Methodenartikel

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

DOI:

10.3791/53568

⸱

28 december 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kunst van het produceren van recombinante eiwitten met complexe post-translationele modificaties is een grote uitdaging voor studies van de structuur en functie. De snelle vaststelling en hoge herstel van transiënt getransfecteerde zoogdiercellijnen richt deze barrière en is een effectieve manier tot expressie eiwitten die van nature via de ER en Golgi-gemedieerde secretorische pathway. Hier is een protocol voor het eiwit expressie met behulp van het menselijk HEK293F en HEK293S cellijnen getransfecteerd met een zoogdierexpressievector ontworpen voor hoge eiwit opbrengsten. De toepasbaarheid van dit systeem wordt aangetoond met behulp van drie representatieve glycoproteïnen die uitgedrukt met opbrengsten tussen 95-120 mg van het gezuiverde eiwit teruggevonden per liter cultuur. Deze eiwitten zijn de menselijke FcγRIIIa en rat α2-6 sialyltransferase, ST6GalI, beide uitgedrukt met een N-eindstandige GFP fusie, alsook ongemodificeerd menselijk immunoglobuline G1 Fc. Deze robuuste systeem utilizes een serumvrij medium dat is aangepast voor expressie van isotopisch verrijkte eiwitten en koolhydraten structurele studies met massaspectrometrie en kernmagnetische resonantiespectroscopie. Verder kan de samenstelling van de N-glycan worden afgesteld door toevoeging van een kleine molecule bepaalde glycaan wijzigingen voorkomen op een wijze die de opbrengst vermindert.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het produceren van hoge opbrengsten van de juiste gevouwen en post-translationeel gemodificeerde menselijke eiwitten voor een gedetailleerde analyse van de structuur en functie blijft een belangrijke uitdaging. Een groot aantal expressiesystemen beschikbaar die recombinante eiwitten met natief-achtige en gedrag produceren. Bacteriële expressiesystemen, voornamelijk Escherichia coli-stammen, zijn de meest toegankelijke en gebruikte gereedschappen in de onderzoeksarena, vanwege de eenvoud van deze expressiesystemen, ofschoon gist, plant, insect en zoogdier systemen zijn ook beschreven 04/01. Het merendeel van deze systemen zijn niet in staat geschikte posttranslationele modificatie van de doeleiwitten. Een fundamenteel belang van de Barb en Moremen laboratoria is het produceren van eukaryote eiwitten met de juiste glycosylering. Veel menselijke eiwitten nodig passende glycosylering voor de juiste functie (zie 5).

De eukaryotischeglycosyleringsmachinerie is uitgebreid en in staat om een uiteenlopende modificaties, zowel asparagine (N) - en serine / threonine (O) complex-gebonden glycanen 6. Geschat wordt dat> 50% van humane eiwitten N-geglycosyleerd 7. Glycanen essentiële componenten van verschillende proteïnen, waaronder therapeutische monoklonale antilichamen, erytropoëtine en bloedstollingsfactoren zoals factor IX, om een ​​paar te noemen. Hoewel meerdere methoden bestaan ​​om de juiste N-geglycosyleerde eiwitten te bereiden en variëren van puur synthetische 8-10, om chemoenzymatic 11-14 of herstel van ontworpen recombinante systemen 15-20, niet verrassend, menselijke expressie systemen hebben tot nu toe bewezen de meest robuust werkwijzen voor het genereren van humane eiwitten.

Veel therapeutische humane glycoproteïnen worden geproduceerd in recombinante systemen die gebruik zoogdiercellen. Systemen van de nota zijn de Chinese hamster ovarium (CHO), muis myeloom (NS0), baby hamster kidney (BHK), humane embryonale nier (HEK-293) en menselijke netvlies cellijnen die werkzaam zijn in de hechting of opschorting cultuur eiwitproductie 4,21,22. Echter, zoogdieren eiwitexpressiesystemen het genereren van stabiele cellijnen, dure kweekmedia en substraat geassisteerde transfectie procedures 23 vereist.

Zoogdiercel transfectie wordt bereikt met behulp van talrijke middelen zoals calciumfosfaten 24,25, kationische polymeren (DEAE-dextran, polybreen, polylysine, polyethylimine (PEI)) of positief geladen kationische liposomen 26-29. PEI is een polykationisch, geladen, lineair of vertakt polymeer (25 kDa) 26 dat een stabiel complex vormt met DNA en endocytose. Na aanzuren van het endosoom wordt PEI gedacht te zwellen, waardoor de scheuring van endosomen en afgifte van het DNA in het cytoplasma 26,30.

