Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in

29.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53975

⸱

18 april 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

In dit artikel

Samenvatting

Het aanbod van eiwitten weerspiegelt de snelheden van zowel eiwitsynthese als eiwitafbraak. Dit artikel beschrijft het gebruik van cycloheximide-chase gevolgd door western blotting om eiwitafbraak te analyseren in het model eencellige eukaryoot, Saccharomyces cerevisiae (knopgist).

Samenvatting

Regulering van eiwit overvloed is cruciaal voor vrijwel elke cellulaire proces. Eiwitgehalte weerspiegelt de integratie van de snelheden van eiwitsynthese en eiwitafbraak. Veel assays rapportage over eiwit overvloed (bijvoorbeeld één tijdstip western blotting, flowcytometrie, fluorescentie microscopie, of-groei op basis reporter assays) geen discriminatie van de relatieve effecten van de vertaling en proteolyse op eiwitgehalten niet toestaan. Dit artikel beschrijft het gebruik van cycloheximide chase gevolgd door Western blotting om specifiek wat eiwitafbraak in het model eencellige eukaryoot, Saccharomyces cerevisiae (gist). In deze procedure worden gistcellen geïncubeerd in aanwezigheid van de translationele remmer cycloheximide. Hoeveelheden van cellen onmiddellijk verzameld na en op specifieke tijdstippen na toevoeging van cycloheximide. Cellen worden gelyseerd en de lysaten worden gescheiden door polyacrylamidegelelektroforese for western blot analyse van eiwitten overvloed op elk tijdstip. De cycloheximide chase werkwijze maakt visualisatie van de afbraakkinetiek van de steady state populatie van verschillende cellulaire eiwitten. De procedure kan worden gebruikt om de genetische behoefte en omgevingsinvloeden op eiwitafbraak onderzoeken.

Inleiding

Eiwitten uit te voeren cruciale functies in vrijwel elke cellulaire proces. Vele fysiologische processen vereisen de aanwezigheid van een specifiek eiwit (of eiwitten) voor een bepaalde periode of onder bepaalde omstandigheden. Organismen daarom controleren en reguleren eiwit overvloed aan mobiele behoeften 1 te voldoen. Bijvoorbeeld, cyclinen (eiwitten die celdeling) aanwezig op specifieke fasen van de celcyclus en het verlies van cycline gereguleerde niveau is geassocieerd met kwaadaardige tumorvorming 2. Naast het reguleren van eiwit niveaus om cellulaire behoeften te voldoen, cellen in dienst afbrekende kwaliteitscontrole mechanismen om verkeerd gevouwen, niet gemonteerd of anderszins afwijkende eiwitmoleculen 3 te elimineren. Controle van eiwit overvloed impliceert regulering van beide macromoleculaire synthese (transcriptie en vertaling) en afbraak (RNA verval en proteolyse). Gestoorde of overmatige afbraak van eiwitten bijdraagt ​​aan meerdere pathologieën, Waaronder kanker, cystische fibrose, neurodegeneratieve aandoeningen en cardiovasculaire aandoeningen 4-8. Proteolytische mechanismen vertegenwoordigen daarom veelbelovende therapeutische doelwitten voor een reeks van ziekten 9-12.

