De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
De kunst van het produceren van recombinante eiwitten met complexe post-translationele modificaties is een grote uitdaging voor studies van de structuur en functie. De snelle vaststelling en hoge herstel van transiënt getransfecteerde zoogdiercellijnen richt deze barrière en is een effectieve manier tot expressie eiwitten die van nature via de ER en Golgi-gemedieerde secretorische pathway. Hier is een protocol voor het eiwit expressie met behulp van het menselijk HEK293F en HEK293S cellijnen getransfecteerd met een zoogdierexpressievector ontworpen voor hoge eiwit opbrengsten. De toepasbaarheid van dit systeem wordt aangetoond met behulp van drie representatieve glycoproteïnen die uitgedrukt met opbrengsten tussen 95-120 mg van het gezuiverde eiwit teruggevonden per liter cultuur. Deze eiwitten zijn de menselijke FcγRIIIa en rat α2-6 sialyltransferase, ST6GalI, beide uitgedrukt met een N-eindstandige GFP fusie, alsook ongemodificeerd menselijk immunoglobuline G1 Fc. Deze robuuste systeem utilizes een serumvrij medium dat is aangepast voor expressie van isotopisch verrijkte eiwitten en koolhydraten structurele studies met massaspectrometrie en kernmagnetische resonantiespectroscopie. Verder kan de samenstelling van de N-glycan worden afgesteld door toevoeging van een kleine molecule bepaalde glycaan wijzigingen voorkomen op een wijze die de opbrengst vermindert.
Inleiding
Het produceren van hoge opbrengsten van de juiste gevouwen en post-translationeel gemodificeerde menselijke eiwitten voor een gedetailleerde analyse van de structuur en functie blijft een belangrijke uitdaging. Een groot aantal expressiesystemen beschikbaar die recombinante eiwitten met natief-achtige en gedrag produceren. Bacteriële expressiesystemen, voornamelijk Escherichia coli-stammen, zijn de meest toegankelijke en gebruikte gereedschappen in de onderzoeksarena, vanwege de eenvoud van deze expressiesystemen, ofschoon gist, plant, insect en zoogdier systemen zijn ook beschreven 04/01. Het merendeel van deze systemen zijn niet in staat geschik....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol is voldoende voor expressie met behulp van HEK293F of HEK293S cellen.
1. Cell Oprichting
- Cultuur Inenting
Opmerking: Alle cultuur manipulatie procedures moeten worden uitgevoerd in een BSL-2-faciliteit en elk item bracht in de bioveiligheid kast moeten worden gesteriliseerd door te besproeien met een ethanol 70% in water oplossing.- Bedien de incubator schudder bij 135 rpm, 80% vochtigheid en 8,0% CO2 en 37 ° C. "Aan" de UV lamp van de bioveiligheid kast tenminste 1 uur voor werken. Voorverwarmen de afgedichte Medium Medium A en B flessen in het waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Steriliseren 125 m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hoog niveau eiwitexpressie en zuiverheid
Deze geoptimaliseerde expressie systeem genereerde een hoge opbrengst van versuikerde eiwitten. Een typisch patroon wordt de expressie van IgG1-Fc (figuur 1). In dit geval, Dag 0 is de dag transfectie gevolgd op dag 1 (verdunning) en vervolgteelt dag tot dag 5. Eiwit expressie wordt geanalyseerd met de oplosbare fractie expressie in het ruwe medium. Een zeer kleine hoev.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol illustreert eiwitexpressie via transiënte transfectie van HEK293F of S cellen. De in de Barb en Moremen labs opgericht optimale transfectie voorwaarden gebruik van een kritische combinatie van celdichtheid en reagensconcentraties hoog rendement transfectie te bereiken. Kritische overwegingen bij de uitvoering van dit protocol zijn onder andere: het behoud van een stabiele cultuur voor transfectie (met consistente cultuur verdubbeling keer); transfectie van actief groeiende cellen (verdunning cellen tot 1 x .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen in dit manuscript.
Dankbetuigingen
Dit werk werd financieel ondersteund door de subsidies K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) en P01GM107012 (KWM) van de National Institutes of Health, en door fondsen van de Roy J. Carver Afdeling Biochemie, Biofysica & Moleculaire Biologie aan de Iowa State University . De inhoud van dit werk is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Biosafety cabinet | NuAire, Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Incubatie shaker | INFORS HT | Multitron Cell | |
| Medium A: FreeStyle Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | |
| Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium | SIGMA | 14571C | |
| 125 Erlenmeyer kolf met ontluchter | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 Erlenmeyer kolf met ontluchter | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cellen | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml wegwerp serologische pipet | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml wegwerp serologische pipet | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml wegwerp serologische pipet | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| Pipettor (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blauw oplossing | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Telling slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | Bereid stockoplossing met een concentratie van 1 mg/ml in een buffer met 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) en 150 mM NaCl (pH 7,5). Los PEI volledig op; steriliseer door een 0,22 μM spuitfilter en bewaar bij -20 °C. |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25 mm Spuitfilter, 0,22 μM | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethan (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| Gist extract | Fluka Analytical | 92144 | |
| Natriumchloride | BDH chemicals | BDH8014 | |
| Plasmid zuiveringskit | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | Bereid stockoplossing van 220 mM in water, steriliseer door een steriele 0,22 mm filter te passeren en bewaar bij -20 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | EW-17707-65 | |
| Protein A-Sepharose kolom | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3-(N-morpholino)propaansulfonzuur (MOPS) | Fisher Scietific | BP308-500 | |
| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa moleculair gewicht cut-off Amicon® Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC901096 | |
| Natriumdodecylsulfaat | ALDRICH | L3771 | |
| Beta-mercaptoethanol | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| Azijnzuur, Glaciaal | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie briljantblauw | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | Applied Biosystems | ||
| 15N gelabeld L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15N gelabeld L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| Ongelabeld L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2-deoxy-2-fluoro-l-fucose | SANTA CRUZ Biotechnology | sc-283123 |
Referenties
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