Tot voor kort, voorbijgaande transfectie in suspensiop kweek werd uitgevoerd door voorafgaande DNA / PEI complexvorming, gevolgd door toevoeging aan de 29 celkweek. Echter, Würm en medewerkers rapporteerden een zeer efficiënt protocol geoptimaliseerd voor recombinante eiwitproductie in HEK293 cellen die een DNA / PEI complex in situ 31,32 gevormd. Deze vermeden voorbereiding, sterilisatie van het complex, en de buffer te wisselen in een kweekmedium. Verdere optimalisatie door het opnemen van expressie verbeteren van plasmiden heeft geleid tot een aanzienlijke toename van de opbrengst 33. Hierin is een methode die voortbouwt op deze vooruitgang en is breed toepasbaar. Expressie mogen ook worden gewijzigd volgens de N-glycan samenstelling beïnvloeden.

De HEK293S cellijn met een gen deletie die N-glycan verwerking in een tussenstadium stopt, leidt tot de expressie van eiwitten met uniforme N-glycanen bestaande uit 2 N-acetylglucosamineresten plus vijf mannose residuen (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Deze cellenmissen het N-acetylglucosaminyl transferase I (GNTI) gen dat vereist is voor stroomafwaartse N-glycan verwerkende 36,37. Het gebruik van glycosyltransferase-remmers waaronder kifunensine, siaalzuur analogen en fucose analoge en 2-deoxy-2-fluor-fucose gelijksoortige gevolgen en beperkingen N-glycan verwerkende 38-41.

Het protocol hier gerapporteerde gebruikt pGEn2 vector zoals getoond in figuur 1 42,43, PEI bijgestaan ​​transiënte transfectie in zoogdiercellen leidingen (HEK293F HEK293S of cellen) en de terugwinning van hoge opbrengsten op passende geglycosyleerd eiwit. Dit systeem is robuust en is geschikt voor diverse factoren, waaronder isotopen en glycan techniek voor de productie van grote titers van recombinante eiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is voldoende voor expressie met behulp van HEK293F of HEK293S cellen.

