Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen

Samenvatting

Het doel van dit protocol is de isolatie en kweektechnieken van murine primaire vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van de coronaire circulatie demonstreren. Zodra VSMC's werden geïsoleerd, kunnen ze worden gebruikt voor vele standaard kweektechnieken.

Samenvatting

Terwijl de isolatie en kweek van vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van grote recipiënten inmiddels goed, zochten wij isoleren en kweken van VSMC's de coronaire circulatie. Harten met intacte aorta bogen werden verwijderd en geperfuseerd via retrograde Langendorff spijsvertering oplossing die 300 eenheden / ml collagenase type II, 0,1 mg / ml sojaboon-trypsineremmer en 1 M _CaCl2. De perfusates werden verzameld bij 15 minuten intervallen gedurende 90 min, tot pellet gecentrifugeerd, geresuspendeerd in uitplaatmedia en geplaat op weefselkweekplaten. VSMC's werden gekenmerkt door de aanwezigheid van SM22α, α-SMA en vimentine. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is de mogelijkheid om VSMC isoleren van de coronaire circulatie van muizen. Hoewel het kleine aantal cellen verkregen kunnen sommige van de toepassingen waarvoor de cellen kan worden gebruikt te beperken, kan geïsoleerd coronaire VSMC's worden gebruikt in een verscheidenheid aan goed gevestigde celkweektechnieken en ASSAys. Studies die VSMC's van genetisch gemodificeerde muizen kan verdere informatie over de structuur-functie en signalering processen die verband houden met vasculaire pathologieën te bieden.

Inleiding

Het doel van deze methode is het vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van de muizen coronaire circulatie te isoleren voor gebruik in celkweek en standaard celkweek assays. We ontwikkelden deze techniek om de moleculaire mechanismen van vasculaire remodellering bij diabetes beoordelen. We hebben eerder gemeld naar binnen hypertrofische remodeling in het septum coronaire arteriolen in de db / db muismodel van diabetes ^1. Vanwege de beperkte hoeveelheid weefsel in de muis septale kransslagaders standaard experimentele technieken onderzoeken eiwit veranderingen (bijvoorbeeld western blot) in db / db muizen en controlemuizen zijn best moeilijk. Bovendien hebben we eerder aangetoond dat de angiotensine receptor blokker (ARB) losartan vermindert de herinrichting waargenomen bij db / db muizen ^2. Daarom, isolatie van de primaire VSMC's van de coronaire circulatie stelt ons in staat om verder te onderzoeken veranderingen in VSMC fenotype of geactiveerde signaalwegen in diabetische muizen, die contribu kan zijniten op nadelige coronaire arteriole remodeling.

Talrijke studies hebben canonieke signaalwegen met behulp van VSMC's geïsoleerd van knaagdieren aorta, toegelicht in plaats van in elke specifieke vasculaire bed. Wij hebben echter aangetoond vasculaire bed specifieke remodeling in coronaire aorta en mesenterische circulatie van db / db-muizen ^1, suggereert de VSMC's in elk vaatbed kunnen verschillen. Daarom is het noodzakelijk om VSMC van elkaar vaatbed isoleren teneinde beter de pathologische veranderingen in elke set VSMC. Er zijn een groot aantal verschillende methoden voor het isoleren en kweken van aorta VSMCs. Echter, nu is er slechts één studie die op de isolatie van VSMC's van de muis coronaire circulatie ³ is gepubliceerd. Teng et al. als eerste een werkwijze voor het isoleren rapporteren van VSMC's de muis coronaire circulatie; Maar we hebben het protocol ingrijpend gewijzigd omdat ze ook geïsoleerde endotheliale cells. Andere labs hebben ook gebruik gemaakt van het protocol van Teng et al. Coronaire arteriële myocyten en luchtwegen spiercellen ^4,5 gladde isoleren. De veranderingen die we hebben opgenomen zullen een populatie cellen sterk verrijkt voor VSMC's van de coronaire circulatie verkregen.

De retrograde perfusie van de geïsoleerde zoogdieren hart, of Langendorff techniek, werd opgericht in 1897 ⁶ van Oscar Langendorff en wordt nog steeds veel gebruikt vandaag de dag voor de isolatie van cardiovasculaire cellen. De techniek die hier, in combinatie met de vooruitgang van de moderne murine genetische modificaties, een waardevol instrument voor nader onderzoek van de moleculaire gedrag van VSMC's van de coronaire circulatie.

Protocol

Ethiek Verklaring: Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen, en het werd door de instelling Animal Care en gebruik Comite op Nationwide Children's Hospital goedgekeurd.

1. Voorbereiding / Instellen

Opmerking: Deze isolatie techniek vereist twee Langendorff verwarmingselementen gepositioneerd naast elkaar op een ring stand en parallel aan een circulerend waterbad.

