Gebruik van een Multi-compartiment Dynamic enkel enzym Phantom voor Studies van gehyperpolariseerd Magnetic Resonance Agents

Samenvatting

Een dynamische multicompartiment-fantoom wordt gebruikt om bepaalde biologie van belang te simuleren voor metabolische studies met behulp van hypergepolariseerde magneetresonantie-agentia.

Samenvatting

Imaging gehyperpolariseerd substraten door magnetische resonantie toont grote klinische belofte voor evaluatie van kritische biochemische processen in real time. Vanwege fundamentele beperkingen die door het gehyperpolariseerde toestand worden exotische imaging en reconstructietechnieken algemeen gebruikt. Een praktisch systeem voor de karakterisering van dynamische, multispectrale beeldvorming kritisch nodig. Een dergelijk systeem moet reproduceerbaar recapituleren de relevante chemische dynamiek van normale en pathologische weefsels. De meest gebruikte substraat-to-date is gehyperpolariseerd [1- ¹³ C] -pyruvate voor de beoordeling van kanker metabolisme. We beschrijven een enzym gebaseerde fantoom systeem dat de omzetting van pyruvaat tot lactaat medieert. De reactie wordt geïnitieerd door injectie van het gehyperpolariseerde middel in meerdere kamers in de fantoom, die elk verschillende concentraties van reagentia die de reactiesnelheid te regelen. Meerdere compartimenten zijn nodig om ervoor te zorgen dat imaGing sequenties getrouw vangen ruimtelijke en metabole heterogeniteit weefsel. Dit systeem zal de ontwikkeling en validatie van geavanceerde imaging strategieën te helpen door het verstrekken van chemische dynamiek die niet beschikbaar zijn van conventionele fantomen zijn, alsmede de controle en de reproduceerbaarheid dat in vivo is niet mogelijk.

Inleiding

Het klinische effect gehyperpolariseerd magnetic resonance imaging (MRI) van ^{13C-gelabelde} verbindingen kritisch afhankelijk van het vermogen om chemische conversie met real time magnetische resonantie spectroscopie en spectroscopische beeldvorming ^1-5 meten. Tijdens sequentie ontwikkeling en verificaties, wordt dynamische chemische omzetting algemeen bereikt door in vivo of in vitro modellen ^6-9 die beperkte controle en reproduceerbaarheid. Voor robuuste testen en kwaliteitsborging, zou een meer gecontroleerde systeem dat de chemische omzetting endemisch voor deze meting behoudt de voorkeur. Schetsen we een werkwijze om deze omzetting op een reproduceerbare wijze met een dynamische interne enzym phantom bereiken.

De meeste studies met gehyperpolariseerde ¹³ C agentia gericht op beeldvorming gehyperpolariseerde substraten in een werkende biologische omgeving. Dit is voor de hand liggende keuze als het doel is om biologische studieal verwerkt of te bepalen potentiële impact op de klinische zorg. Echter, als karakterisering van een aantal meetsysteem of data processing algoritme is gewenst, biologische modellen hebben een groot aantal nadelen zoals inherent ruimtelijke en temporele variabiliteit ^10. Echter, conventionele statische fantomen niet de chemische omzetting van het primaire klinische belangstelling voor MRI gehyperpolariseerd substraten drives, en kan niet worden gebruikt om detectie van conversie of andere dynamische parameters ¹¹ te karakteriseren. Met behulp van een enkel enzym systeem dat we kunnen bieden controleerbaar en reproduceerbaar chemische omzetting, waardoor streng onderzoek van de dynamische beeldvorming strategieën.

Dit systeem is gericht op onderzoekers die de ontwikkeling van imaging strategieën voor gehyperpolariseerd substraten en wens om de prestaties te karakteriseren voor de vergelijking tegen alternatieve benaderingen. Als statische metingen de gewenste eindpunt dan statisch ^13-C gelabeld metaboliet fantomen will volstaan ^​​11. Aan de andere kant als meer complexe biologische karakterisering is kritisch voor de werkwijze (levering, celdichtheid, etc.) dan zullen de hoeveelheid biologische modellen nodig ^12-14. Dit systeem is ideaal voor de bepaling van imaging strategieën die gericht zijn op een kwantitatieve maat schijnbare chemische conversie verschaffen.