1. Cell Oprichting

  1. Cultuur Inenting
    Opmerking: Alle cultuur manipulatie procedures moeten worden uitgevoerd in een BSL-2-faciliteit en elk item bracht in de bioveiligheid kast moeten worden gesteriliseerd door te besproeien met een ethanol 70% in water oplossing.
    1. Bedien de incubator schudder bij 135 rpm, 80% vochtigheid en 8,0% CO2 en 37 ° C. "Aan" de UV lamp van de bioveiligheid kast tenminste 1 uur voor werken. Voorverwarmen de afgedichte Medium Medium A en B flessen in het waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    2. Steriliseren 125 ml Erlenmeyer groei kolven met een geventileerde dop, pipetten, pipetten en voorverwarmde media flessen door te besproeien met de 70% ethanol in wateroplossing. Plaats deze items in de bioveiligheid kast. Let op: Steriliseer alleen de buitenste plastic voor de 125 ml Erlenmeyer kolf, en slechts te verwijderen toen het is in de bioveiligheid kast.
    3. Voor een cultuur 30 ml, in te trekken 26 ml Medium A en 3 ml medium B (10% van de uiteindelijke cultuur) en breng in de 125 ml Erlenmeyer kolf en meng door schudden (hierna aangeduid als vers kweekmedium).
    4. Overdracht één flacon cellen met HEK293F cellen, bij -80 ° C bevroren, op ijs en te verplaatsen naar de cultuur kamer. Opmerking: HEK293F cellen worden toegevoerd bij een dichtheid van 1 x 10 7 cellen / ml.
    5. Verwarm de flacon voorzichtig in waterbad bij 37 ° C gedeeltelijk ontdooien van de cellen (ca. een minuut en cellen niet volledig ontdooid). Steriliseer de buitenkant van het flesje met 70% ethanol in wateroplossing en zet deze in de bioveiligheid kast.
    6. Met behulp van 1 ml pipet, trekt de cel suspensie (ongeveer 0,7 ml) en breng in de 125 ml erlenmeyer met 29 ml vers kweekmedium. Sluit het deksel van de cultuur kolf en verplaatsen in de bebroede shaker.
  2. Cell Onderhoud: Check cel dichtheid, levensvatbaarheid en cel Passages
    1. Controleer de cellen dichtheid na 24 uren van ontdooien van de cultuur door de onderstaande protocol. Opmerking: Cellen worden gekweekt gedurende 24 uur na ontdooien groei essentiële cellen en levensvatbaarheid van> 80% te verzekeren.
    2. Steriliseren de kolf met 70% ethanol in water oplossing en zet het in de bioveiligheid kast.
    3. Met behulp van een pipet en pipet 1 ml, langzaam terug te trekken 100 ul schorsing cultuur en de overdracht in een steriele 0,5 ml Eppendorf buis. Sluit en breng de kolf terug in de shaker zo spoedig mogelijk.
    4. Meng 7,5 pi van een trypan blauwe oplossing met 7,5 pi cellen. Meng krachtig met 7,5 ul van de cellen / trypan blauw mengsel en overbrengen naar het tellen dia.
    5. Schakel de automatische celgetalmeter en plaats het tellen dia in de laadruimte. De automatische lezer wordt geactiveerd en cellen automatisch geteld in eenhedenvan het aantal cellen per ml en percentage levensvatbaarheid
    6. Bepaal het volume van de donor cultuur vereist voor de overdracht naar een vers kweekmedium aan de cellen dichtheid van 0,3 x 10 6 levende cellen / ml.
      Opmerking: Zie een rekenvoorbeeld in aanvullende materialen.
    7. Herhaal stap 1.1.2 en 1.1.3 van de "1.1 Cultuur Enten" protocol hierboven om materialen die nodig zijn voor vers kweekmedium te bereiden.
    8. Overdrachtsmedium A (23 ml) en Medium B (3 ml) om een ​​frisse 125 ml kolf. Verwijder de voorraad flessen Medium Medium A en B van de bioveiligheid kast.
      Opmerking: voorraden media flessen niet in de bioveiligheid kast bewaard tegelijkertijd de HEK 293F cellen. Dit beperkt de mogelijkheid van besmetting van de voorraad medium flessen.
    9. Verwijder de HEK293 celkweek uit de incubator en spuit met 70% ethanol in wateroplossing. Met behulp van een nieuwe pipet, trek de hoeveelheid van de cellen (4 ml, werd dit volume bepaald op basis to stap 1.2.6) van de cultuur en overbrengen naar de kolf met vers kweekmedium.
    10. Transfer zowel de culturen van de bioveiligheid kast om de incubator shaker ingesteld op basis van 1.1.1. Kweek cellen om een benaderende densiteit van 2-3 x 10 6 levende cellen / ml.
      Opmerking: De geschatte verdubbeling tijd van de cellen is 32 uur. Het zal 3-4 dagen duren om deze dichtheid te bereiken. Incubeer de cellen gedurende 3-4 passages stabiele groei patroon van cellen voorafgaand aan de eerste transfectie hebben.

2. Bereid Materialen voor transfectie

  1. Voorbereiden van HEK293 cellen (dag 1)
    1. Subcultuur cellen tot een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in vers medium B 24 uur voor transfectie volgens stap 1,2.
      Opmerking: het volume van de transfectie cultuur afhankelijk van het aantal cellen. Transfectie grotere volumes (> 20 ml) een groter volume van cultuur in dit stadium vereist.
  2. Voorbereiden van Stocks van Materialen
    1. Bereid voorraadoplossing van lineaire Polyethyleenimine (PEI) bij een concentratie van 1 mg / ml in een buffer die 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) en 150 mM NaCl (pH 7,5). PEI volledig op te lossen; kan 30-60 minuten duren bij kamertemperatuur. Steriliseren door 0,22 pM spuitfilter en bewaar bij -20 ° C gedurende langdurig gebruik.
    2. Bereid steriele plasmide DNA (volgens stap 2.2.2.1-2.2.2.4). De plasmideconstructie procedure wordt elders 42 beschreven. Een korte procedure voor DNA-bereiding wordt hier uitgelegd:
      1. Kweek een cultuur van chemisch competente Escherichia coli getransformeerd met de vector pGEn2 in 1 liter LB medium (Tryptone- 10 g / L, gist afzuig- 5 g / l natrium- chloride- en 10 g / l) aangevuld met 100 ug / ml ampicilline. E. coli wordt gekweekt bij 37 ° C in een niet-bevochtigde incubator schudden.
      2. Zuiver het pGEn2 codeert doelwit plasmide DNA volgens de Manubrikant DNA zuivering protocol.
      3. Om volledige steriliteit van het plasmide DNA te verzekeren, voert de laatste isopropanol neerslag en resuspensie stappen van de DNA-extractie in de bioveiligheid kast.
      4. Voeg het volume isopropanol (gespecificeerd in het plasmide preparaat kit) aan de geëlueerde DNA en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 min. Steriliseer de buitenkant van het DNA houder met 70% ethanol in wateroplossing en breng deze in de bioveiligheid kast. Gooi de isopropanol supernatant met een pipet en air-droog de DNA pellet. Eenmaal droog, resuspendeer de pellet in steriele 10 mM Tris buffer, pH 8,0.
    3. Bereid voorraad oplossing van 220 mm valproic (VPA) zuur in water en steriliseer door passage door een steriel 0,22 pm filter. Bewaar de oplossing bij -20 ° C tot verder gebruik.