1. Schakel circulerend waterbad en temperatuur regelen tot een uiteindelijke temperatuur van 33-34 ° C bereikt aan het uiteinde van de canule Langendorff (het waterbad in deze klaar is ingesteld op 40 ° C door een 6-7 ° C verlies in temperatuur over tubing). Schakel de perfusie pompen en stel perfusiesnelheid op 0,5 ml / min.
   1. Reinigen door spoelen elk met 50 ml 70% ethanol, gevolgd door 100 ml van geautoclaveerd ultrazuiver water beide watermantel verwarmingsspiralen, verbonden slangen en 25 gauge canule.
   2. Schakel de verwarmingselementendoor op lucht met een spuit en wassen met 10 ml Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) zonder fenolrood. Laat HBSS in de verwarmingselementen en slangen.
   3. Bevestig een steriele 10 ml luerlockspuit gevuld met kamertemperatuur HBSS zonder fenolrood om de slang. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden opgesloten in de buizen en verwarmingselementen bij het bevestigen van de HBSS spuit als deze lucht embolie tijdens de spijsvertering kunnen leiden tot een negatieve invloed hebben op de VSMC isolement.
2. Verwijder de 25 gauge canule van de verwarmingsspiralen en plaats op een steriele 10 ml injectiespuit gevuld met ijskoude HBSS zonder fenolrood. Houd dit op ijs pas klaar voor gebruik. Herhaal dit voor de andere canule.
3. Bereid enzymdigestie Solution.
   1. Weeg collagenase type 2 volgens specifieke lotnummer van 75 ml ontsluitingsoplossing tot een eindconcentratie van 300 eenheden / ml te bereiken.
   2. Collagenase lossen in 75 ml HBSS met fenolrood. Voeg vervolgens 1,5 ml 00,1 mg / ml sojaboon trypsine remmer en 75 gl 1 M CaCl ₂ aan het mengsel.
4. Bij gebruik van de vertering oplossing onmiddellijk, warm het tot 37 ° C. Zo niet, plaats het bij 4 ° C gedurende maximaal 6 uur. Deze oplossing moet dagelijks vers worden gemaakt.
5. Bereid de stop oplossing / plating media.
   1. Voeg 100 ml door warmte geïnactiveerd FBS, 5 ml L-glutamine, 5 ml van niet-essentiële aminozuren, 5 ml HEPES en 1 ml tot 500 ml primocin hoge glucose (4,5 g / l) DMEM. Filtersterilisatie aanbevolen.
   2. Aliquot 6 ml stopoplossing in elk twaalf 15 ml conische buizen, genummerd A1-A6 en B1-B6 en plaats bij 4 ° C. Aliquot 50 ml stop-oplossing in een 50 ml conische en plaats in 37 ° C incubator.
      Opmerking: Deze stap kan ook de dag voor elk afzonderlijk worden bereid indien nodig. Deze stopoplossing wordt gebruikt als de beplating media volgens celisolatie.
6. Bereid twee 1 ml injectiespuiten uitgerust met een 30 G naaldmet 100 ul heparine (1000 eenheden / ml).
7. Snijd een 5 cm stuk 5-0 chirurgische zijde. Bind een losse halve knoop in de chirurgische zijde met een uiteinde dubbel zo lang als de andere. Plaats op de 25-gauge canule, maar niet vast. Herhaal dit voor de overige 25 G canule.
8. Vult vier 35 mm steriele Petrischalen (# 1-4) met 2 ml steriele, ijskoude, HBSS zonder fenolrood. Houd op het ijs.