Analyse van eiwitten op een enkel tijdstip (bijvoorbeeld door western blot 13, 14 flowcytometrie of fluorescentiemicroscopie 15) geeft een overzicht van de steady-state-eiwit overvloed zonder het openbaren van de relatieve bijdrage van de synthese of degradatie. Evenzo groei gebaseerde reporter assays tijdens steady state eiwitniveaus over een langere tijdsperiode zonder onderscheid tussen de invloeden van de synthese en degradatie 15-20. Het is mogelijk de bijdrage van afbrekende processen steady state eiwitniveaus afgeleid door vergelijking overvloed voor en na remming van specifieke onderdelen van de afbrekende mechanisme (bijvoorbeeld door het inactiveren farmacologisch proteasome 21 of het uitspelen van een gen dat de hypothese vereist zijn voor de afbraak 13). Een verandering in de steady state eiwitniveaus na remmen afbraakroutes sterk bewijs voor de bijdrage van proteolyse de controle eiwitgehalte 13. Echter, een dergelijke analyse nog steeds geen informatie verstrekken over de kinetiek van de omzet eiwit. Cycloheximide chase gevolgd door western blotting overwint deze tekortkomingen doordat onderzoekers om eiwitafbraak te visualiseren in de tijd 22-24. Omdat verder eiwitdetectie volgende cycloheximide chase typisch uitgevoerd door middel van Western blotting, radioactieve isotopen en langdurige immunoprecipitatie stappen niet vereist voor cycloheximide chase, in tegenstelling tot veel gangbare pulse chase technieken, die eveneens uitgevoerd om eiwitafbraak 25 te visualiseren.

Cycloheximide werd eerst geïdentificeerd als een verbinding met anti-schimmel juistebanden geproduceerd door de gram-positieve bacterie Streptomyces griseus 26,27. Het is een cel-permeabel molecuul dat specifiek eukaryote cytosolische (maar niet organellen) vertaling remt door afbreuk ribosomale translocatie 28-31. In een cycloheximide chase experiment wordt cycloheximide toegevoegd aan cellen en monsters van cellen onmiddellijk op specifieke tijdstippen na toevoeging van de verbinding 22 verzameld. Cellen worden gelyseerd en eiwitgehalte op elk tijdstip geanalyseerd, typisch door western blot. Afneemt eiwitgehalte na toevoeging van cycloheximide veilig kan worden toegeschreven aan eiwitafbraak. Een instabiele eiwit zal afnemen in overvloed in de tijd, terwijl een relatief stabiele eiwit weinig verandering in overvloed zal vertonen.

Mechanismen van selectieve afbraak van eiwitten zijn sterk geconserveerd in heel Eukarya. Veel van wat bekend is over eiwitafbraak werd voor het eerst geleerd inhet model eencellige eukaryoot, Saccharomyces cerevisiae (gist) 25,32-36. Studies met gist zijn waarschijnlijk blijven leveren nieuwe en belangrijke inzichten in eiwitafbraak. Werkwijze voor cycloheximide chase in gistcellen gevolgd door Western blot analyse van eiwitten overvloed wordt hier gepresenteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Groei en Oogst van gistcellen

