Het begrijpen van het kwaadaardige gedrag van kanker vereist het creëren van nauwkeurige modellen van hoe tumorcellen interageren met componenten van de tumormicro-omgeving, zoals macrofagen. Hier beschrijven we twee methoden om de interactie van glioblastoomcellen met tumorgeassocieerde macrofagen en microglia te bestuderen, waarbij het effect op glioblastoominvasie wordt beoordeeld.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Glioblastoma multiforme (graad IV glioom) is een zeer agressieve kanker bij de mens, met een mediane overleving van 1 jaar na de diagnose. Ondanks de toegenomen kennis van de moleculaire gebeurtenissen die leiden tot glioblastoma ontstaat, kanker nog steeds zeer ongevoelig voor conventionele behandeling. Chirurgische resectie van hooggradige hersentumoren is zelden volledig te wijten aan de sterk infiltrative aard van glioblastoma cellen. Therapeutische benaderingen die glioblastoma cel invasie afzwakken is daarom een aantrekkelijke optie. Ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat de tumor-geassocieerde macrofagen en microglia (resident hersenen macrofagen) sterk stimuleren glioblastoma invasie. De in dit document beschreven protocol wordt gebruikt om te modelleren glioblastoma-macrofagen / microglia interactie met behulp van in vitro cultuur assays. Deze benadering kan de ontwikkeling en / of de ontdekking van geneesmiddelen die de communicatie met de macrofagen verstoren dat deze kwaadaardige Behav maakt veel gemakkelijkerIOR. 10-voudig - We hebben twee robuuste co-cultuur invasie assays, waar microglia / macrofagen stimuleren glioom cel invasie van 5 vastgesteld. Glioblastoma cellen gemerkt met een fluorescente merker of constitutief een fluorescerend eiwit tot expressie brengen worden uitgeplaat en zonder macrofagen / microglia on-bedekte matrix polycarbonaat kamer inzetstukken of ingebed in een driedimensionale matrix. Celinvasie wordt bepaald door fluorescentie microscopie aan te tellen alleen invasieve cellen aan de onderkant van het filter. Met behulp van deze assays, meerdere farmacologische remmers (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib en Semapimod), geïdentificeerd die macrofagen blokkeren / microglia gestimuleerd glioblastoma invasie.
Inleiding
Glioblastoma multiforme is een agressieve menselijke hersenen kanker met een mediane overleving van ongeveer 12 maanden na de diagnose 1,2. Glioblastoma is een van de meest dodelijke soorten kanker en klinisch uitdagend omdat het ongevoelig is voor standaard chemotherapie en chirurgische resectie. De diffuse aard van glioblastoma stelt tumorcellen verspreid over de normale hersenen die de geavanceerde tumor praktisch onmogelijk operatief resectie volledig. Deze zeer invasieve aspect is een kenmerk kenmerk van glioblastoma en andere geavanceerde astrocytomen. Daarom is de focus van veel onderzoek gedaan naar de moleculaire mechanisme van glioblastoma celinvasie. De glioblastoma tumor micro-omgeving speelt een belangrijke rol bij vaststelling van maligniteit 3-6. Tumor-geassocieerde macrofagen / microglia werden voor de bevordering van glioblastoma invasie 7,8 te zijn. De meeste van deze studies het effect van macrofagen / microglia echter gemeten middelstesten die ze van de glioblastoma cellen fysisch scheiden. Ons laboratorium heeft tot betere analyses die ons in staat om te bestuderen hoe glioblastoma invasie is afhankelijk van macrofagen / microglia in coculturen en stellen ons in staat om het beeld van de fysieke interactie tussen hen tijdens de invasie te genereren uiteengezet.
