Hier presenteren we een protocol voor laser-geassisteerde microdissectie van specifieke plantencellen voor transcriptioneel profileren. Hoewel het protocol geschikt is voor verschillende soorten en celtypen, is de focus op zeer ontoegankelijke cellen van de vrouwelijke kiemlijn die belangrijk zijn voor seksuele en apomictische reproductie in het kruisbloemigengeslacht Boechera.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Laser-assisted Microdissection (LAM) als een tool voor Transcriptionele Profiling van individuele cel Types
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het begrip van ontwikkelingsprocessen op moleculair niveau vereist inzichten in transcriptionele regulatie, en dus het transcriptoom, op het niveau van individuele celtypen. Hoewel de hier beschreven methoden over het algemeen toepasbaar zijn op een breed scala aan soorten en celtypen, richt ons onderzoek zich op plantenreproductie. Plantencultuur en zaadproductie is van cruciaal belang voor de menselijke en dierlijke voeding. Een gedetailleerd begrip van de regulatoire netwerken die de vorming van de reproductieve lijn (kiemlijn) en uiteindelijk zaden beheersen, is een voorwaarde voor de gerichte manipulatie van plantenreproductie. Met name de engineering van apomixis (asexuele reproductie door zaden) in gewasplanten belooft grote verbeteringen, omdat het leidt tot de vorming van klonale zaden die genetisch identiek zijn aan de moederplant. Bijgevolg zijn de celtypen van de vrouwelijke kiemlijn van groot belang voor het begrijpen en ontwerpen van apomixis. Echter, aangezien de corresponderende cellen diep ingebed zijn in de bloemweefsels, zijn ze erg moeilijk toegankelijk voor experimentele analyses, inclusief celtype-specifieke transcriptomics. Om deze beperking te overwinnen, kunnen secties van individuele cellen worden geïsoleerd door laser-ondersteunde microdissectie (LAM). Hoewel LAM in combinatie met transcriptioneel profilering de identificatie van genen en paden mogelijk maakt die actief zijn in elk celtype met hoge specificiteit, kan het vaststellen van een geschikt protocol een uitdaging zijn. Specifiek kan de kwaliteit van RNA verkregen na LAM worden aangetast, vooral wanneer kleine, enkele cellen worden gericht. Om dit probleem te omzeilen, hebben we een workflow voor LAM opgesteld die reproduceerbaar resulteert in hoge RNA-kwaliteit die goed geschikt is voor transcriptomics, zoals hier geëxemplifieerd door de isolatie van cellen van de vrouwelijke kiemlijn in apomictische Boechera. In dit protocol worden procedures beschreven voor weefselvoorbereiding en LAM, ook met betrekking tot RNA-extractie en kwaliteitscontrole.
Inleiding
Transcriptionele studies uitgevoerd op het weefsel niveau worden de transcriptomes zeer gespecialiseerde maar zeldzame celtypen vaak gemaskeerd door overvloediger omringende cellen. Een voorbeeld van zo'n gespecialiseerde celtypes zijn de cellen van de vrouwelijke reproductieve lijn (kiembaan) in planten. Het vrouwtje kiemlijn wordt opgegeven binnen de ontwikkeling van eitjes, de voorlopers van zaden binnen de gynoecium van de bloem 1,2. De megaspore moedercel (MMC) is de eerste cel van de vrouwelijke kiemlijn. Ondergaat meiosis een viertal verminderde megasporen vormen. Gewoonlijk slechts één van deze megaspores overleeft en scheidt mitotisch zonder c....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Let op: Dit protocol beschrijft weefsel voorbereiding, laser bijgestaan microdissectie en RNA-extractie voor transcriptie profilering. Gebruik handschoenen altijd in alle stappen van het protocol. Bestuderen en overwegen de veiligheidsvoorschriften voor elke chemische stof gebruikt. In het bijzonder, in gedachten houden dat Xyleen is gevaarlijk en kan handschoenen binnendringen en dat methanol is giftig. Voor alle instrumenten gebruikt, moet u daarom verwezen naar handleidingen.
1. Verwijdering van RNAse activiteit van glaswerk en andere apparatuur
- Voor gebruik omwikkel te glaswerk in aluminiumfolie vóór het bakken voor ~ 8 uur bij 180 ° C te gar....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Monstervoorbereiding en LAM worden gedaan in opeenvolgende stappen
Een aantal opeenvolgende stappen vereist RNA bereiden transcriptionele analyse van geselecteerde celtypen door LAM (figuur 1). Dit begint met de oogst van de bloemen en onmiddellijke fixatie dat de RNA populatie ongewijzigd blijft na de oogst. Het weefsel is ingebed, coupes, en gemonteerd op dia's. Hierdoor kan de isolatie .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het protocol is geschikt voor verschillende cel- en weefseltechnologie Types
LAM gecombineerd met transcriptoom analyse van microarrays of RNA-Seq is een waardevol instrument om inzicht te krijgen in de specifieke patronen van de activiteit van genen reguleren ontwikkelings- of fysiologische processen 7-11,13,14 krijgen. De geschiktheid van deze methode voor een bepaalde celtype kritisch afhankelijk structurele problemen. De cel moet duidelijk zichtbaar en ondubbe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) voor het verstrekken van Boechera divaricarpa zaden en Sharon Kessler (University of Oklahoma) voor het kritische lezen en proeflezen. Werk aan celtype-specifieke transcriptoomanalyses om gametofyt ontwikkeling en apomixis in UG's laboratorium te bestuderen, wordt ondersteund door de Universiteit van Zürich, door een beurs van de "Deutsche Forschungsgemeinschaft" en het Marie Curie project IDEAGENA aan AS, door subsidies van de "Staatssekretariat für Bildung und Forschung" in het kader van COST action FA0903 (aan UG en AS) en de Zwitserse Nationale Stichting (aan UG).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Ethanol | VWR | 1.009.861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1.000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
Referenties
- Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
