versus 3-D kweken 13,14 . Bovendien zijn ontworpen hartweefsel opgebouwd uit volledig gedefinieerde componenten: een extracellulaire matrix, en een celpopulatie. Voor traditionele gemanipuleerde menselijke cardiale weefsels, terwijl de extracellulaire matrix samenstelling (gewoonlijk fibrine 9 of collageen 7,8,10) streng wordt gecontroleerd, de invoercel samenstelling minder goed gedefinieerd, door het hele mengsel van cellen van een gerichte cardiale differentiatie van beide embryonale stamcellen (ESC 7,9) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC 10,12) worden toegevoegd aan de weefsels. Afhankelijk van de specifieke cellijn en de efficiëntie van de differentiatie protocol, kan de resulterende percentage hartspiercellen variëren van minder dan 25% tot meer dan 90%, de specifieke hartspierfenotype (dwz ventricular-, atriaal of gangmaker-achtig) kan ook variëren, zelfs de niet-cardiomyocyt fractie kan zeer heterogeen 15,16 en de looptijd van de gedifferentieerde cardiale m veranderenyocytes 17.

Recente hartweefsel engineering heeft getracht de ingang celpopulatie controleren, met ofwel een cardiale reporter humane embryonale stamcellijn 8 of celoppervlak markers 18 wordt gebruikt om de hartspiercel component van de differentiatie isoleren. Hoewel aanvankelijk een weefsel uit slechts cardiomyocyten lijkt het ideaal zijn, is dit in feite niet het geval; hECTs uitsluitend uit cardiomyocyten niet comprimeren tot functionele weefsels met bepaalde groepen vinden van een 3: 1 verhouding van cardiale myocyten: fibroblasten die de hoogste twitch kracht 8. Via verschillende celselectie methoden, waaronder oppervlakte merkers voor levende celsortering, kan men hECTs met gedefinieerde celpopulaties maken. Terwijl markers van niet-cardiale stromacellen enige tijd beschikbaar CD90 19,20 zijn, zoals de vermeende fibroblast marker zijn oppervlaktemerkers van cardiale myocyten moeilijker geweestte identificeren. SIRPα was een van de eerste cardiale oppervlakte merkers geïdentificeerd voor menselijke cardiale myocyten 18 en blijkt zeer selectief voor de cardiale lijn zijn. Onlangs hebben we gevonden dat dubbel met gescheiden SIRPα + en CD90 - cellen geeft nagenoeg zuiver cardiomyocyten met de CD90 + populatie vertoont een fibroblast-achtige fenotype (Josowitz, ongepubliceerde waarnemingen). Op basis van deze bevindingen verzameld, hierin beschrijven we creëren hECTs met een 3: 1 combinatie SIRPα + / CD90 - CD90 + cardiomyocyten en fibroblasten.

De mogelijkheid om een ​​volledig gedefinieerd menselijk hartweefsel ingenieur is niet alleen essentieel voor het creëren van robuuste screening instrumenten, maar ook voor het ontwikkelen van modellen voor opkomende cel- en gen-gebaseerde cardiale therapieën te onderzoeken. Vooral veel celtherapie voor hartfalen, gebruik celtypen waaronder mesenchymale stamcellen (MSC) 21 , cardiale stamcellen 22 en beenmerg mononucleaire cellen 23-25, getest in klinische studies. Hoewel veel van de eerste resultaten zijn veelbelovend 21,23,25, de aanvankelijke voordeel vermindert vaak tijd 26-29. Een soortgelijke trend is gemeld bij muizen gemanipuleerde cardiale weefsels, die een belangrijke functionele voordelen te geven als gevolg van MSC suppletie, maar het voordeel is bij langdurige cultuur 1 niet volgehouden. Grondslag liggen aan de sub-optimale prestaties is onze beperkte kennis van de mechanismen die celtherapie. Een dieper begrip van hoe therapeutische cellen hun gunstige invloed, alsmede mogelijke negatieve gevolgen van myocyten-nonmyocyte interacties uit te oefenen, zou de ontwikkeling van verbeterde therapieën waardoor klinisch significante en blijvende voordelen, met minimale bijwerkingen voor patiënten met hartfalen mogelijk te maken.