Protocol

LET OP: (Phantom Design) Twee 3 ml kamers werden gefreesd uit Ultem en voorzien van PEEK buis (1,5875 mm OD en 0,762 mm ID) voor injectie en uitlaat. De kamers werden geplaatst in een 50 ml centrifugebuis gevuld met water (figuur 1). Om signaal vides gecreëerd door luchtbellen te vermijden, werden de kamers en de lijnen vooraf gevuld met gedemineraliseerd water (dH ₂ O).

1. Oplossing Voorbereiding

1. Bereid 1 L bufferoplossing (81,3 mM Tris pH 7,6, 203,3 mM NaCl). Weeg 11,38 g Trizma preset kristallen pH 7,6 en 11,88 g NaCl en oplossen in 1 L van dH ₂ O.
2. Bereid 50 mM NADH oplossing. Weeg 17,8 mg β-nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), verminderde dikaliumzout en los op in 280 pi bufferoplossing die bereid is in stap één.
3. Bereid 250 U / ml enzymoplossing. Weeg 78,75 activiteit eenheden van lactaat dehydrogenase (LDH) en los op in 315 ui buffer van sTep één.
4. Bereid pyrodruivenzuur mix. Weeg 21,4 mg Ox063 trityl radicale en los op in 1,26 g (~ 1 ml) [1- ¹³ C] pyrodruivenzuur.
5. Bereid oplosmedia (40 mM Tris pH 7,6, 40 mM NaOH, 0,27 mM EDTA en 50 mM NaCl). Weeg 5,96 g Trizma preset kristallen pH 7,6, 1,6 g NaOH, 0,1 g ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout uitdrogen (EDTA) en 2,9 g NaCl en oplossen in 1 L dH ₂ O.
6. Bereid 01:10 gadoteridol oplossing (50 mM). Meng 1 pl gadoteridol in 9 ul van dH ₂ O. Bereiding van 8 M ^[13 C] ureum. Weeg 1,465 5 ^[13 C] ureum en lossen in 3 ml dH ₂ O.

2. Bereiding gehyperpolariseerd pyruvaat

1. In een monsterhouder voor een dynamische nucleaire polarisatie (DNP) systeem, pipet 0,3 ul van de gadoteridol oplossing en 13 mg (~ 10 pi) van de pyrodruivenzuur oplossing.
2. Kort roer dit mengsel in de steekproef beker met de pipet tip.
3. Steek monster in de DNP-systeem.
   1. Verzekeren de deur naar de DNP systeem gesloten. Begin met het monster inbrengen door te klikken op de insert monster knop op de DNP-systeem console. Op de wizard sample te selecteren normaal monster en druk op volgende.
   2. Houden van de monsterhouder verticale plaats voorzichtig het inbrengstang over de bovenkant van de monsterhouder. Wanneer u wordt gevraagd, opent u de DNP-systeem en plaats de beker in de variabele temperatuur insert (VTI) met behulp van de inbrengstang.
   3. Trek de plunjer aan het einde van het monster inbrengstang bij de inhoud van de variabele temperatuurindex vrijgeven. Verwijder het monster inbrengstang uit het systeem en klik op de volgende knop op de DNP-systeem console.
4. Start de polarisatie.
   1. Klik op de start polarisatie knop op de DNP-systeem console. In de RINMR soort software .HYPERSENSENMR tot polarisatie lanceren monitoring software. Stel bouwen configuratie 1 en druk op enter. Klik vervolgens op solide bouw up.
   2. Stel de locatie en de naam van het bestand op te slaan. Selecteer het profiel voor 13-C in de drop-down lipje op de DNP-systeem console en klik op Volgende. Vink het vakje te proeven tijdens de opbouw, ingesteld sample tijd tot 300 sec en klik op Voltooien.
5. Meet 3,85 g (~ 4 ml) van de oplosmedia hetzij volume met een 5 ml spuit of gewichtspercenten op een schaal.

