Sequentiële Toepassing van dekglaasjes naar de Samenpersende stijfheid van de Muis Lens Assess: Strain en Morfometrische Analyses

Samenvatting

Leeftijdsgerelateerde toenames in de stijfheid van het ooglens zijn gekoppeld aan presbyopie. Dit protocol beschrijft een eenvoudige, kosteneffectieve methode voor het meten van de stijfheid van muizenlenzen. Muizenlenzen worden, net als menselijke lenzen, stijver met de leeftijd. Deze methode is nauwkeurig en kan worden aangepast voor lenzen van grotere dieren.

Samenvatting

De ooglens is een transparante orgaan dat breekt en richt zich licht om een ​​helder beeld op het netvlies te vormen. Bij mensen ciliaire spieren opdracht aan de lens vervormen, wat leidt tot een toename in optische sterkte van de lens te focussen op nabije objecten, een proces dat bekend staat als accommodatie. Leeftijd-gerelateerde veranderingen in lens stijfheid zijn gekoppeld aan presbyopie, een vermindering van de lens vermogen tot accommoderen, en daarmee de noodzaak van een leesbril. Hoewel de muis lenzen niet geschikt of te ontwikkelen presbyopie, kan muismodellen een waardevol hulpmiddel voor genetische begrip lens pathologieën te bieden, en de versnelde veroudering waargenomen in muizen maakt de studie van aan leeftijd gerelateerde veranderingen in de lens. Dit protocol toont op een eenvoudige, nauwkeurige en rendabele werkwijze voor het bepalen muis lens stijfheid, middels dekglaasjes sequentieel toenemende toepassing drukkrachten op de lens. Representatieve gegevens bevestigen dat de muis lenzen worden stijver met de leeftijd, zoalsmenselijke lenzen. Deze werkwijze is sterk reproduceerbaar en kan mogelijk worden opgeschaald naar onderzoekslenzen van mechanisch op grotere dieren.

Inleiding

De lens is een transparant en avasculair orgaan in de voorste kamer van het oog dat verantwoordelijk is voor het fijn afstellen van licht op het netvlies. Een heldere basementmembraan, de lenscapsule genaamd, omringt een massa langwerpige vezelcellen die bedekt zijn met een voorste monolaag van epitheelcellen^1,2. Levenslange groei van de lens is afhankelijk van de voortdurende proliferatie en differentiatie van epitheelcellen aan de lensequator tot nieuwe vezelcellen die in een concentrische wijze worden toegevoegd aan eerdere generaties vezelcellen². Na verloop van tijd ondergaan lensvezelcellen compactie, wat resulteert in een stijve kern in het midden van de lens, de kern genaamd¹. Accommodatie, gedefinieerd als een dioptrische verandering in de optische kracht van het oog, vindt bij mensen plaats wanneer de ciliaire spieren samentrekken om de lens te vervormen en een echte toename van de optische kracht mogelijk te maken om op nabije objecten te scherpstellen^3-5. In het niet-geaccommodeerde oog wordt de lens in een relatief afgeplatte staat gehouden door de spanning van de zonulare vezels. Wanneer de ciliaire spieren samentrekken, wordt de spanning op de lens vrijgegeven, wat leidt tot een verminderde equatoriale diameter van de lens en een toegenomen axiale dikte. Leeftijdsgerelateerde veranderingen in de lens veroorzaken presbyopie, een progressieve verlies van lensaccommodatie, wat leidt tot de behoefte aan leesbrillen.