Hier beschrijven we het gebruik van gedefinieerde hECTs te interrogat mechanismen van cel-gebaseerde therapie. De gecontroleerde weefsel samenstelling is van essentieel belang om specifieke factoren die van invloed zijn cardiomyocyt prestaties te identificeren. Direct vullen hECTs de therapeutische celtype van belang (bijvoorbeeld MSC), kunnen de effecten op de cardiale myocyten prestaties onthullen, zoals we in ratten ECT 1 aangetoond.

De volgende meerdere stappen protocol begint met gerichte cardiale stamcel differentiatie, gevolgd door de vervaardiging van de multi-weefsel bioreactor, en afgesloten met een beschrijving van weefsel constructie en functionele analyse. Onze experimenten worden uitgevoerd met behulp van de NIH-goedgekeurde H7 menselijke embryonale stamcellen (hESC) lijn. Echter, de volgende protocollen ook getest met behulp van een extra hESC lijn en drie geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) lijnen met vergelijkbare resultaten. Wij hebben gevonden dat de efficiëntie bij cardiomyocyt differentiatie en succes in Hect fabricage afhankelijke cellijn kan zijn, met name for iPSC lijnen afgeleid van individuele patiënten. Door dit protocol worden twee 6 putjes bedekt met in totaal 1.680.000 hESCs (140.000 cellen per putje), die ongeveer 2,5 miljoen myocyten na differentiatie gedurende 20 dagen en sorteren, genoeg om zes gedefinieerde tissues oplevert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Voer alle cel manipulaties in aseptische omstandigheden met behulp van een HEPA-filter klasse II biologische veiligheid kabinet en alle oplossingen te steriliseren door ze te filtreren door een 0,2 pm filter. Voer weefsel bouw en functie van het testen in ofwel dezelfde aseptische omstandigheden of een laminaire stroming kap.

1. Het zaaien van H7 hESCs in voorbereiding voor Cardiac Differentiatie

  1. (Dag 1) De voorbereiding van het basaal membraan Matrix
    1. Dooi 150 pi hoeveelheid van hESC gekwalificeerde basaal membraan matrix op het ijs 's nachts bij 4 ° C.
  2. (Dag 0-4) Plating van hESCs op gecoate platen
    1. Verdunnen de ontdooide matrix in 12 ml ijskoude DMEM / F12 en meng goed.
    2. Breng 1 ml van DMEM / F12-matrix oplossing in elk putje van een 6-well weefselkweek behandeld schotel. Elk monster van matrix kan jas twee 6-well platen.
    3. Incubeer de beklede platen bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
      Opmerking: InOnze ervaring kan beklede schalen afgedicht met paraffine tot 10 dagen vóór gebruik worden opgeslagen in matrixvorm oplossing bij 4 ° C.
    4. Bij ongeveer 75% confluentie, dissociëren de H7 hESCs van 10 cm schaal met behulp 6 ml van de niet-enzymatische dissociatie reagens. Na 5 minuten zachtjes schrapen van de cellen van het kweekoppervlak met een wegwerp celschraper en breng de celsuspensie naar een steriele 15 ml centrifugebuis.
    5. Verwijderen 0,5 ml dissociatie oplossing met de cellen van de 15 ml buis overgebracht in een nieuwe steriele 15 ml buis (waarbij 5,5 ml van de dissociatie reagens om de hESCs verder dissociëren) voor stamcellijn propagatie.
    6. Pellet de 0,5 ml van cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 20 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer zachtjes in 8 ml pluripotente stamcellen medium dat 1% penicilline-streptomycine vervolgens naar een nieuwe, gecoat, 10 cm weefselkweekplaat en behouden 37 ° C en 5% CO 2 de stamcellijn handhaven.
      Opmerking: Bewaar pluripotente stamcellen media op ijs tijdens de media verandert.
    7. Ondertussen, voeg 5,5 pl 10 mM ROCK inhibitor Y-27.632 om de resterende 5,5 ml dissociatie oplossing blijven en incuberen bij kamertemperatuur gedurende nog eens 5-10 minuten. Meng de cellen met een 5 ml serologische pipet. Verder incuberen totdat een enkele celsuspensie wordt verkregen, dan pellet de cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    8. Resuspendeer de cellen in 5 ml pluripotente stamcellen media en voer een celtelling met een hemocytometer.
    9. Zaad elk putje van de 6-putjes bij een dichtheid van 140.000 cellen per putje. Zaad twee 6-well platen in totaal zes gedefinieerde weefsel creëren. Gooi de resterende cellen na plating.