2. Euthanasie, Hart Isolatie en Canulatie

1. Voordat hart isolatie, ervoor te zorgen dat de vertering oplossing en 50 ml conische stop oplossing zijn warm. Verwijder de HBSS-injectiespuit met bevestigde 25 G canule uit het ijs en plaats in een buret klem (of ring stand klem) op een ring staan.
2. Verdoven muizen met behulp van 3% isofluorane. Controleer of de muis wordt verdoofd door een teen te raken op elke achterste ledematen. Als het been krampen, is de muis nog niet verdoofd dus wacht 1 min en herhaal de teen touch.
3. Expose de halsader door het verwijderen van de vacht van eennd huid op de voorste van de hals met een schaar. Next, een tang om het vet rond de halsslagader zorgvuldig te verwijderen. Na het verwijderen van vet langzaam injecteer 100 ul heparine (1000 eenheden / ml). Plaats een chirurgische spons over de ader aan overmatig bloeden te voorkomen.
4. Na 1 min, open kist aan het hart, lift hart bloot te leggen met gebogen pincet en accijnzen met behulp van een schaar, en zorg ervoor dat de opgaande aorta intact door de eerste brachiocephalic tak houden. Onmiddellijk plaats hart in een 35 mm schaal (# 1) met ijskoud HBSS zonder fenolrood en spoel.
   Opmerking: Voer de volgende 4 stappen met behulp van een dissectie scope.
5. Plaats de canule 25 G dat op de ring is gemonteerd staan ​​op een 45 ° hoek, zodat de punt zich net onder het oppervlak van ijskoude HBSS in schotel # 2 en is duidelijk zichtbaar door de stereomicroscoop. Transfer het hart om schotel # 2.
6. Met behulp van Dumont tang, bloot de aorta door voorzichtig verwijderen van overtollige vet via stompe dissectie pRevent doorprikkende of scheuren van de aorta. Next, een tang om de aorta over de 25 G canule schuiven.
7. Gids canule omlaag door de aorta, dicht bij, maar niet voorbij de aortaklep, die de integriteit van de klep beschadigen en derhalve de retrograde perfusie. Zodra de canule op zijn plaats, schuif de pre-gebonden zijde over de aorta, en draai. Bind een tweede knoop om een ​​platte knoop rond de aorta te vormen naar het hart te beveiligen.
8. Zodra de aorta stevig gebonden voorzichtig spoelen de resterende bloed van de coronaire circulatie met ijskoude HBSS in de spuit bevestigd aan de canule 25 G. Zorg ervoor dat niet te veel druk om overmatige coronaire druk te voorkomen. Slechts een zeer langzaam en zacht spoelen nodig om de flush. Lekvrije aorta canule kan ook tijdens deze zachte flush in acht worden genomen.
9. Schakel de perfusie pomp om de stroom van HBSS beginnen. Verwijder de 25 G canule (met het hart in bijlage) uit de HBSS spuit, en zorg ervoorhouden de canule hub gevuld met HBSS, en sluit deze aan op de warme HBSS gevulde verwarmingselementen. Beginnen perfusie van het hart met de perfusie pomp met een snelheid van 0,5 ml / min gedurende 8 minuten.
10. Na de eerste hart is een canule en wordt doorbloed op het systeem, herhaalt u stap 2,1-2,8 voor de tweede hart. Deze isolatie zal worden gespreid voor elk hart dan ook een zorgvuldige planning en timing vereist.

3. Spijsvertering

1. Na spoelen met HBSS, veranderen de 10 ml HBSS spuit momenteel op de pomp één gevuld met 10 ml voorverwarmde digestieoplossing. Perfuseren elk hart met de spijsvertering oplossing gedurende 12 minuten bij een snelheid van 0,5 ml / min. Heeft fracties die voortvloeien uit deze eerste spijsvertering verzamelen aangezien dit een spoor van bloed en endotheelcellen zal bevatten.
2. Na 12 min, veranderen de perfusiesnelheid tot 0,4 ml / min, plaats een 15 ml conische (tube A1 of B1, overeenkomend met de eerste of tweede hart per digestie) gevuld met eindstop solution in een ijsemmer onder het hart om-VSMC verrijkte perfusaat collectie te beginnen.
3. Na 15 min, veranderen de collectie conische aan de buis A2 en B2 en spin-conische buis A1 en B1 op 89 xg gedurende 10 minuten onmiddellijk na het verzamelen van beide fracties. Als de spuit gevuld met de verteringsoplossing van de pomp minder dan 1 ml oplossing, vervangen door een vers gevulde 10 ml spuit van ontsluitingsoplossing.
4. Na het centrifugeren, aspireren supernatant uit elke collectie buis, waardoor ongeveer 0,5 ml. Resuspendeer pellet van A1 met 2 ml warm stopoplossing (of uitplaatmedia). resuspensie toevoegen van A1 buis B1 buis en plaats de buis in 37 ° C incubator met de dop los.
5. Herhaal de stappen 3,3 en 3,4 totdat alle buizen (via A6 en B6) worden gebruikt voor een totale verzameling van 90 min. Op 80 min van de spijsvertering, opengesneden het hart apex te spoelen alle cellen die kunnen worden opgesloten in de hartkamer en het verzamelen van deze cellen in buis A6 en B6, respectively.
   Opmerking: Af en toe zal het hart van de canule voorafgaand aan de 90 min tijdstip vallen. Als dit gebeurt, halen het hart en de plaats in een steriele 35 mm petrischaal gevuld met 2 ml van de spijsvertering oplossing. Snijd de apex van het hart en voorzichtig spoel het hart bij de spijsvertering oplossing. Vervolgens filter instellen voor het 2 ml van de spijsvertering oplossing door een steriel 100 urn cel zeef in een 50 ml conische en toe te voegen aan de buis A6 of B6.
6. Na elke spin van de latere buizen (A2 en B2), voeg de geresuspendeerde VSMC's van de vorige collectie buis (gecombineerde A1 en B1). Ook, zorg niet te laten de vertering oplossing in de pomp leeg en zet de 10 ml spuiten naar behoefte in de spijsvertering.
7. Nadat alle buizen zijn samengevoegd, gecentrifugeerd VSMC-rijke suspensie bij 89 xg gedurende 10 min.
8. Zuig zoveel supernatant uit de collectie van buizen mogelijk te maken. Resuspendeer de resterende pellet in 2 ml uitplaatmedia en plaat op een 35 mm kweekschaal. Plaats cultuur schotel in 37 ° C incubator gedurende 24 uur.