Verschillende onderzoeken hebben presbyopie gekoppeld aan leeftijdsgerelateerde toename van de intrinsieke stijfheid van de lens^6-11. Stijfheid wordt gedefinieerd als de weerstand van een elastisch object om te vervormen onder toegepaste belasting. Er zijn verschillende methoden gebruikt om de stijfheid van menselijke lenzen te onderzoeken, waaronder spincompressie^12-14, actuatorcompressie¹⁵, sonde-indentatie¹⁶, dynamische mechanische analyse ^6,10 en op blaasjes gebaseerde akoestische stralingskracht¹⁷. Hoewel muizenlenzen niet accommoderen of presbyopie ontwikkelen, zijn muizenmodellen voor lenspathologieën waardevolle hulpmiddelen omdat muizen goedkoper zijn dan grotere dieren, genetisch goed gekarakteriseerd zijn en versnelde leeftijdsgerelateerde veranderingen ondergaan als gevolg van snel verouderen. Een aantal onderzoeken hebben de stijfheid van muizenlenzen onderzocht met compressiemethoden en veranderingen in lensstijfheid aangetoond als gevolg van veroudering of gerichte genetische verstoringen^18-21. Muizenlenzen zijn dus goede modellen voor het bestuderen van leeftijdsgerelateerde veranderingen in lensstijfheid.

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope, maar nauwkeurige en reproduceerbare, compressiemethode voor het bepalen van de stijfheid van muizenlenzen op basis van het aanbrengen van glazen dekglasjes op de lens in combinatie met het fotograferen van de lens door een dissectiemicroscoop en spiegel. Deze methode levert robuuste spannings- en morfometrische gegevens op met een eenvoudig te fabriceren en te assembleren apparaat. De representatieve resultaten bevestigen dat muizenlenzen met de leeftijd toenemen in stijfheid.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren door de National Institutes of Health en onder een goedgekeurd protocol door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op het Scripps Research Institute.

1. Lens Dissection

1. Euthanaseren muizen volgens de aanbevelingen in de National Institutes of Health "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren" en erkende instelling dier gebruik protocollen.
2. Ophelderen het oog van muizen met behulp van gebogen pincet. Druk het weefsel rond het oog met de tang voor het oog uit het stopcontact te brengen, en dan plukken het oog uit het stopcontact met de tang. Transfer ogen frisse 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in dissectie schotel.
3. Snijd de oogzenuw zo dicht mogelijk bij de oogbol mogelijk. Zachtjes en voorzichtig steek Fijn recht pincet in de oogbol door het gat where de oogzenuw verlaat het achterste.
4. maak zorgvuldig een incisie met een schaar in de oogbol van de achterste naar de rand van de cornea. Knaagdier lenzen bezetten ~ 30% van het oog. Maak deze incisies zorgvuldig, en gebruik niet pincet of een schaar te diep in het oog om te voorkomen dat schade aan de lens.
5. Knip langs de kruising tussen het hoornvlies en sclera ten minste de helft weg in de oogbol.
6. Duw op het hoornvlies om de lens uit het oog verwijderd door de opening in stappen 1,4 en 1,5.
7. Gebruik fijne punt rechtdoor tang om zorgvuldig verwijder alle grote puin dat nog steeds is aangesloten op de lens. Inspecteer de lens voor schade alvorens tot de stijfheid metingen.

2. stijfheidsmetingen

1. Weegt ten minste 10 dekglaasjes vanuit hetzelfde vak met een analytische balans. Wordt het gemiddelde gewicht van de dekglaasjes. Voor consistentie, maken gebruik van dezelfde doos van dekglaasjes voor alle experimenten. Pre-natde dekglaasjes en haakse spiegel in 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur voordat experimenten.
2. Vul de meetkamer (zie figuur 1) met 65-75 ml 1x PBS. De meetkamer werd uit plexiglas gemaakt door een in-house machine winkel, en divots in de kamer werden gemaakt door een kolomboormachine ingesteld op de gewenste diepte met een geschikte boor. Lenzen transparant blijven in 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende de duur van de mechanische testen.