    10. Vul de put met 1 ml met pluripotente stamcellen media en incuberen bij 37 ° C, 5% CO2. Vierentwintig uur later, verwijder de media en voeg 2 ml vers pluripotente stamcellen media aan elk putje (Figuur 1A ).
    11. Controleer de samenvloeiing van de platen elke dag begint de differentiatie zodra de cellen bereikt ongeveer 75% confluentie (Figuur 1B - D).

2. (Dag 4-24) Differentiatie van menselijke embryonale stamcellen te Cardiomyocytes 30,31

  1. (Dag 4-7, Differentiatie Dag 0-3) Mesoderm Inductie
    1. Bereid RPMI media differentiatie I (tabel 1) Door het combineren van 500 ml RPMI 1640 met 10 ml B27 supplement (zonder insuline) en 5 ml penicilline-streptomycine voorraadoplossing (10.000 IU / ml penicilline, 10.000 gg / ml streptomycine). Aliquot, op ijs, in 50 ml buizen en bewaar bij 4 ° C.
    2. (Dag 4, Differentiatie Dag 0) Bereid mesoderm inductie media door het toevoegen van 2,4 ul van de kleine molecule GSK3 remmer CHIR99021 (10 mM voorraad, 6 uM uiteindelijke concentratie) tot 12 ml van RPMI differentiatie media I. Verwijder pluripotente stamcellen media uit elk putje eennd te vervangen door 2 ml van het mesoderm inductie media per goed. Zet de plaat naar de incubator.
      Opmerking: significante celdood treedt meestal onder toevoeging van CHIR99021 (figuur 1E). De monolaag zal herstellen, maar het is belangrijk om de dode cellen te veranderen met de DMEM / F12 spoelen spoelen.
    3. (Dag 5, Differentiatie Dag 1) Bereid deze mesoderm inductie media zoals hierboven beschreven. Verwijder de oude media uit elk putje en een keer spoelen met 1 ml DMEM / F12 per putje. Voeg 2 ml verse mesoderm inductiemedia aan elk putje.
      Opmerking: Spoelen elke dag vanaf dag 0-10 verhoogt de opbrengst en zuiverheid van de cardiomyocyten.
    4. (Dag 6, Differentiatie Dag 2) Verwijder de cardiale inductie media en een keer spoelen met 1 ml DMEM / F12 per putje. Vervang het spoelen met 2 ml RPMI differentiatie medium I (geen kleine moleculen toegevoegd, maar ook met de B27 (zonder insuline) supplement) en terug naar de incubator.
  2. (Dag 7-13, Differentiatie Day 3-10) Cardiac Mesoderm Inductie
    1. (Dag 7, Differentiatie Dag 3) Bereid cardiale mesoderm inductie media door het toevoegen van 6 ul van de kleine molecule Wnt-remmer IWR-1 (10 mM voorraad, 5 pM final) tot 12 ml van RPMI differentiatie media I.
    2. Verwijder de media uit elk putje, een keer spoelen met 1 ml DMEM / F12 per putje en te vervangen door 2 ml van cardiale mesoderm inductie media per goed.
    3. (Dag 8, Differentiatie Dag 4) Bereid een additionele 12 ml cardiaal mesoderm inductie media zoals hierboven beschreven. Verwijder het medium toegevoegd de dag vóór, na spoelen met 1 ml DMEM / F12 per putje en vervangen door 2 ml vers cardiaal mesoderm differentiatie medium per putje en terug naar de incubator.
    4. (Dag 9-10, Differentiatie Dag 5-6) Op beide dagen, verwijder de cardiale mesoderm inductie media en spoel elk putje met 1 ml DMEM / F12.
    5. Voeg 2 ml vers RPMI differentiatie media I (geen kleine moleculen toegevoegd, maar nog steeds met de B27 (zonder insuline) supplement)aan elk putje en de plaat terug naar de incubator.
  3. (Dag 11-24, Differentiatie Dag 7-20) hES-afgeleide hartspiercel Organisatie / rijping
    1. Bereid de differentiatie RPMI medium II (tabel 1) Door het combineren van 500 ml RPMI 1640 met 10 ml B27 supplement (insuline) en 5 ml penicilline-streptomycine voorraadoplossing. Aliquot, op ijs, in 50 ml buizen en bewaar bij 4 ° C.