  1. Zoniet analyseren afbraakkinetiek van een endogeen gisteiwit, transformatie gewenste giststam (s) met een plasmide dat codeert voor het eiwit van belang. Betrouwbare werkwijzen voor transformatie van gist zijn hiervoor beschreven 37.
  2. Inoculeer gist in 5 ml geschikt medium (bijvoorbeeld selectieve synthetische gedefinieerd (SD) medium voor plasmide handhaving van getransformeerde cellen of niet-selectieve gistextract-pepton-dextrose (YPD) medium voor niet- getransformeerde cellen). Incubeer overnacht bij 30 ° C, roteren.
    OPMERKING: 30 ° C is de optimale groeitemperatuur voor typische wildtype laboratorium giststammen 38. Omdat sommige mutante giststammen niet optimaal groeien bij 30 ° C en sommige eiwitten ondergaan temperatuurafhankelijke degradatie, het voor groei gebruikte gistcel en cycloheximide chase temperaturen worden empirisch bepaald 39.
  3. meet the optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van elke overnacht kweek.
    OPMERKING: Cellen kunnen in logaritmische en stationaire groeifase maar moet minimaal bereikt een dichtheid verdunning zal een OD 600 = 0,2 in 15 ml vers medium.
  4. Verdun de overnachtkweken een OD600 waarde van 0,2 in 15 ml vers medium.
  5. Incubeer gist bij 30 ° C, schudden totdat de cellen te bereiken mid-logaritmische groeifase (dwz een OD 600 tussen 0,8 en 1,2).
  6. Tijdens gistcel groei, de volgende in voorbereiding op de cycloheximide chase procedure:
    1. Stel een hitteblok die plaats 15 ml conische buizen tot 30 ° C voor incubatie van cellen in de aanwezigheid van cycloheximide. Voeg water toe aan de putjes van de warmte blok voor een efficiënte warmteverdeling culturen mogelijk te maken. Voeg water toe aan elk putje zodat een 15 ml conische buis zorgt ervoor dat het waterniveau stijgt, maar niet overstromen, de rand van de put.
    2. Stel een tweede warmte-blok dat plaats biedt aan 1,5 ml microcentrifugebuizen tot 95 ° C voor eiwitdenaturatie na cellysis.
    3. Voorverwarmen vers groeimedium (1,1 ml per tijdstip per cultuur te testen) tot 30 ° C.
    4. Voeg 50 ul 20x Stop Mix voor een pre-gelabeld microcentrifugebuizen (één buis per tijdstip per cultuur te testen). Plaats de buizen op ijs.
      LET OP: Natriumazide, een ingrediënt in 20x Stop Mix, is giftig via orale inname of huidcontact. Volg de aanbevelingen van de fabrikant bij de voorbereiding, de opslag en het hanteren van natriumazide. In geval van accidentele blootstelling, raadpleeg veiligheidsinformatieblad verstrekt door de fabrikant.
  7. Wanneer cellen mid-logaritmische groei hebben bereikt, het verzamelen van 2,5 OD 600 eenheden van elke cultuur per tijdstip om te worden getest (bv 7,5 OD 600 eenheden eiwit overvloed op drie tijdstippen te analyseren). Centrifuge verzamelde cellen in 15 ml conische buisjes 3,000 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
    Opmerking: Een OD 600 eenheid is gelijk aan de hoeveelheid gist aanwezig in 1 ml kweek bij een OD 600 van 1,0. Het volume van cultuur (in ml) nodig om X OD 600 eenheden (V) oogsten kan worden bepaald met de volgende vergelijking: V = X OD 600 eenheden / OD 600 gemeten. Bijvoorbeeld, tot 7,5 OD 600 eenheden van gist celcultuur oogsten op een OD 600 van 1,0, het verzamelen van 7,5 OD 600 eenheden / 1,0 = 7,5 ml gistcultuur.
  8. Resuspendeer elk celpellet in 1 ml van 30 ° C (voorverwarmd) vers groeimedium per 2,5 OD 600 eenheden van cellen (bijvoorbeeld 3 ml van 7,5 OD 600 eenheden).