Figuur 1:. Stijfheid meetkamer Een foto die de afmetingen van de op maat gemaakte stijfheid meetkamer met verschillende uitsparingen van verschillende dieptes en vormen. De ronde uitsparingen die 200 urn of 300 urn diep (gele pijlpunten) worden gebruikt voor de metingen op muis lenzen. Divots zijn 2 mm in diameter en 13 ~-. 14 mm vanaf de rand van de kamer Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Plaats haakse spiegel in de kamer op een constante afstand van de graszode die wordt gebruikt om de lens te houden. Zorg ervoor dat de spiegel niet beweegt tijdens het experiment.
4. Transfer ontleed lenzen om meetkamer zorgvuldig met het grijpen van een tang of gebogen tang.
5. Maak een foto van de onbelaste lens bovenaanzicht rechtstreeks overhead. Neem de muis lens foto 30X vergroting met verlichting uit ontleden microscoop (bodem) en een fiber optic lichtbron aan de linker- en rechterkant. Stel de optische voeding 80% van de maximale lichtintensiteit. Pas de voeding uitgang op basis van omgevingslicht, voorkeur van de gebruiker en de beeldkwaliteit als dat nodig is.
6. Maak een foto zijaanzicht van de onbelaste lens, die kan worden gezien door de right-hoek spiegel. Als de camera niet is gekalibreerd, neem een ​​foto van de spiegel rand in focus. De spiegel rand 5 mm lang, en deze meting kan later worden gebruikt om de pixels / mm bepaald en dienen als een schaalbalk in de beelden.
7. Plaats lens in de graszode, en bevestigen dat de lens stevig en recht zit in de graszode. Maak een foto van de lens voor het laden. De lens moet rusten in de graszode op zijn voorste of achterste paal.
8. Plaats 1 dekglaasje zachtjes op de lens. Wacht 2 min te kruipen mogelijk te maken, en neem een ​​foto van de beladen lens zijaanzicht.
9. Blijven toevoegen dekglaasjes zoals in stap 2,8 en rekening zijaanzicht's na de toevoeging van elk dekglaasje als in stap 2,8 tot in totaal 10 dekglaasjes worden toegepast.
10. Verwijder alle dekglaasjes. Wacht 2 min, en neem een ​​foto van de lens (binnen en buiten de graszode) zijaanzicht na het verwijderen van alle dekglaasjes.

3. Lens Nucleus Measurement

1. om de toonhoogteine de lens kern grootte, verplaats de lens om een ​​schone petrischaal gevuld met 1x PBS.
2. Voorzichtig decapsulate de lens met behulp van fijne rechte tang.
3. Slough van de corticale fiber cellen door het rollen van de lens tussen gehandschoende vingers. De resterende lens nucleus zal voelen als een harde marmer. Gebruik deze procedure om de kern op volwassen lenzen te isoleren vanaf 1 maand oud. Aangezien de geïsoleerde kern een star lichaam, kunnen verdere mechanische testen van de lensnucleus niet worden uitgevoerd met deze beschreven methode.
4. Voorzichtig spoel de lens nucleus in 1x PBS in de petrischaal.
5. Plaats de lensnucleus terug in de meetkamer (niet in de graszode), en neemt een beeld van de lensnucleus via haakse spiegel.

Figuur 2:. Een muis Lenzen gecomprimeerd door Coverslips (A) Schematische en (B) een foto van de experimental opstelling met een 2-maanden oude muis lens in een 200-um-deep graszode in de meetkamer gevuld met 1x PBS. Een rechte hoek spiegel en een digitale camera gemonteerd op een dissectie microscoop werd gebruikt om beelden van de lens te verzamelen tijdens de compressie van dekglaasjes. (C) Foto's van de sagittale uitzicht op een 2-maanden-oude wild-type lens samengedrukt door achtereenvolgens toenemende aantallen dekglaasjes op voorwaarde dat de ruwe data voor het meten van axiale en equatoriale diameters en het berekenen van axiale en equatoriale stammen tijdens dekglaasje-gebaseerde compressie testen. Een reflectie van de lens soms door de dekglaasjes (het duidelijkst zichtbaar in het dekglaasje 1 in). Bij het maken van metingen, negeer de reflectie en meten met de top van de lens. (D) Foto's van de sagittale uitzicht op de 2-maanden oude wild-type lens post-compressie en de geïsoleerde lens kern. De post-compressie lens en geïsoleerde kern zitten buiten de graszode. Schaalbalken, 1 mm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Gokhin, et al. PLoS One, 2012 ^19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Beeldanalyse