    2. (Dag 11, Differentiatie Dag 7) Verwijder RPMI differentiatie media (zonder insuline) uit elk putje en spoel af met 1 ml DMEM / F12. Vervangen door 2 ml van de nieuwe media RPMI differentiatie II (met insuline) aan elk putje en terug naar de incubator.
      Let op: Spontane afstraffing moet eerst worden waargenomen tussen dag 7 en 10. Indien kloppen niet gedurende deze tijd wordt waargenomen, betekent dit meestal een slechte differentiatie efficiency. Het protocol kan worden voortgezet tot en met dag 15 in een poging om pak slaag te observeren, maar als er geen afstraffing wordt waargenomen op dag 15 is het het beste om te stzijt een nieuwe differentiatie.
    3. (Dag 12-24, Differentiatie Dag 8-20) Elke dag, verwijder de oude differentiatie media en te vervangen door 2 ml vers RPMI differentiatie media II per putje naar cel rijping en de organisatie van het kloppende monolaag mogelijk te maken (figuur 1F, Video Figuur 1 ).
      Opmerking: Afhankelijk van de resterende celdood, kan het nodig zijn om te spoelen met 1 ml DMEM / F12 door differentiatie dag 10.

3. (Dag 24, Differentiatie Dag 20) Isolatie van hartspiercellen en fibroblast-achtige cellen

  1. Cellen losmaken van de monolaag
    1. Verwijderen differentiatie media en eenmaal spoelen met 1 ml PBS.
    2. Distantiëren de monolagen met 1 ml van de enzymatische dissociatie oplossing (0,04% Trypsine / 0,03% EDTA) aan elk putje.
    3. Verplaats plaat in incubator gedurende 10 minuten. Ondertussen, voeg 12 pl ROCK remmer 6 ml trypsine neutralisatieoplossing.
    4. Gently voeg 1 ml trypsine oplossing die de neutralisatie ROCK inhibitor aan elk putje van de plaat om de trypsine te neutraliseren oplossing.
    5. Met behulp van een steriele overdracht pipet, meng elk putje om uit elkaar te breken de cel clusters.
    6. Breng alle 12 ml van de 6-well plaat een 15 ml centrifugebuis.
      Let op: Omdat twee 6-well platen worden gebruikt in dit protocol, zal twee 15 ml buizen nodig zijn.
    7. Overdracht 3 ml PBS één putje van de plaat en vervolgens achtereenvolgens overbrengen dezelfde 3 ml elke volgende om eventuele resterende cellen te verzamelen op de schotel. Draagt ​​de resterende 3 ml van de uiteindelijke ver in dezelfde 15 ml centrifugebuis die de cellen.
    8. Pellet bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  2. Bereid Cellen voor live cell sorteren FACS
    1. Bereid de kleurbuffer door toevoeging van 5 ml foetaal runderserum met 45 ml PBS op ijs met 50 pi ROCK inhibitor.
    2. Verwijder het supernatant van de cel pellaat (in 3.1.8) en resuspendeer in 1,2 ml vlekken buffer.
    3. Transfer 200 pi van de celsuspensie in nieuw, voorgekoeld, 50 ml centrifugebuis op ijs. Dit zal de negatieve kleuring controle.
    4. Draagt ​​de resterende 1 ml celsuspensie in nieuw, voorgekoeld, 50 ml centrifugebuis op ijs en voeg 2 ul SIRPα-PE / Cy7 (1: 500 verdunning) en 4 ui van CD90-FITC (1: 250 verdunning) . Meng de celsuspensie met een transfer pipet en naar het ijs.
    5. Incubeer zowel de negatieve controle en monster op een rocker shaker, op ijs bij 4 ° C gedurende 1 uur.
    6. Bereid monstername buizen door het toevoegen van 3 ml RPMI media (met insuline) tot twee 15 ml centrifugebuizen. Voeg 3 ul van ROCK-remmer aan elke buis en op te slaan op het ijs.
    7. Pellet de gekleurde cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C en tweemaal spoelen met ten minste 10 ml ijskoude PBS per spoelen.
    8. Voeg 1 pl DAPI (1 ug / ml) tot 5 ml vlekken buffer. Voorzichtigresuspendeer de pellet monster met 1-3 ml van de DAPI kleuring bevattende buffer met een transferpipet.