2. Cycloheximide Chase

  1. Evenwicht gistcel schorsingen door incubatie gedurende 5 minuten in de 30 ° C verwarmen blok.
  2. Bereid een timer te tellen van 0:00.
  3. Om de cycloheximide chase, drukt u op "Start" op de timer te beginnen. Snel,maar goed, de volgende stappen:
    1. Cycloheximide aan een uiteindelijke concentratie van 250 ug / ml aan de eerste gistcel suspensie (bijvoorbeeld voeg 37,5 ul van 20 mg / ml cycloheximide voorraad tot 3 ml celsuspensie) en vortex kort mengen.
      LET OP: Cycloheximide is een irriterend voor de huid en is giftig via orale inname. Volg de aanbevelingen van de fabrikant bij de voorbereiding, de opslag en het hanteren van cycloheximide. In geval van accidentele blootstelling, raadpleeg veiligheidsinformatieblad verstrekt door de fabrikant.
    2. Onmiddellijk na het toevoegen van cycloheximide en vortexen, overdracht 950 ui (2,4 OD 600 eenheden) van de gist celsuspensie met cycloheximide toegevoegd aan een pre-gemerkte microcentrifugebuis met 50 ul ijskoude 20x stop mix. Vortex de microcentrifugebuis, en leg ze op ijs tot alle monsters zijn verzameld.
    3. Zet de gistcel suspensie tot 30 ° C.
  4. Herhaal de stappen 2.3.1 tot 2.30,3 voor elk van de overblijvende gist celsuspensies op regelmatige tijdstippen (bijvoorbeeld elke 30 seconden, zodat cycloheximide toegevoegd aan Sample # 1 op 0:00, Monster # 2 in 00:30, Monster # 3 op 1:00 , enz.).
  5. Bij elke volgende tijdstip, draaikolk gistcel schorsingen en overdracht 950 ul aan gemerkt microcentrifugebuizen die 50 pi pre-gekoelde 20x Stop Mix. Vortex en plaats verzamelde cellen op ijs. Terug 15 ml conische buizen tot 30 ° C verwarmen blok.
    1. Bijvoorbeeld, voor verzameling cellen 30 minuten na toevoeging cycloheximide (uitgaande van 30-seconden intervallen tussen cycloheximide Naast gist celsuspensies aan het begin van het tijdsverloop), vortex en verwijder 950 pi celsuspensie van Voorbeeld # 1 in 30:00 . Herhaal voor monster # 2 op 30:30, enzovoort.
      LET OP: Om te voorkomen dat de afwikkeling van gist, vortex celsuspensies in 15 ml conische buizen ongeveer om de 5 min in de loop van de jacht. Als alternatief, gist celsuspensieB kan in een continu roeren waterbad gedurende de duur van de cycloheximide chase experiment gehandhaafd.
  6. Wanneer alle monsters zijn verzameld, pellet cellen verzameld door centrifugeren bij 6500 xg bij kamertemperatuur gedurende 30 sec. Verwijder de bovenstaande vloeistof door pipetteren of aspiratie. De cellen zijn nu klaar voor alkaline lysis. Alternatief snap-freeze gepelleteerde cellen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.

3. Post-alkaline Protein Extraction (Gewijzigd van 16,40)

  1. Voeg 100 ul gedestilleerd water aan elk celpellet. Resuspendeer door en neer te pipetteren of vortexen.
  2. Voeg 100 ul van 0,2 M NaOH aan elk monster. Meng door en neer te pipetteren of vortexen.
  3. Incubeer gesuspendeerde cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 min. In dit stadium hebben gistcellen niet zijn gelyseerd, en eiwitten zijn niet vrijgegeven 40.
  4. Pellet cellen door centrifugeren bij 18.000 xg bij kamertemperatuur temperARD voor 30 sec. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
  5. Te lyseren, voeg 100 pl Laemmli monsterbuffer aan elke celpellet. Resuspendeer door en neer te pipetteren of vortexen.
    OPMERKING: Sequentiële incubatie van cellen met NaOH en Laemmli monsterbuffer releases eiwitten in een vorm geschikt voor natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) onder toepassing van een Tris-glycine-loopbuffer systeem.
  6. Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten om volledig eiwitten denatureren.
    OPMERKING: Incubatie bij 95 ° C niet geschikt voor de analyse van eiwitten die gevoelig zijn voor aggregatie (bijvoorbeeld, eiwitten met meerdere transmembraan segmenten). Deze eiwitten kunnen onoplosbare worden wanneer geïncubeerd bij 41 verhoogde temperaturen. Dus voor de analyse van dergelijke eiwitten, lysaten worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld 37 ° C - 70 ° C) gedurende 10 - 30 min, zoals empirisch.
  7. Centrifuge lysaten bij 18.000 xg bij roOM gedurende 1 min om onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Het supernatans (oplosbaar geëxtraheerd eiwit) is gereed voor scheiding door SDS-PAGE en daaropvolgende Western-blot analyse. Als alternatief, opslag lysaten bij -20 ° C.