4. Cell Culture

Opmerking: Voer de overige stappen in de bioveiligheid kast.

1. Na 24 uur voorzichtig zuigen de beplating media. De kweek zal normaal een grote hoeveelheid afval. Om de cellen te wassen, voeg 2 ml warm, steriele PBS en klop het gerecht tegen twee vingers tijdens het draaien met de klok mee.
2. Na het draaien van 360 °, zuig het PBS en herhaal voor de tweede keer. Zuig het PBS en voeg nog eens 2 ml van steriele, warme PBS. Controleer de cultuur schotel onder de microscoop om ervoor te zorgen dat er weinig tot geen vuil op de plaat. Celconfluentie kan ook worden bepaald op dit moment.
3. Als er stof in de cultuur schotel blijft, herhaalt u stap 4.2. Als de cultuur gerecht is vrij van puin, zuig het PBS en voeg 2 ml warm plating media.
4. Na 24 uur werd opnieuw was de cellen met warme, steriele PBS tot een definitief vuil of dode cellen uit de kweek te verwijderen. Zuig het PBS en pkant nog eens 2 ml warm plating media op de cellen.
5. Controleer op de cellen elke dag en voeden om de 48 uur met verse opgewarmd plating media. Op dit moment kunnen cellen worden gebruikt voor standaard celkweek assays. VSMC's moet ongeveer 80% confluent 4-5 dagen na plating, maar kan tot 7 dagen tot de procedure wordt geperfectioneerd. Als splitsen latere passages Gebruik maximaal 1: 4 35 mm schalen (of een vergelijkbaar gebied van kweekschalen).

Resultaten

Door de nieuw aspect van onze coronaire VSMC isolatietechniek wilden we de zuiverheid van de celisolatie bepalen. Muis coronaire VSMC's werden geïdentificeerd op basis van hun morfologie en immunofluorescentie kleuring tot passage 2. Op basis van de morfologie van de cellen in kweek na de eerste wasbeurt, de isolatieprocedure verwijdert effectief hartspiercellen en endotheliale cellen. De VSMC's behouden hun morfologie tot passage 2 (figuur 1). Er is echter een m...

Discussie

Het doel van deze studie was om bestaande celisolatie protocollen aan te passen aan de opbrengst van coronaire gladde van muizen harten verhogen. Meeste pionierswerk in het gladde spierweefsel biologie werd uitgevoerd met gekweekte ratten aorta gladde spiercellen. Deze studies voorzien fundamentele kennis van de moleculaire mechanismen die VSMC groei, migratie en hypertrofie ⁷ te controleren. Aangezien het gebied vorderde, bleek dat VSMC fenotype en functie werd gecontroleerd door een aantal factoren vaatbed....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fetaal bovien serum	Life Technologies	16140-071
HEPES 1 M oplossing	Fisher	MT-25-060
Primocin - 20 ml	Invivogen	ant-pm-2
DMEM (Hoge Glucose, Sodium Pyruvaat, L-Glutamine)	Life Technologies	11995-065
MEM NEAA 10 mM 100x	Life Technologies	11140-050
L-Glut 200 mM - Gibco	Life Technologies	25030-081
Steriele celzeef 100 µm nylon gaas	Fisher	22363549
Nunclon Polystrene schaal met deksel, sterieel, 35 mm	Fisher	12-565-91
Harvard Apparatus zwarte zijden hechtdraad 5-0	Fisher	14-516-124
Collagenase Type-2	Worthington Biochemical	LS004176
Sojaboon Trypsine Remmer 25 mg	Sigma	T6522
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), vloeibaar (helder)	Life Technologies	14175-103
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), vloeibaar (fenol rood)	Life Technologies	14170-161
5.0 ml verwarmingsspiraal met ontgassingsbeltrap	Radnoti	158830
11 plus pomp	Harvard Apparatus	70-2208
Circulerende verwarmde waterpomp			elke merk zal werken