    9. Voeg 500 pl vlekken buffer (zonder toegevoegde DAPI) met de negatieve controle.
    10. Voorzichtig filteren zowel de negatieve controle en monster door een 40 um cel zeef om massa's van cellen te verwijderen en over te dragen aan FACS buizen polystyreen op ijs. Onverwijld monsters naar de cel sorteerder.
    11. Net als bij gevestigde levende cellen sorteermethoden 18, gebruik maken van de negatieve controle aan de poorten instellen, selecteert voor levende cellen (DAPI negatief) en het verzamelen van zowel de FITC + (dat wil zeggen, CD90 + fibroblasten) en PE / Cy7 + (dwz SIRPα + hartspiercellen ) populaties onafhankelijk 20 psi (figuur 2).
      Let op: Na het instellen van de poorten, kan de negatieve controle in 4% PFA worden vastgesteld om differentiatie efficiency te bepalen door kleuring voor cardiaal troponine-T.
      Opmerking: Sommige onderzoekers de voorkeur aan een te gebruikenisotype controle plaats onbesmet controle om de poorten in ter compensatie van niet-specifieke antilichaambinding. Een zogenaamde fluorescentie min één (FMO) controle is een andere mogelijkheid. Vanwege de duidelijke bimodale verdeling van de FITC, DAPI en PE-Cy7 signalen, we afgesloten van de positieve populatie, conservatief gericht tot ver in de positieve poort, die mogelijk uitsluit aantal echte positieven, maar helpt om geen valse positieven te minimaliseren.
  3. Cell Reaggregation in voorbereiding voor Tissue Engineering
    1. Nadat de cel soort, zowel pellet verzamelbuizen en resuspendeer in 1 ml DMEM dat 10% Neonatale runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 0,2% amfotericine B ( "NBS media").
    2. Recombineren de SIRPα + en CD90 + cellen in een 3: 1 verhouding en de plaat de cellen gecombineerd in een niet-weefselkweek behandelde petrischaal bij een dichtheid van 2 miljoen cellen per 60 cm2 (10 cm schaal). Voeg 10 ml van de NBS media en 101; l van ROCK-remmer Y-27632.
    3. Plaats celsuspensie in de weefselkweek incubator gedurende 48 uur cellen reaggregation in kleine clusters toestaan.

4. Human Cardiac Tissue Engineering

  1. Fabriceren van de Multi-weefsel Bioreactor
    Opmerking: Om de afbeeldingen in figuur 3A aan te vullen, CAD-bestanden met gedetailleerde bioreactor ontwerp schema's zijn op verzoek van de auteurs beschikbaar.
    1. Machine de PDMS meester mal door het boren van zes gelijkmatig verdeelde gaten met een diameter van 0,5 mm in een 9 x 33 x 3,25 mm kubus van polytetrafluorethyleen.
    2. Met behulp van een frees, machine een frame uit polysulfon meet 25 x 35 x 11 mm 3. Het doel van het frame om de PDMS posten (geconstrueerd uit gegoten hierboven geformuleerde) uitgelijnd met de putten in de voetplaat te houden.
    3. Met behulp van een 1-mm endmill, machine 6 wells (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm uit elkaar in een 20 x 40 x 5 mm 3 stuk zwart polytetrafluorethyleen aan de basisplaat te vormen.
    4. Meng de elastomeer basis en verharder voor polydimethylsiloxaan (PDMS) in een 10: 1 w / w-verhouding en toe te voegen aan de aangepaste polytetrafluorethyleen mal (stap 4.1.1) twee rijen van zes force-sensing posten, en incubeer overnacht en onder vacuüm bij 80 ° C. Na het uitharden, voorzichtig de PDMS uit de meester mal en zorgvuldig markeren de toppen van elke post met een zwarte permanent marker voor een betere contrast en geautomatiseerde real-time functie afbuiging tracking.
      Opmerking: Polytetrafluorethyleen is vrij zacht en kunnen gemakkelijk worden beschadigd. Wees voorzichtig bij het reinigen van de meester mal voorafgaand aan het PDMS casting om de levensduur van het systeem en consistente PDMS na geometrie te garanderen. Een 0,5 mm draad kan worden gebruikt om de gaten voor de posten na gebruik te reinigen, maar zorg aan de binnenkant van de gaten niet schrapen.
      Opmerking: Een alternatief is ontgas de PDMS onder vacuüm gedurende enkele uren bij kamertemperatuur, laat het mengsel uitharding bij omgevingsdruk.Dit kan leiden tot minder restgas vorming van luchtbellen in het PDMS tijdens het uithardingsproces.