1. Meet equatoriale en axiale diameters van lenzen vóór het laden en na elke lading stap met behulp van ImageJ of soortgelijke software. Meet de diameter van elk lensnucleus. De lens kern is bijna bolvormig zo een meting in elke richting kan worden volstaan ​​met ^19,21.
2. Corrigeer de lens axiale diameters door toevoeging van de diepte van de graszode gebruikt. In de meetkamer, de graszode bedekt 200 urn (2 maanden oude muizen lenzen) of 300 urn (4 maanden oud en 8 maanden oude muis lenzen) van de axiale dikte van de lens.
3. Bereken de axiale en equatoriale stammen van de lens diameter metingen met behulp van de vergelijking, ε = (d - d ₀₎ / d _0, waarbij ε stam, d de axiale of equatorial diameter bij een gegeven belasting, en d ₀ is de overeenkomstige axiale of equatoriale diameter bij nul belasting.
4. Plot de axiale en equatoriale stammen als functies van de opgelegde belasting (in mg).
5. Plot de axiale, equatoriale en nucleaire diameters. Bereken en plot van de lens aspect ratio met het verdelen van de axiale diameter door de equatoriale diameter.
6. Bereken en plot de lens volume met de vergelijking, volume = 4/3 π × × r _E ² × _A r, waarin r _E de equatoriale radius r _A de axiale straal gemeten vanaf het beeld dat in stap 2,6. Deze vergelijking neemt de lens een afgeplatte sferoïde (ellipsoïde) ^1,22.
7. Bereken en plot de nucleaire volume met de vergelijking, volume = 4/3 π × × r _N ^3, waarbij _Rn de straal van de lensnucleus gemeten vanaf het beeld dat in stap 3,5. Deze vergelijking veronderstelt de lensnucleus isa bol ^19,21.
8. Bereken en plot de nucleaire fractie als de verhouding van de nucleaire volume van de lens volume.

Resultaten

De stijfheid en de afmetingen van 2-, 4- en 8-maanden oude muizen lenzen werden gemeten. Muizen waren allemaal wild-type dieren op een zuivere C57BL6 stam achtergrond verkregen uit de TSRI Animal Breeding Facility, en elke lens was geladen met 1-10 dekglaasjes. De axiale en equatoriale stammen werden berekend als een functie van de toegepaste belasting door het meten van de axiale en equatoriale diameter van de lens na het toevoegen van elk dekglaasje en vervolgens normaliseren elke wijz...

Discussie

Er zijn een aantal belangrijke overwegingen bij het gebruik van deze methode om de lens stijfheid te meten. Eerst worden de dekglaasjes aangebracht op de lens op een enigszins schuine hoek (8-8,5 °) ten opzichte van de bodem van de kamer (θ). Dit zal een klein bestanddeel van de toepassing equatoriale plaats van axiaal. Echter, dit equatoriale belasting als verwaarloosbaar omdat sin θ ≈ 0,1 ^19. Wanneer deze methode wordt aangepast voor grotere lenzen, zou de hoek van de dekglaasjes naar de bodem van de kamer ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fine tip straight forceps	Fine Scientific Tools	11252-40
Microdissection scissors, straight edge	Fine Scientific Tools	15000-00
Curved forceps	Fine Scientific Tools	11272-40
Seizing forceps	Hammacher	HSC 702-93	Optioneel
Dissection dish	Fisher Scientific	12565154
60 mm Petri dish	Fisher Scientific	0875713A
1x phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	14190
18 x 18 mm glass coverslips	Fisher Scientific	12-542A
Measurement chamber with divots to hold lenses			Op maat gemaakt (zie Figuur 1)
Right-angle mirror	Edmund Optics	45-591
Light source	Schott/Fostec	8375
Illuminated dissecting microscope	Olympus	SZX-ILLD100	Met SZ-PT fotobuis
Digital camera	Nikon	Coolpix 990