4. Representatieve SDS-PAGE en Western Blotting Procedure (Aangepast van 16)

  1. Load eiwitstandaarden molecuulgewicht en empirisch bepaalde hoeveelheid lysaten op een SDS-PAGE gel.
    OPMERKING: Kies het percentage acrylamide en bis-acrylamide in de SDS-PAGE gel op basis van het molecuulgewicht van het beoogde eiwit. Doorgaans lagere percentage gels zijn beter geschikt voor het oplossen hogere hoogmoleculaire eiwitten.
  2. Run gel bij 200 V totdat de kleurstof voorkant heeft de onderkant van de gel bereikte.
  3. Transfer eiwitten uit de gel polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan door natte overdracht bij 20 V gedurende 60-90 min bij 4 ° C.
  4. Blok membraan door incuberen in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 5% magere melk, schommelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 ° C overnacht.
    OPMERKING: microbiële groei in de aanwezigheid van een membraan overnacht geïncubeerd voorkomen, wordt aanbevolen om natriumazide in de blokkerende oplossing omvat bij een uiteindelijke concentratie van 0,02%.
  5. Incubeer het membraan met primaire antilichaam specifiek voor eiwit van interesse in TBS met 0,1% Tween-20 (TBS / T) en 1% magere melk, schommelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  6. Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen.
  7. Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam in TBS / T met 1% magere melk bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, schommelen.
    LET OP: fluoroforen lichtgevoelig. Derhalve verdunningen van antilichamen geconjugeerd met fluoroforen worden bereid in het donker en incubatie van membranen bij aanwezigheid van antilichamen geconjugeerd met fluoroforen en daaropvolgende wasstappen optreedt in lichtdichte (bijvoorbeeld in folie verpakte) containers.
  8. Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen.
  9. Afbeelding membraan met behulp van LI-COR Odyssey CLX en beeld Studio-software (of vergelijkbare imaging apparatuur en software), naar aanleiding van aanbevelingen van de fabrikant.
  10. Nabeeld membraan verkrijgen Incubeer het membraan met een primair antilichaam specifiek voor een beladingscontrole eiwit in TBS / T met 1% magere melk bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, schommelen.
  11. Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen.
  12. Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam in TBS / T met 1% magere melk bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, schommelen.
  13. Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen.
  14. Beeld Membraan voor stap 4,9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om cycloheximide chase methoden illustreren de stabiliteit van -Sec62 ° 1 (figuur 1), een model gist endoplasmatisch reticulum (ER) geassocieerde afbraak (ERAD) substraat werd geanalyseerd 42-44. In ERAD, kwaliteitscontrole ubiquitine ligase enzymen covalent hechten ketens van het klein eiwit ubiquitine tot afwijkende eiwitten gelokaliseerd in het ER membraan. Dergelijke polyubiquitylated eiwitten worden vervolgens verwijderd uit het ER en afgebroken ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit artikel wordt een methode voor het analyseren van eiwitafbraak kinetiek gepresenteerd. Deze techniek kan gemakkelijk worden toegepast op een reeks van proteïnen gedegradeerd door verschillende mechanismen. Het is belangrijk op te merken dat cycloheximide chase experimenten rapporteren afbraakkinetiek van de steady state pool van een bepaald eiwit. Andere technieken kunnen worden gebruikt om de afbraak kinetiek van specifieke populaties van eiwitten te analyseren. Zo kan bijvoorbeeld de afbrekende lot van ontluike...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de huidige en voormalige leden van het Rubenstein-lab voor het bieden van een ondersteunende en enthousiaste onderzoeksomgeving. De auteurs danken Mark Hochstrasser (Yale University) voor het delen van reagentia en expertise. E.M.R. bedankt Stefan Kreft (University of Konstanz) en Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) voor het delen van onschatbare expertise in kinetische analyse van eiwitten. Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health-subsidie (R15 GM111713) aan E.M.R., een Ball State University ASPiRE-onderzoeksbeurs aan E.M.R, een onderzoeksbeurs van de Ball State University-afdeling van Sigma Xi aan S.M.E., en fondsen van het Ball State University Provost's Office en het Department of Biology.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gewensen giststammen, plasmiden, standaardmedium en buffercomponenten
Weggeef borosilicaat glasbuizenFisher Scientific14-961-32Beschikbaar bij verschillende fabrikanten
Temperatuurgeregelde incubator (bv Heratherm Incubator Model IMH180)Dot Scientific51028068Beschikbaar bij verschillende fabrikanten
New Brunswick verwisselbare trommel voor 18 mm buizen (buisrol)New BrunswickM1053-0450Een buisrol wordt aanbevolen om overnacht starters van gistcellen in suspensie te houden. Als een buisrol niet beschikbaar is, kan een platform shaker in een temperatuurgestuurde incubator worden gebruikt voor overnacht starters. Een platform shaker of buisrol kan worden gebruikt om grotere culturen in suspensie te houden.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004Voor gebruik met buisrol
SmartSpec Plus SpectrofotometerBio-Rad170-2525Beschikbaar bij verschillende fabrikanten
Centrifuge 5430Eppendorf5427 000.216 Rotor die met het apparaat wordt verkocht, past 1,5 en 2,0 ml microcentrifugebuizen. Rotor kan worden vervangen door een die 15 en 50 ml kegelbuizen bevat
Vaste hoekrotor F-35-6-30 met deksel en adapters voor centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml kegelbuizen, 6-plaatsEppendorfF-35-6-30
15-ml schermdruk schroefdopbuis 17 x 20 mm kegelvormig, polypropyleenSarstedt62.554.205Beschikbaar bij verschillende fabrikanten
1,5-ml flex-buis, PCR-schoon, natuurlijke microcentrifugebuizenEppendorf22364120Beschikbaar bij verschillende fabrikanten
Analoge Dri-Bath VerwarmersFisher Scientific1172011AQHet wordt aanbevolen dat twee verwarmers beschikbaar zijn (een voor het incuberen van cellen tijdens cycloheximidebehandeling en een voor het koken van lysaten om eiwitten te denatureren). Als alternatief kan een waterbad van 30 °C worden gebruikt voor het incuberen van cellen in aanwezigheid van cycloheximide. Een kokend waterbad met hot plate kan als alternatief worden gebruikt om eiwitten te denatureren.
Verwarmingsblok voor 12 x 15 ml kegelbuizenFisher Scientific11-473-70Voor gebruik met Dri-Bath Heater tijdens het incuberen van cellen in aanwezigheid van cycloheximide.
Verwarmingsblok voor 20 x 1,5 ml kegelbuizenFisher Scientific11-718-9QVoor gebruik met Dri-Bath Heater om lysaten te koken voor eiwitdenaturatie.
SDS-PAGE-apparaten voor draaien en overbrengen, voedingen en beeldvormingsapparatuur of donkere kamers voor SDS-PAGE en overbrengen naar membraanWisselt per lab en toepassing
Western blot beeldvormingssysteem (bv Li-Cor Odyssey CLx scanner en Image Studio Software)Li-Cor9140-01Wisselt per lab en toepassing
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranenFisher ScientificIPFL00010Wisselt per lab en toepassing
Primaire antilichamen (bv Fosfoglyceraat Kinase (Pgk1) Monoklonaal antilichaam, muis (klon 22C5D8))Life Technologies459250Wisselt per lab en toepassing
Secundaire antilichamen (bv Alexa-Fluor 680 Konijn Anti-Muis IgG (H + L))Life TechnologiesA-21065Wisselt per lab en toepassing

Referenties

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11(2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428(2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021(2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Western blot analyseinhibitie van eiwitsyntheselyse van gistcellenSDS PAGE scheidinganalyse van genetische vereistenstudie naar omgevingsfactorenpopulatie in steady state
Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.