    5. Steriliseer alle componenten in een stoom autoclaaf.
      Opmerking: de PDMS meester mal (stap 4.1.1) en polysulfon frame (stap 4.1.2) zijn beide herbruikbaar. De PDMS posts gemaakt op basis van de cast (stap 4.1.4) is ook opnieuw te gebruiken, maar alleen voor ongeveer 10 toepassingen. Echter, meer PDMS berichten worden gemaakt als nodig is met behulp van de meester mal.
  2. Verzamel opnieuw geaggregeerde hartcellen
    1. Verwijder het opnieuw geaggregeerde cellen uit de incubator en de overdracht van alle 10 ml van de media reaggregation een 50 ml centrifugebuis.
    2. Spoel de plaat met 3 ml PBS en breng het sop dezelfde 50 ml centrifugebuis die de reaggregation media.
    3. 3 ml 0,04% trypsine / 0,03% EDTA om de 10 cm schaal en terug naar de incubator gedurende 5 min.
    4. Na 5 min, onderzoekt de plaat met een omgekeerde samengestelde microscoop bij 10x vergroting zorgen voor volledige cel dissociatietie van het gerecht. Als enkele resterende clusters nog steeds verbonden zijn, voorzichtig schudden van de plaat om de klonten los te maken. Wanneer de clusters gehecht blijven, terug naar de incubator gedurende nog 2-3 min. Niet broeden langer dan tien minuten of significante celdood kunnen optreden.
    5. Als alle cellen zijn vrijstaand, voeg 3 ml trypsine neutralisatie oplossing. Meng de neutralisatie oplossing met de trypsine-celoplossing en transfer naar de 50 ml centrifugebuis die de reaggregation media en eenmaal spoelen met PBS.
    6. Spoel de volledige schaal met 5 ml PBS en transfer naar dezelfde 50 ml buis met de cellen.
    7. Pellet de cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    8. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml NBS media, vervolgens over een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    9. Pellet bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd en de bovenstaande vloeistof. De cardiale cellen (CD90 + cellen en stromale SIRPα + myocYtes) zijn nu klaar voor de bouw weefsel.
  3. (Optioneel) Verzamel Aanvullende cellen van belang
    Opmerking: Naast de gedefinieerde weefsels met alleen SIRPα cardiomyocyten + en CD90 + fibroblast-achtige cellen, is het mogelijk om extra cellen van belang aan hun effect op weefselfunctie ondervragen. Bijvoorbeeld rat MSCs is aangetoond dat de functie van rat gemanipuleerde hartweefsels 1 verbeteren. De volgende optionele stap beschrijft de verzameling van extra cellen voor de gedefinieerde systeem.
    1. Verzamel de aanvullende celtype van belang (bijvoorbeeld, mesenchymale stamcellen) met behulp van 0,25% trypsine / 0,1% EDTA.
    2. Pellet de cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur vervolgens resuspenderen in 5 ml passende celkweekmedia het celtype. Bijvoorbeeld, voor MSCs gebruik DMEM aangevuld met 20% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 0,2% amfotericine B-cultuur de cells.
    3. Voer een celtelling met een hemocytometer, dan pellet de cellen opnieuw bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml celkweekmedium overgebracht in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    5. Pellet de cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Verwijder het supernatant. De aanvullende cellen zijn nu klaar voor de bouw weefsel.
      Opmerking: Als de aanvullende cellen toegevoegd in een concentratie van 10% van het totale aantal cellen in het weefsel, dan de bepaalde weefsels, zal 50.000 aanvullende cellen per weefsel nodig omdat elk weefsel bevat 500.000 hartcellen (zowel CD90 + stromacellen en SIRPα + myocyten).
  4. Maak de Human Engineered hartweefsel
    Let op: alle oplossingen op ijs en de cellen bij kamertemperatuur bewaren. Alle volumes hieronder zijn per weefsel. Meestal kan ongeveer zes weefselmonsters opgebouwd uit twee 6-well plAtes van cardiale differentiaties.
    1. Verdun 60,0 ui van de 5 mg / ml collageen bouillon aan 3,125 mg / ml met 1,5 gl 1 M NaOH, 9,6 ui 10X PBS en 24,9 pl steriel gedeïoniseerd ultrazuiver water.