3. Vaststelling van een tijdelijke transfectie

  1. Transfectie (Dag 0)
    1. Controleer de celdichtheid door de stappen 1.2.2 tot 1.2.5 van de "1.2. Cell Onderhoud" hierboven. Bepaal het aantal cellen voor de transfectie (2,5-3,0 x 10 6 levende cellen / ml de levensvatbaarheid> 95%). Zie een rekenvoorbeeld in aanvullende materialen.
    2. Breng het volume suspensiekweek cellen berekend in de vorige stap (hier 67 ml) in een 250 ml centrifugebuis met een steriele serologische pipet. Verzamel cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 100 x g.
    3. In de tussentijd bereiden een frisse transfectie kweekmedium volgende stap 1.1.3 volgens "1.1. Cultuur Inenting" hierboven. Zie de aanvullende materialen voor een rekenvoorbeeld. Ook de overdracht 5 ml vers kweekmedium in een steriele 15 ml buis en zet apart.
    4. Transfer buisjes die de celpellets in de bioveiligheid kast na het steriliseren de buitenkant van de buizen met 70% ethanol in wateroplossing en een steriele pipet th decanterene bovenstaande bestaande uit kweekmedium besteed.
    5. Krachtig resuspendeer de gepelleteerde cellen door en neer te pipetteren met behulp van 10 ml vers kweekmedium en overdracht naar de kolf transfectie vers kweekmedium (bereid in stap 3.1.3 hierboven). Schroef de dop op de geventileerde celkweek kolf en zet de kolf met de incubator (zoals vastgesteld in 1.1.1) gedurende 15 min-1 uur met schudden.
    6. Gedurende deze tijd, verdun het plasmide-DNA en PEI voorraden met verse kweekmedium (met het volume 5 ml uit stap 3.1.3 hierboven ingetrokken) tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ul. Zie rekenvoorbeelden in aanvullende materialen om de hoeveelheid DNA te bepalen en PEI. Breng de kolf met de verspreide cellen in de bioveiligheid kast.
    7. Voeg plasmide DNA (300 ui 0,5 ug / ul) aan de kweek met behulp van micro-pipet en meng door voorzichtig handmatig schudden. Voeg PEI (900 ul van 0,5 ug / ul) om de cultuur, meng door zachtjes te schudden. Voeg 3,8 ml vers culture medium, uit stap 3.1.3, hierboven en overdracht kolf naar de incubator shaker gedurende 24 uur.
    8. Reinig de bioveiligheid kast volgens de Stap 1.1.
  2. Verdunning (Dag 1) (Voor een 50 ml transfectie volume)
    1. Incubeer de getransfecteerde cultuur gedurende 24 uur.
    2. Zuig 1 ml voorverwarmd 220 mM valproïnezuur (VPA, bereid volgens stap 2.2.3.) Met een steriele 1 ml serologische pipet en overgebracht naar een steriele 50 ml buizen.
    3. Zuig 5,0 ml voorverwarmd Medium B en 44 ml voorverwarmd Medium A en voeg dit aan de VPO oplossing met een steriele serologische pipet 50 ml vers kweekmedium te bereiden met een uiteindelijke concentratie van 4,4 mM VPA.
    4. Verplaats de kweek getransfecteerd in de bioveiligheid kast na het steriliseren van het uitwendige van de kolf met 70% ethanol in wateroplossing, voeg de voorbereide verdunningsmiddel en breng de kolf naar de schudinrichting geïncubeerd.
  3. Expressie en Harvest (2-6 dagen)
    1. Incubeer de cellen gedurende nog 4-5 dagen (5-6 dagen sinds transfectie).
    2. Trekken hoeveelheden kweekmedium volgende stap 1.2.2. naar 1.2.5. beschreven in "1,2. Cell onderhoud" boven met een steriele 1 ml serologische pipet tot cellulaire levensvatbaarheid bewaken en opslaan aliquots eiwitexpressie te analyseren dagelijks door SDS-PAGE (zie hoofdstuk 5, hieronder).
    3. Oogst cellen na 5-6 dagen door centrifugeren van de cellen plus medium bij 1000 g gedurende 5 min. Bovendien, de oogst van het bovenstaande als de levensvatbaarheid van de cellen daalt tot onder 50% (zie stappen 1.2.2-1.2.5).
    4. Giet de bovenstaande vloeistof die uitgescheiden eiwitten bevatten. Voeg 5 ml van een 10% bleekwater naar de HEK celpellet en gooi als biologisch.