Classic assays voor het meten van cel invasie onder de "standaard" Boyden kamer chemotaxis en chemoinvasion formaten. Hier de cellen te bestuderen uitgeplaat in een plastic kamer die een polycarbonaat filter aan de achterkant die poriën van een bepaalde grootte (gewoonlijk tussen 0,4 en 8 uM in diameter) heeft bevat. Het proces van invasie omvat een fysieke barrière, gewoonlijk uit extracellulaire matrix eiwitten. In de chemoinvasion assay de voorkeur gebruikte matrix Matrigel (hierna "matrix"), een extracellulaire matrix eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizen sarcoma-cellen en bestaat grotendeels uit collagen type IV en laminine. De kamers worden dan geplaatst in een weefselkweek die goed celkweekmedia bevat met of zonder groeifactoren waarvan wordt vermoed dat invasie stimuleren. Cellen die een hogere invasiecapaciteit binnenvallen door de extracellulaire matrix bekleed filter met een hogere frequentie en zich aan de onderzijde van het filter hebben. We hebben deze assay gewijzigd om de rol van microglia en macrofagen op tumor geassocieerde glioblastoma celinvasie beoordelen.
10 voudige 9,10 - Wij hebben kunnen vaststellen middels co-cultuur assays beschreven in dit document dat microglia de invasie van twee glioblastoma cellijnen kunnen stimuleren door 5 geweest. Dit weerspiegelt wat wordt waargenomen in diermodellen van glioblastoma. Verder hebben we een driedimensionaal invasie assay waarbij de wisselwerking tussen glioblastoma cellen en macrofagen / microglia zijn directer onderzocht. De mate van glioblastoma celinvasie gestimuleerd door macrophages / microglia in het 3D assay is vergelijkbaar met wat gezien wordt met de bedekte matrix kamer benadering. Soortgelijke proeven werden eerder ontwikkeld om mammacarcinoom interacties met macrofagen tijdens invasie 11-13. Zowel in dit document beschreven werkwijzen moet de steun in het vermogen om het moleculaire mechanisme (s) van macrofagen / microglia-gestimuleerde invasie van glioblastoma cellen ontleden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Fluorescerende Labeling van Cellen
OPMERKING: Label glioblastoma cellijnen en microglia met fluorescerende kleurstoffen 9. Alternatief genereren cellijnen die constitutief fluorescerende eiwitten zoals GFP / RFP expressie zoals beschreven in 14.
- 80% confluent op dag van kleuring - plaat cellen op een 6 wells plaat zodanig dat ze 70 zijn. Voor de muizen glioblastoma cellijn GL261 en menselijke glioblastoma cellijn U87, plaat 1 x 10 6 en 1,5 x 10 6 cellen, respectievelijk op een 6 cm schaal 24 uur voor kleuring.
- Bereid fluorescerende cel vlek kleurstof oplossing in DMSO en voeg 5 uM kleurstof media, ofwel Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) of macrofaag serumvrij medium (MSFM), vortex goed.
- Incubeer cellen met kleurstof gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
- Verwijderen kleurstof bevattende media en voeg vers medium (RPMI of MSFM) aan de cellen.
- Incubeer cellen gedurende 30 min. Opmerking: Cellen nugekleurd en klaar voor gebruik in experimenten.
2. Pre-coated Matrix Kamer Coculture Invasion Assay
- Differentiëren THP-1-cellen met behulp forbolmyristaatacetaat (PMA) 15.
- Plate 2-3 x 10 5 THP-1 cellen in 1,5 ml RPMI / 10% FBS in een 6 putjes plaat. Direct na plating toevoegen 100 nM PMA en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
Opmerking: na 48 uur, THP-1-cellen die met succes hebben ondergaan differentiatie hechtende en verspreid naar de bodem van de put die op een ronde morfologie. - Verwijder PMA door eenmaal wassen met 1x PBS en te vervangen door vers RPMI / 10% FBS. Wacht nog 48 uur tot cellen zijn klaar voor gebruik in test.
- Plate 2-3 x 10 5 THP-1 cellen in 1,5 ml RPMI / 10% FBS in een 6 putjes plaat. Direct na plating toevoegen 100 nM PMA en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
- Evenwicht matrix voorbekleed kamers door ze in een putje met 500 pl medium alleen (zonder serum) en toevoegen van 500 pl medium alleen naar boven. Incubeer kamers voor 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
NB: Pre-coated kamers werden gekocht van de fabrikant; zie tabel of Materials / Equipment. - Om voorzichtig los cellen (fluorescent gelabeld glioblastoma cellijnen en de microglia / macrofagen), verwijder media uit cellen door aspiratie. Was de cellen op schotel met 2 mM EDTA / PBS. Voeg 500 ul van 2 mM EDTA / PBS en incubeer gedurende 5-10 minuten in een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Resuspendeer cellen in 5 ml medium bevattende 0,3% runderserumalbumine (BSA).
