Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal in vitro model te construeren van de bekleding van de peritoneale holte, samengesteld uit primaire humane mesotheliële cellen en fibroblasten, bedekt met extracellulaire matrix, als een hulpmiddel om de adhesie, invasie en proliferatie van ovariële kankercellen te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Modelleren van de eerste stappen van eierstokkanker Verspreiding in een Organotypische Cultuur van de menselijke buikholte
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het patroon van ovariumkankermetastase is duidelijk anders dan dat van de meeste andere epitheeltumoren, omdat het zelden hematogeen verspreidt. In plaats daarvan worden ovariumkankercellen die van de primaire tumor zijn afgescheiden, door peritoneale vloeistof naar uitzaaiplaatsen binnen de buikholte vervoerd. Deze plaatsen, met name het buikvlies en het mesentery, zijn organen bedekt met een met mesotheel bekleed oppervlak. Om de processen van ovariumkankerdisseminatie te onderzoeken, hebben we een complex driedimensionaal kweeksysteem samengesteld dat de bekleding van de buikholte in vitro reconstrueert. Primaire menselijke fibroblasten en mesotheelcellen werden geïsoleerd uit menselijk mesentery. De fibroblasten werden vervolgens gemengd met extracellulaire matrix en bedekt met een laag primaire menselijke mesotheelcellen om de peritoneale en omentale oppervlakken na te bootsen waarmee uitzaaiende ovariumkankercellen in contact komen. Het resulterende organotypische model wordt, zoals getoond, gebruikt om de vroege stadia van ovariumkankerdisseminatie te onderzoeken, inclusief kankercelhechting, invasie en proliferatie. Dit model is in een aantal studies gebruikt om de rol van de micro-omgeving (cellulair en acellulair) in de vroege ovariumkankerdisseminatie te onderzoeken. Het is ook met succes aangepast aan hoogdoorvoerscreening en gebruikt om remmers van ovariumkankermetastase te identificeren en te testen.
Inleiding
Eierstokkanker is de dodelijkste gynaecologische maligniteit1. De meeste patiënten worden gediagnosticeerd nadat de kanker zich heeft verspreid door de buikholte. Zodra de kanker zich heeft verspreid door de buikholte, zijn cytoreductieve chirurgie en chemotherapie vaak niet voldoende om kankerrecidief en chemoresistentie te voorkomen, wat resulteert in een overlevingspercentage van minder dan 30% na 5 jaar. Eierstokkankermetastase is voornamelijk beperkt tot de buikholte, en verschillende andere kankersoorten, waaronder maag-, alvleesklier- en darmkanker, metastaseren naar dezelfde anatomische locaties in de buikholte. Over het algemeen loslaten eierstokka....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle onderzoeksprotocollen beschreven zijn beoordeeld door de Universiteit van Chicago Institutional Review Board (IRB). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt voor de operatie en de studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Chicago IRB. Een biologisch veiligheidskabinet type 2 en handschoenen moeten worden gebruikt bij de behandeling van menselijk weefsel voor bescherming en om het risico van besmetting van cellen te verminderen.
1. Isolatie en Cultuur van primaire Ongetransformeerde stromale cellen
- Lichaamsmateriaal verzamelen en voorbereiding.
- Verkrijgen van specimens van menselijk omentum,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het organotypische kweek werd geassembleerd door eerst primaire menselijke fibroblasten met collageen type I en bedekken deze cultuur met 5 maal het aantal mesotheelcellen. De kweek werd gedurende ten minste 18 uur voor eierstokkanker cellen werden toegevoegd aan adhesie, invasie of verspreiding te bestuderen. Iedere test werd herhaald met meerdere (n = 3-5) 3D cultures verkregen uit verschillende patiënten en verschillende putjes werden getest in elke conditie voor de adhesie (n = 5), proliferatie (n = 5) en invasie as.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een organotypische model van peritoneale micro opgericht om de individuele en collectieve functie (s) van zowel de cellulaire en aangeboren bestanddelen van de micro-omgeving bij eierstokkanker verspreiding van kanker te beoordelen. De specifieke protocollen voor plateren en het aanpassen van de 3D organotypische kweek eierstokkanker celhechting, proliferatie, invasie en onderzoeken zijn aanwezig. Omental primaire humane mesotheelcellen en fibroblasten werden geïsoleerd uit patiënten die in een vroeg doorgang naar norma.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken alle bewoners en behandelende artsen, met name Dr. A.F. Haney (de Universiteit van Chicago, Afdeling Obstetrie en Gynaecologie) voor het verzamelen van omentale biopten. Ook danken we Stacey Tobin en Gail Isenberg voor het zorgvuldig redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door Bears Care, de liefdadigheidsbegunstigde van de Chicago Bears Football Club, het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702, en de National Cancer Institute-subsidie R01 CA111882 aan E.L.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1. Isolatie en kweek van primaire cellen | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Eenzijdige scheermessen | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm kweekschotels | BD Biosciences | 353025 | |
| Glaskolf | ? | ? | |
| Fetaal bovien serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM met L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitaminen | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Niet-essentiële aminozuren | Corning | 25-025-CI | |
| Penicilline-Streptomycine | Corning | 30-002-CI | |
| Schudder | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsine EDTA, 1x (0,25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Kolven | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Kolven | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 en P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Gefilterde tips P2, P10, P20, P200 en P1000 | |
| Naam van reagens/materiaal | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen/Beschrijving |
| 2. Aanleggen van 3D-kweek | |||
| Celteller | Invitrogen | Countess | |
| Countess Celtelling Kamer Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blauw Kleuring (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collageen Type I (Rattenstaart) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96-puts plaat, heldere bodem, zwart | BD Biosciences | 353219 | |
| Naam van reagens/materiaal | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen/Beschrijving |
| 3. Adhesie test | |||
| Multikanaals pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde oplossing 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Naam van reagens/materiaal | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen/Beschrijving |
| 5. Invasie test | |||
| Cel Cultuur Inserts (8um, 24-puts) | BD Biosciences | 353097 | |
| Katoenen watten | Q-tips | katoenen watten | |
| Microscoop | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24-puts plaat | BD Biosciences | 353047 | |
| Naam van reagens/materiaal | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen/Beschrijving |
| 6. Antilichamen | |||
| Anti-Integrine αVβ3 Antilichaam, klon LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
Referenties
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