4. Protein Purification

  1. Bereid een kolom met 5 ml Proteïne A-Sepharose. Equilibreren van de kolom met 5 kolomvolumes buffer A (20 mM 3- (N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCll).
  2. Centrifugeer de verzamelde supernatant met expressie gebracht eiwit op hoge snelheid (14.000 g gedurende 10 min) om alle resterende celresten te verwijderen. Verzamelen door decanteren in een nieuwe buis. Gooi de pellet als biologisch.
  3. Verzamel een 10 pl aliquot van het supernatans en bovendien laat een klein monster van elk eiwit zuiveringsstap om het monster met SDS-PAGE analyse (beschreven in paragraaf 5). Laad de geklaarde supernatant en het verzamelen van de stroom door.
  4. Was de kolom met 3 kolomvolumes buffer A en elueer het eiwit met 5 kolomvolumes van 100 mM glycine, pH 3,0. Verzamel het eluaat in buizen met een half volume van 1 M Tris buffer, pH 8,0 snel neutraliseren van de pH.
  5. Was de kolom met 10 kolomvolumes buffer A en op te slaan voor toekomstig gebruik.
  6. Bufferuitwisseling het geëlueerde eiwit met ten minste een 10-voudige overmaat aan buffer A via 10 kDa moleculair gewicht cut-off centrifugale filters. Opmerking: de geëlueerde monster niet concentrereneen zeer klein volume (<2 ml) in de buffer geëlueerd. Gebruik de centrifugale filters om de buffer te wisselen met buffer A.
  7. WINKEL gezuiverde eiwit bij 4 ° C tot het volgende gebruik.
    Opmerking: Eiwit expressie in de supernatant worden gezuiverd door affiniteit kolommen geselecteerd op basis van eigenschappen van eiwit of het gebruik van affiniteitstags. Voor een typische zuiveringsprocedure, Proteïne A-kolom kan worden gebruikt voor IgG of Fc-fragmenten of nikkel kolom kan worden gebruikt om eiwitten tot expressie gebracht met een poly-histidine tag. Hier is een beschrijving van de zuiveringsstappen voor IgG1-Fc gebruikmaking van een Proteïne A kolom.

5. Analyse van eiwit door SDS-PAGE

  1. Verdun de monsters (7,5 pl) van elk monster met een gelijk volume van 2x loading buffer (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-mercaptoethanol, 20% glycerol en 0,01% broomfenolblauw).
  2. Kook het mengsel bij 90 ° C gedurende 5 min met een verwarmingsblok of waterbad. Centrifugeer de monsters bij 10.000 g for 1 min. Laad de bereide gel met 5 ul van marker eiwit en 14 ul van monsters voor analyses met behulp van een 20 ul pipet met een wegwerp tip.
  3. Run een gel bij 25 mA gedurende 60 min. Zodra de elektroforesestap is voltooid, breng de gel aan een houder met 1 l water en magnetron 5 min.
  4. Vlekken op de gel met een kleuroplossing (40% ethanol, 10% azijnzuur en 0,1% Coomassie brilliant blue) gedurende 2 uur en ontkleuring in water.