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 120 x g.
- Aspireren supernatant en resuspendeer pellet in MSFM / 0,3% BSA media (GL261 cellen en microglia) of RPMI / 0,3% BSA (voor U87 en THP-1 cellen) zodat de concentratie van cellen is gelijk aan 1 x 10 6 cellen / ml . Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen.
- Voeg 500 ul media / 0,3% BSA per putje van de plaat met 24 putjes.
- Verwijder media uit kamers die zijn geëquilibreerd gedurende ten minste 2 uur (stap 2,2). plaats chambers in putje met 500 ul media /% BSA 0.3 (stap 2.7).
- Als remmers worden gebruikt om hun effect op macrofagen bestuderen / microglia gestimuleerd glioom invasie, voeg de juiste concentratie zowel de onderste en bovenste gedeelten van de kamer.
LET OP: De concentraties van CSF-1R remmer gebruikt om microglia volledig remmen gestimuleerd GL261 glioblastoma invasie kan worden gevonden in referentie 9. - Afhankelijk van de gebruikte cellijnen, cellen aan de bovenste kamer zoals beschreven in de volgende twee stappen: muis glioblastoom (2.10.1) en humaan glioblastoom (2.10.2).
- Mix 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) cellen (150 pi) en 5 x 10 4 muis microglia (50 pl) (zie stap 2.6 voor media-informatie). Breng het volume op 500 pl door toevoeging van 300 ul MSFM / 0,3% BSA. Voeg celmengsel aan de bovenste kamer en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
LET OP: Muizen microglia zijn geïsoleerd van pasgeboren muizen, zoals beschreven in 1 6.
- Mix 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) cellen (150 pi) en 5 x 10 4 muis microglia (50 pl) (zie stap 2.6 voor media-informatie). Breng het volume op 500 pl door toevoeging van 300 ul MSFM / 0,3% BSA. Voeg celmengsel aan de bovenste kamer en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
Mix 7,5 x 10 4 U87 (glioblastoma) cellen (75 ui) en 2,5 x 10 4 THP1 (macrofaag) cellen (25 pi). Breng volume 500 pl door toevoeging van 400 pl RPMI / 0,3% BSA. Voeg de cel mengsel aan de bovenste kamer. Incubeer cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Na incubatie verwijderen cellen uit de top van de kamer door behoedzame aspiratie en lossen door het plaatsen van camera's in 3,7% formaldehyde in PBS. Toestaan kamers in fixeermiddel blijft gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (of overnacht bij 4 ° C). Verwijder fixatief door zachte aspiratie en te vervangen door 500 ul 1x PBS. Ga verder naar hoofdstuk 4 voor beeldanalyse.
LET OP: Experiment kunnen worden gepauzeerd op dit moment en opgeslagen voor beeldvorming in 1x PBS. Fluorescerende kleurstof signalen kunnen worden gedetecteerd tot 2 weken na fixatie.
3. Invasion Assay "3D" -embedding glioom en macrofagen / microglia in Matrix
- Dooi matrix mix bij 4 ° C gedurende de nacht. Voer alle verdere manipulaties met behulp van matrix op het ijs in de kap.
- Bereid 10 mg / ml concentratie van matrix media (MSFM of RPMI) met 0,3% BSA op ijs.
Opmerking: De concentratie van matrix kenmerkend ongeveer 15 mg / ml. - Om cellen (gelabeld in stap 1) tot schorsing bereiden in matrix, verwijder media uit cellen door aspiratie. Was de cellen op schotel met 2 mM EDTA / PBS. Voeg 500 ul van 2 mM EDTA / PBS cellen en incubeer gedurende 5-10 minuten in de broedstoof bij 37 ° C en 5% CO2.