3. Bereiding van het enzym Spoor

1. Vul een microcentrifugebuis met ~ 3 ml ^[13 C] ureumoplossing en het in de 50 ml centrifugebuis. Vul het 50 ml centrifugebuis met dH ₂ O.
2. Pre-vullen de twee enzym kamers en de lijnen met dH ₂ O door het injecteren van ~ 3 ml dH ₂ O in de injectie lijnen van het fantoom, zorg ervoor dat eventuele luchtbellen gevormd spoelen.
3. Plaats de fantoom in het midden van de magneet met gemakkelijke toegang tot de inspuitleidingen. Zorg ervoor dat er een container naar de vloeistof die vent uit aan t vangen Hij afvoerleiding.
4. Bereid hoge activiteit enzym mengsel (17,14 mM NADH, 44.57 U / ml LDH). Meng 240 ul NADH oplossing, 125 pl LDH-oplossing en 335 ui buffer en bewaar in een 3 ml spuit aan de injectie lijn kan worden bevestigd.
   Opmerking: wanneer gecombineerd met 500 ui 40 mM pyruvaat van DNP systeem, zal de uiteindelijke fantoom volume 1,2 ml met concentraties van 16,7 mM pyruvaat, 10 mM NADH en 26 U / L LDH in een Tris gebufferde oplossing met een pH van 7,5.
5. Bereid lage activiteit enzymmengsel (17,14 mM NADH 26.79 U / ml LDH) Meng 240 ul NADH-oplossing, 75 ul LDH-oplossing en 385 ui buffer en bewaar in een aparte 3 ml spuit aan de injectie lijn kan worden bevestigd.
   LET OP: Als in combinatie met de 500 pi van 40 mM pyruvaat van de DNP-systeem de laatste fantoom volume 1,2 ml met een concentratie van 16,7 mM pyruvaat, 10 mM NADH, en 15,625 U / L LDH in een tris gebufferde oplossing met een pH van 7,5 .

jove_title "> 4. Run Elke Quality Assurance (QA) en positionering Scans

1. Een startpositie.
   1. Laad een nieuwe flash positionering scan in bedrijf mode ^[1 H] TX / RX Volume mode. Verander opgezet dimensies 2: Spectrometer Control Tool -> Bewerken GS -> Setup Dimensions -> 2. Druk GSP op de Spectrometer Controle en beweeg phantom tot in het midden van de magneet. Druk op STOP dan Druk GOP op de Spectrometer controle.
2. Pilot Scan.
   1. Laad een nieuwe TriPiolt positionering scan in bedrijf mode ^[1 H] TX / RX Volume mode. Positie Slice: Scan Controle -> Segment Gereedschap-> verplaatsen plakjes (houd M-toets klikken en slepen, selecteer slice om te gaan met de slice pakket slider).
   2. Wobble ¹ H Coil: Spectrometer Control Tool -> Acq -> Wobble. Tune en match ^1H spoel achter de magneet en druk op STOP. Terwijl u de Shift-toets drukt het verkeerslicht op het bedieningspaneel venster scan.

5. Radial Echo Planar Spectral Imaging Scan Setup

1. Laad een nieuwe radiale echo vlakke spectroscopische beeldvorming (radEPSI) scan in operationele modus ^[13 C] TX / RX Volume mode. Positie Slice: Slice Tool op de Scan-controle en bewegen plakjes (houd M-toets klikken en slepen, selecteer slice om te gaan met de slice pakket slider).
2. Wobble ¹³ C Coil door te klikken Spectrometer Control Tool -> Acq -> Wobble. Stel de ontvanger winst voor 1000-2000 op de Spectrometer.
3. Voer de laatste systeemcontrole. Afhankelijk van de volgorde in acht koolstof 13 signaal van het ureum kamer in een scout protocol.
   LET OP: Dit zorgt ervoor dat het systeem goed is ingesteld voor het begin van het onomkeerbare ontbinding proces.