      Kritische stap: vermijd de introductie van luchtbellen aan elke oplossing tijdens de bereiding als luchtbellen juiste vorming weefsel zal verstoren.
    2. Voeg 12,0 ul van zowel 10x MEM en 0,2 N HEPES pH 9 om de verdunde collageen mengsel aan het collageen mix maken. Naar beide oplossingen langs de zijkant van de 15 ml centrifugebuis om de introductie van luchtbellen in het collageen mix voorkomen.
    3. Voeg de basaalmembraan matrix tot een eindconcentratie van 0,9 mg / ml aan het collageen mix en bewaar op ijs tot het uiteindelijke weefsel mix maken. De eindconcentratie van collageen moet 2 mg / ml.
    4. Voeg 500.000 van opnieuw geaggregeerde cellen aan het weefsel mix (myocyten + fibroblast concentratie 20 miljoen / ml) en vul tot een eindvolume van 25 pl perweefsel met ofwel celvrije NBS media of 50.000 cellen van de aanvullende celtype van belang (bijvoorbeeld, hMSCs) en meng goed om een gelijkmatige celsuspensie te vormen.
      Opmerking: Het aantal aangevuld cellen zullen variëren van voor verschillende toepassingen. Hier 10% suppletie wordt gebruikt.
    5. Voorzichtig Pipetteer 25 ul van de celsuspensie in elk van de zes putjes in de bioreactor basisplaat, zonder dat er luchtbellen in de put.
    6. Duwen twee rijen van de PDMS krachtsensoren aan beide zijdelen van het polysulfon frame vormen 6 paren van tegengestelde posten, keer dan het frame bovenop de basisplaat, zodat een paar posten komt elk putje met de celsuspensie.
      Opmerking: De polysulfon kader bevat tabbladen om te helpen bij de aanpassing van het PDMS.
    7. Plaats voorzichtig de bioreactor, grondplaat naar beneden, in een 60 mm schaal en zet de schaal zonder deksel binnenkant van een 10 cm schotel, leg het deksel van 10 cm op de top, en verplaats het hele bioreactor vergadering inde weefselkweek incubator, wachtend twee uur het weefsel gel.
    8. Na 2 uur werd de bioreactor te verwijderen uit de incubator en voeg 14 ml NBS media om het gehele samenstel, genoeg om de grondplaat te dekken. Terug naar de incubator en wijzigt de helft van de media dagelijks.
    9. Achtenveertig uur later, verwijder voorzichtig de basisplaat door voorzichtig te bewegen elke kant van de bodemplaat van het frame een paar millimeter in een tijd, veranderen de media, dan is de terugkeer van de bioreactor, weefsels naar beneden, naar de media.
    10. Ga door het veranderen van de helft van de NBS cultuur media elke dag.
      Opmerking: Spontane contracties van het weefsel kan reeds na 3 dagen na weefsel constructie genereren meetbare kramp krachten al op dag 5-7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiale myocyten te verkrijgen, is een licht gewijzigde versie van de Boheler en Lian differentiatiemethoden gebruikt 30,31. Het is noodzakelijk dat de differentiatie begint tijdens de log-fase van celgroei, maar ook dat de uitgangspopulatie voldoende confluent een bruikbare aantal cellen na sortering (ongeveer 75% is optimaal). Kenmerkend voor H7 hESCs, scheepswand in een dichtheid van 140.000 hESCs per putje van een 6-putjes essentiële 8 media en 5% CO2 incubator bij 37 ° C levert voldoende conf...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bouw van gedefinieerde menselijke gemanipuleerde cardiale weefsels (hect) kan een meer consistente en betrouwbare model van menselijke hartspiercel functie te geven. Kritisch, alle cellulaire en extracellulaire componenten in het systeem bekend en kunnen als gewenst, waardoor de verstorende invloed van andere onbekende celtypen gevolg van het differentiatieproces verwijderd worden gemanipuleerd. Snelle celgroei en hoge opbrengst evenwicht heeft het de voorkeur dat de differentiatie begint bij 75% samenvloeiing van de...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH (1F30HL118923-01A1) aan TJC, NIH / NHLBI PEN contract HHSN268201000045C aan KDC, de onderzoeksbeurs Raad van Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) naar BDG, de Amerikaanse Heart Association (12PRE12060254) naar RJ en Research Grant Raad van HKSAR (TBR's, T13-706 / 11) Aanvullende financiering RL werd door de NIH DRB 5T32GM008553-18 en als een stage op NIDCR-Interdisciplinair Training in systemen en Ontwikkelingspsychologie aan TJC voorzien biologie en geboorteafwijkingen T32HD075735. De auteurs willen ook dankbaar erkennen Arthur Autz op de Zahn Centrum van het City College of New York voor hulp bij het bewerken van de bioreactor en Mamdouh Eldaly voor technische ondersteuning. We danken ook Dr. Kenneth Boheler voor advies over cardiale differentiatie en Dr. Joshua Hare voor royaal verstrekken van menselijke mesenchymale stamcellen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CelcultuurBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amphotericin BSigma-AldrichA2411Maak een voorraad van 2,5 mg/ml in DMSO en filter-steriliseer
B27 met insulineLife Technologies17505055
B27 zonder insulineLife TechnologiesA1895601
CHIR99021Stemgent04-0004Maak een 6 μM voorraad, verdeel vervolgens in aliquots en bewaar bij -20 °C.