- Resuspendeer cellen in 5 ml medium bevattende 0,3% BSA.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 120 x g.
- Aspireren supernatant van pellet. Resuspendeer pellet in media / 0,3% BSA zodat de concentratie van cellen is gelijk aan 1 x 10 6 cellen / ml. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen.
- Voeg 1,5 x 10 5 GL261 cellen (in 150 pl) + 5 x 10 4 microglia cellen (in 50 ui) in een 1,5 ml microfugebuis.Voeg 2 x 10 5 GL261 cellen (200 ui) in een afzonderlijke 1,5 ml microfugebuis.
OPMERKING: GL261 cellen alleen zonder microglia dient als controle. - Spin cellen in microfuge gedurende 5 minuten bij 120 x g.
- Resuspendeer cellen in 200 ul koude matrix op ijs.
- Plaat 50 ul (50.000 cellen) op het midden van het bovenste compartiment van 8 uM poriegrootte kamer insert.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min bij polymerisatie optreedt.
- Voeg 200 ul serumvrij medium aan de bovenste kamer en 700 pl serum bevattend celkweekmedium de onderste put.
- Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
- Na incubatie verwijderen cellen uit de top van de kamer door behoedzame aspiratie en lossen door het plaatsen van camera's in 3,7% formaldehyde in PBS. Toestaan kamers in fixeermiddel blijft gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (of overnacht bij 4 ° C). Verwijder fixatief door zachte aspiratie en te vervangen door 500 ul 1x PBS. Ga naar deel 4 foimage r analyse.
4. Imaging Testen
- Verwijder Chambers van 3,7% formaldehyde en was in goed met vers 500 ul 1x PBS.
LET OP: Sta niet toe dat de kamers te drogen. - Met een wattenstaafje, reinig de niet-invasieve cellen uit het bovenste gedeelte van het filter (zijde naar de binnenzijde van de kamer) schrapen het filteroppervlak. Begin voorzichtig en geleidelijk te verhogen druk. Doe dit minstens 3 keer per kamer.
- Plaats kamers in ofwel een glazen bodem schaal of laat het in een 24 wells plaat.
- Plaats monster op het podium van een epifluorescerende of laser confocale fluorescentiemicroscoop uitgerust met camera en image capture software 9,10.
- Haal een paar 10X of 20X beelden van representatieve velden.
- Met een beeldanalyse software zoals ImageJ Tel het aantal glioblastoma cellen die het filter zijn overgestoken naar de onderzijde 9,10.
- Wanneer beeldvorming van de "3D. "Invasie assay (beschreven in hoofdstuk 3), het genereren van een Z-stack-serie met behulp van een fluorescerende laser confocale microscoop 5-6 Om het beeld van de invasieve cel bevolking aan de onderkant van het filter, volg het protocol stappen 4,2-4,6 hierboven beschreven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met de hier beschreven werkwijzen, hebben we aangetoond dat microglia en macrofagen aanzienlijk kunnen stimuleren glioblastoom celinvasie. Twee verschillende invasie assays worden toegepast en worden weergegeven in figuur 1. In figuur 2, werden GL261 cellen die constitutief het fluorescerende eiwit tot expressie mCherry uitgeplaat op vooraf beklede kamers met en zonder microglia voor 48 uur. GL261 cellen werden minimaal invasieve op zichzelf echter indie...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De zeer invasieve aard van hoogwaardige astrocytomen en glioblastoma maken deze hersentumoren zeer dodelijk. Het is daarom van het grootste belang voor de moleculaire en cellulaire mechanismen van glioblastoma invasie begrijpen. Er is al veel geleerd over het proces van glioblastoma invasie al 17. Met behulp van de test formaten beschreven in dit document, heeft ons laboratorium aangetoond in zowel muis en mens modellen die tumor-geassocieerde macrofagen glioma cel invasie kan stimuleren door 5-10 voudig. Dez...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen Dr. Konstantin Dobrenis bedanken voor het verstrekken van muis microglia voor deze studies.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
Referenties
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