6. Run Ontbinding

1. Wanneer het pyruvaat heeft bereikt> 90% polarisatie (~ 1 uur), de oplossingen en phantom klaar zijn, en de scan is geconfigureerd op de run ontbinding knop op de DNP systengel console.
2. Wanneer u wordt gevraagd te bewegen de ontbinding stick in zijn werkstand en injecteer ontbinding media. Sluit de DNP-systeem en klik op de afgewerkte knop op de DNP-systeem console. Verplaats ontbinding te plakken naar rustpositie als daarom wordt gevraagd en klik op finish.
3. Wanneer het DNP systeem levert het gehyperpolariseerde pyruvaat (~ 2 min na verhitting starts) trekken 500 ul van de pyruvaat oplossing in elke hoge en lage enzymconcentratie oplossing spuiten. Langzaam (~ 10 sec) te injecteren elke spuit in een injectie lijn.
   LET OP: Het scannen had kunnen worden gestart voor de injectie of wanneer tot 3 minuten na de injectie, afhankelijk van de scan protocol gebruikt.

7. Beeldverwerking

LET OP: Deze fantoom is ontworpen voor gebruik met vele imaging strategieën. Zie figuur 2, als voorbeeld van het rAd-EPSI beelden werden verwerkt met behulp van Matlab.

1. Laad ruwe data van de FID-bestand. Reshape de gegevens om het aantal projecties te passen, uit te lezen punten, echo's en rekening voor data opgeslagen als echte en denkbeeldige paren. Scheiden van de even en oneven echo punten.
2. Fourier-transformatie ofwel de even of oneven echo's langs de echo dimensies. Visueel identificeren van de frequentiebanden van pyruvaat en lactaat. Eenvoudigheidshalve de absolute waarde van het spectrum gebruikt.
3. Scheid elk metaboliet band en Fourier-transformatie langs de frequentie encode richting geïsoleerde sinogrammen opleveren voor elke metaboliet. Inverse radon transformeren de afzonderlijke sinogrammen afbeelding van een van beide lactaat of pyruvaat om te produceren.

Resultaten

Slice-selectieve 2D-beelden werden verkregen met behulp van een momentopname radEPSI volgorde. Metaboliet beelden werden gereconstrueerd met behulp van gefilterde back-projectie. De metaboliet beelden waren goed afgestemd proton beelden, zoals gezien in figuur 2. In dit systeem gehyperpolariseerd lactaat signaal echter alleen mogelijk door enzymatische omzetting gehyperpolariseerd pyruvaat. In figuur 4 is de onderste kamer, waarbij hogere LDH concentrati...

Discussie

Real-time beeldvorming van gehyperpolariseerde metabolieten heeft vele unieke uitdagingen voor de reeks, de validatie en kwaliteitscontrole. De mogelijkheid om spatiotemporele en spectrale heterogeniteit op te lossen biedt aanzienlijke klinische potentieel, maar verzet zich tegen QA en validatie methoden in verband met conventionele MRI. Complex imaging sequenties of reconstructie algoritmen kunnen subtiele afhankelijkheden die maken ze moeilijk te karakteriseren of te valideren buiten de beeldvorming experiment hebben....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BioSpect 7T	Bruker	BioSpec 70/30 USR	7 Tesla Pre-Clinical MRI Scanner
HyperSense	Oxford Instruments	Hypersense DNP Polarizer	Dynamische nucleaire polarisator voor MRI-agentia
1-13C-Pyrvic Zuur	Sigma Aldrich	677175	Carbon 13 gelabelde zuivere pyrodruivenzuur
Trityl Radikale	GE Healthcare	OX063	Vrij radicaal gebruikt in dynamische nucleaire polarisatie
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Ethyleen diamine tetraazijnzuur
LDH	Worthingthon	LS002755	Lactaat dehydrogenase uit konijnenspier
NADH	Sigma Aldrich	N4505	β-Nicotinamide adenine dinucleotide, gereduceerd dikaliumzout
Trizma	Sigma Aldrich	T7943	Trizma voorgeprogrammeerde kristallen
NaCl	Sigma Aldrich	S7653