6. Glycans analyse door massaspectrometrie

  1. Analyseer glycanen zoals eerder 44 beschreven. In het kort, 75 ug van IgG1-Fc werd getrypsiniseerd, vervolgens behandeld door PNGaseF voor de vrijlating van glycanen 45. Gepubliceerd glycanen werden gepermethyleerd en door matrix-geassisteerde laser-desorptie ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOFMS) geanalyseerd.

7. Protocol Aanpassingen voor speciale Scenario

  1. Etikettering Eiwitten met 15 N-gemerkte aminozuren (voor een 50 ml transfectie volume)
    1. Doseer 5 mg van elk aminozuur in een enkele steriele glazen flesje. Mengen met 4 ml autoclaaf water (let Tyr niet volledig oplosbaar, in tegenstelling tot de Leie en Phe). Steriliseer de oplossing autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 min. Laat de oplossing afkoelen tot ongeveer 50-60 ° C.
    2. Voor een 50 ml transfectie volume, volgt u stap 3.1.3 volgens "3.1 Oprichting van een tijdelijke transfectie". Zie de sectie aanvullende materialen voor een voorbeeld met de juiste volumes.
    3. Voor transfectie volgen stappen "3. Instelling van een transiënte transfectie" met vers kweekmedium vervangen met gemerkt aminozuurresten zoals hierboven bereid.
    4. Na 24 uur transfectie, op de dag van de cultuur verdunning intrekken 5,0 ml voorverwarmd Medium B, 40 ml voorverwarmd Medium A en een vers geautoclaveerd 4 ml van de aminozuur mengsel (bereid als in stap 7.1.1. Hierboven) en voeg 1ml voorverwarmd voorraadoplossing van VPA oplossing 50 ml vers kweekmedium verdunning te bereiden met een uiteindelijke concentratie van 4,4 mM VPA. Voeg dit medium aan de transfectie cultuur met een steriele serologische pipet.
    5. Breng de kweek getransfecteerd in de bioveiligheid kast na het steriliseren van het uitwendige van de kolf met 70% ethanol in wateroplossing, voeg de voorbereide verdunningsmiddel en breng de kolf naar de schudinrichting geïncubeerd.
      Opmerking: Medium A een chemisch gedefinieerd serumvrij medium. Aldus is het mogelijk om een ​​andere formulering te bereiden. Neem contact op met de leverancier om een ​​aangepaste Medium Een voorbereiding die bepaalde aminozuren ontbeert verkrijgen. Het is mogelijk om alle aminozuren weggelaten, maar wij verkiezen medium dat slechts enkele uitgelezen residuen mist gebruiken omdat een volledige uitval medium aanpassing van osmolariteit na supplementatie vereist. We kozen voor een Lys-Tyr-Phe uitval medium dat kan worden aangevuld en niet osmolariteit aanpassing. Furthermore, het Medium Een leverancier niet vrij deelt de concentraties van medium componenten; we gebruikten 100 mg / l elk voor Lys, Tyr en Phe succesvol. Volumes van de transfectie en expressie medium moet worden bijgesteld wanneer de extra aminozuren. Hier zijn de aanpassingen aan het protocol hierboven voor isotoop labeling
  2. Vullen de Transfectie met een klein molecuul
    1. Bereid 100 mM voorraadoplossing van 2-deoxy-2-fluor-l-fucose gebruik geautoclaveerd water en steriliseer deze oplossing wordt met een 0,22 uM filter.
    2. Voor een kweek 50 ml, voeg 125 ul (250 uM) van de fucose analoge oplossing voor de transfectie en dilutievloeistof. Opmerking: we nagelaten verdere volumeregeling uitvoeren omdat toevoeging van de substituent op deze concentratie maakt slechts 0,25% van het totale kweekvolume .Het is mogelijk om de expressie met behulp van kleine molecule inhibitoren van glycan verwerkende wijzigen. Hier beschrijven we de voorwaarden voor het opnemen van 2-deoxy-2-fluor-l-fucose, een remmer van glycan fucosylatie. Hebben we> 90% reductie in fucosylatie door toevoeging van fucose analoog in een concentratie van 250 uM in de transfectie en dilutievloeistof.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoog niveau eiwitexpressie en zuiverheid