Essential 8 MediaLife TechnologiesA1517001
H7 Human Embryonic Stem CellsWiCellWA07
hESC Qualified Matrix, Corning MatrigelCorning354277Ontdooi op ijs bij 4 °C een nacht en verdeel vervolgens 150 μl in afzonderlijke buisjes en bewaar bij -20 °C.
IWR-1Sigma-AldrichI0161Maak een voorraad van 10 mM en verdeel in aliquots. Bewaar bij -20 °C
Neonatal Calf SerumLife Technologies16010159
Niet-enzymatische dissociatiereagent: Gentle Cell Dissociatie ReagentStem Cell Technologies7174
Penicilline-StreptomycineCorning30-002-CI
RPMI 1640Life Technologies11875-093Koel bewaren
Y-27632 (ROCK-remmer)Stemgent04-0012Resuspendeer tot een voorraadconcentratie van 10 mM, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C. Vermijd bevriezing en ontdooi cycli.
CelsorteringBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)Life TechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
Enzymatische dissociatiereagent: Cell Detach Kit I (0,04% Trypsine/ 0,03% EDTA, Trypsine neutralisatieoplossing en Hanks Buffered Salt Solution) PromoCellC-41200
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicsS11250
SIRPα-PE/Cy7BioLegend323807
WeefselconstructieBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,25% Trypsine/0,1% EDTAFisher Scientific25-053-CIOptioneel: Voor het verzamelen van aanvullende cellen van belang
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x PBS-pakkettenSigma-AldrichP3813
Collageen, Bovine Type ILife TechnologiesA10644-01Bewaar op ijs
DMEM/F12Life Technologies11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), Hoge GlucoseSigma-AldrichD5648
Polydimethylsiloxaan (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Sodium HEPESSigma-AldrichH3784
NatriumhydroxideSigma-Aldrich221465
MaterialenBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,5 ml microcentrifugebuisjesFisher ScientificNC0536757
15 ml polypropyleen centrifugebuisCorning352096
5 ml Polystyreen Ronde BodembuisCorning352235Met geïntegreerde 35 μm celstrainer
50 ml polypropyleen centrifugebuisCorning352070
6-well platte bodem weefselcultuur plaatCorning353046
Celschraper, WegwerpbaarBiologix70-2180
PolysulfonMcMaster-Carr
Polytetrafluorethyleen (Teflon)McMaster-Carr
ApparatuurBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DissectiemicroscoopOlympusSZ-61Of soortgelijk, moet een montage hebben voor de hoge snelheidscamera om te bevestigen
Elektrisch pacing systeemAstro-Med, IncGrass S88X Stimulator
Hoge snelheidscameraPixelinkPL-B741UOf soortgelijk, maar moet in staat zijn om 100 frames per seconde voor nauwkeurige dataverwerving
Temperatuurcontrole van de plaatWordt gebruikt om de temperatuur van het medium te behouden tijdens dataverwerving.
Aangepaste materialenBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LabView Post-tracking programmaBeschikbaar op aanvraag van de auteurs

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397(2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147(2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010(2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293(2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742(2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Engineered Cardiac TissueLive Cell SortingSIRP Alpha MarkerCD90 Fibroblast MarkerCollagen Based MatrixBioreactor SystemMesenchymal Stem CellsContractile Force MeasurementTissue CompactionFACS Collection

Related Articles