Deze geoptimaliseerde expressie systeem genereerde een hoge opbrengst van versuikerde eiwitten. Een typisch patroon wordt de expressie van IgG1-Fc (figuur 1). In dit geval, Dag 0 is de dag transfectie gevolgd op dag 1 (verdunning) en vervolgteelt dag tot dag 5. Eiwit expressie wordt geanalyseerd met de oplosbare fractie expressie in het ruwe medium. Een zeer kleine hoev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol illustreert eiwitexpressie via transiënte transfectie van HEK293F of S cellen. De in de Barb en Moremen labs opgericht optimale transfectie voorwaarden gebruik van een kritische combinatie van celdichtheid en reagensconcentraties hoog rendement transfectie te bereiken. Kritische overwegingen bij de uitvoering van dit protocol zijn onder andere: het behoud van een stabiele cultuur voor transfectie (met consistente cultuur verdubbeling keer); transfectie van actief groeiende cellen (verdunning cellen tot 1 x ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen in dit manuscript.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd financieel ondersteund door de subsidies K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) en P01GM107012 (KWM) van de National Institutes of Health, en door fondsen van de Roy J. Carver Afdeling Biochemie, Biofysica & Moleculaire Biologie aan de Iowa State University . De inhoud van dit werk is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Biosafety cabinet NuAire, Inc.CellGard ES NU-S475-400Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubatie shakerINFORS HTMultitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium Life Technologies12338-018
Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium SIGMA14571C 
125 Erlenmeyer kolf met ontluchterCorning Incorporated/Life Sciences431143
250 Erlenmeyer kolf met ontluchterCorning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F CellenLife TechnologiesR790-07
1 ml wegwerp serologische pipetFisher Scietific13-676-10B
10 ml wegwerp serologische pipetFisher Scietific13-676-10J
25 ml wegwerp serologische pipetFisher Scietific13-676-10K
Pipettor (Pipet-Aid XP)Drummond Scientific161263
Trypan Blauw oplossing Thermo Scientific SV30084.01
Telling slides Bio-Rad145-0011
TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Polyethylenimine (PEI)Polysciences Inc.23966Bereid stockoplossing met een concentratie van 1 mg/ml in een buffer met 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) en 150 mM NaCl (pH 7,5). Los PEI volledig op; steriliseer door een 0,22 μM spuitfilter en bewaar bij -20 °C.
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)EMD Chemicals Inc.7365-45-9
25 mm Spuitfilter, 0,22 μMFisher Scietific09-719A
Trisaminomethan (Tris base)Fisher ScietificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
TryptonFisher ScietificBP1421-2
Gist extractFluka Analytical 92144
NatriumchlorideBDH chemicalsBDH8014
Plasmid zuiveringskitQIAGEN12145
Valproic (VPA)SIGMAP4543Bereid stockoplossing van 220 mM  in water, steriliseer door een steriele 0,22 mm filter te passeren en bewaar bij -20 °C
CentrifugeThermo Scientific EW-17707-65
Protein A-Sepharose kolomSIGMAP9424
Ni-NTA superflowQIAGEN30430
3-(N-morpholino)propaansulfonzuur (MOPS)Fisher ScietificBP308-500
GlycineFisher ScietificBP381-500
10 kDa moleculair gewicht cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters MilliporeUFC901096
NatriumdodecylsulfaatALDRICHL3771
Beta-mercaptoethanolALDRICHM6250
GlycerolSIGMAG5516
Precision Plus Protein All Blue StandardsBio-Rad161-0373
Azijnzuur, Glaciaal Fisher Scietific64-19-7
coomassie briljantblauw Bio-Rad 161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO Applied Biosystems
15N gelabeld L-TyrosineALDRICH332151
15N gelabeld L-LysineALDRICH592900
Ongelabeld L-PhenylalanineSIGMA-ALDRICHP2126
13C6-GlucoseALDRICH389374
2-deoxy-2-fluoro-l-fucose SANTA CRUZ Biotechnologysc-283123

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. Essentials of Glycobiology. , Second edition edn, Cold Spring Harbor . (NY). (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226(2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13(2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96(2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. Makrides, S. C. 38, Elsevier. 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Trefwoorden

Recombinante eiwitexpressiezuivering van glycoprote nensuspensiecultuuraffiniteitszuiveringmonitoring van celdichtheidVPA behandelinganalyse van eiwitopbrengstglycaanmodificatie

Gerelateerde artikelen