Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila

8.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53992

⸱

27 november 2016

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

In dit artikel

Samenvatting

Gezonde cellen in gehele dieren die lage niveaus van caspase activiteit bevatten detecteren, de aangewezen CaspaseTracker gevoelige biosensor werd gegenereerd voor Drosophila. Caspase-afhankelijke biosensor activiteit gedetecteerd in langlevende gezonde cellen in de inwendige organen van volwassen dieren onder geoptimaliseerde omstandigheden gekweekt bij afwezigheid van dood stimuli.

Samenvatting

Caspases zijn de belangrijkste bemiddelaars van apoptotische celdood via hun proteolytische activiteit. Wanneer caspasen in cellen worden geactiveerd tot niveaus die detecteerbaar zijn met beschikbare technologieën, wordt over het algemeen aangenomen dat apoptose kort daarna zal plaatsvinden. Caspases kunnen veel functionele en structurele componenten splitsen om snelle en volledige celvernietiging binnen enkele minuten te veroorzaken. Echter, toenemend bewijs geeft aan dat in normale gezonde cellen dezelfde caspasen andere functies hebben, vermoedelijk op lagere enzymatische niveaus. Studies naar niet-apoptotische caspase-activiteit zijn gehinderd door moeilijkheden met het detecteren van lage niveaus van caspase-activiteit en met het volgen van het uiteindelijke cellot in vivo. Hier illustreren we het gebruik van een ultragevoelige caspase-reporter, CaspaseTracker, die cellen permanent labelt die caspase-activiteit hebben ervaren in hele dieren. Deze in vivo dual-color CaspaseTracker biosensor voor Drosophila melanogaster drukt tijdelijk rood fluorescerend proteïne (RFP) uit om recente of lopende caspase-activiteit aan te geven, en permanent groen fluorescerend proteïne (GFP) in cellen die op enig moment in het verleden caspase-activiteit hebben ervaren, maar niet zijn gestorven. Belangrijk is dat deze caspase-afhankelijke in vivo biosensor gemakkelijk de aanwezigheid van niet-apoptotische caspase-activiteit in de weefsels van orgaansystemen in de hele volwassen vlieg onthult. Dit wordt aangetoond met behulp van gehele montages van individuele vliegen om biosensor-activiteit in gezonde cellen door het hele brein, darm, malpighische buisjes, cardia, eileiders en andere weefsels te detecteren. CaspaseTracker detecteert niet-apoptotische caspase-activiteit in langlevende cellen, aangezien biosensor-activiteit wordt gedetecteerd in volwassen neuronen en in andere weefsels ten minste 10 dagen na caspase-activering. Deze biosensor dient als een belangrijk hulpmiddel om de rollen en moleculaire mechanismen van niet-apoptotische caspase-activiteit in levende dieren te onthullen.

Inleiding

Caspasen zijn cysteïne proteasen die apoptotische celdood bemiddelen door het splitsen van een groot aantal intracellulaire eiwitten na sleutel aspartaat residuen. Bijvoorbeeld, initiator caspases te activeren effector caspasen, derepresseren DNA nucleasen, splitsen cytoskelet componenten en de lipide samenstelling van celmembranen veranderen om snel te ontmantelen cellen en hun erkenning en engulfment stimuleren door naburige cellen die beschikken over de cel lijken. 1-4 Er wordt geschat dat miljarden cellen sterven per dag in het menselijk lichaam, en apoptose is een belangrijk mechanisme van door chemotherapie geïnduceerde tumorceldood. 5 een andere groep caspasen kan celdood dan veroorzaken bij verschillende niet-apoptotische processen aangeboren immuniteit stimuleren. 6, het meeste onderzoek op caspases is gericht op hun pro-dood functies.

Interessant vroeg bewijs op het gebied bleek dat dezelfde caspasen verantwoordelijk voor het bevorderen celdood ook niet dood fzalven. Baanbrekende studies hebben aangetoond dat caspasen zijn betrokken bij diverse cellulaire functies in gezonde cellen, waaronder de regulering van celproliferatie en celmigratie tijdens embryogenese. 7-9 Caspasen zijn vereist voor spermatide individualisering in Drosophila 10,11, voor het blokkeren van een alternatieve necroptotic celdood in muizen 12,13, en microRNA verwerking in C. elegans. 14,15 In misschien de langste duur cellen, neuronen, caspasen en andere apoptotische mechanisme betrokken zijn bij de regulering van de neuronale activiteit van snoeien synaptische uiteinden, een proces vermoedelijk essentieel zijn andere synapsen voor leren en geheugen versterken. 16- 18 Het is mogelijk dat caspases pruning een soort mini-apoptose kleine neuronale uitsteeksels niet met hele celdood bevorderen. 19 echter caspasen kunnen alternatieve functies verbonden moeten apoptose-achtige verschijnselen. 20,21 dubbelrols in het leven en de dood zijn niet uniek voor caspases; BCL-2 familie eiwitten en cytochroom c zijn rol in cellulaire energetica in gezonde cellen, maar maken ook deel uit van de kern apoptotische route die geactiveerd wordt door veel celtypen stress. 22-25 Hoewel niet bewezen, lijkt het logisch dat de evolutie dag is gekoppeld -Jobs dood-banen binnen dezelfde moleculen om tijdig eliminatie van ongeschikte of ongewenste cellen te waarborgen.

Op dit moment worden de moleculaire mechanismen van apoptotische caspase activiteit begrepen, en de mate van niet-apoptotische caspase activiteit tijdens embryonale ontwikkeling en in volwassen weefsels is ook niet bekend. Een belangrijke uitdaging is de moeilijkheid in het onderscheiden van dag-banen van de dood-banen van caspases. In tegenstelling tot apoptose en pyroptosis wanneer caspase-activiteit wordt versterkt door een proteolytische cascade worden de dag-banen van caspases verwacht bij veel lagere niveaus van enzymatische activiteit, vermoedelijk beneden detectie plaatsvinden door vele beschikbare technologies.

Voor de hier gepresenteerde werk, anderen ontwikkeld diverse caspase biosensoren voor verschillende doeleinden. De SCAT biosensoren (bijv ECFP-DEVD-Venus) snel op te sporen real-time caspase-activiteit in gekweekte cellen en dierlijke weefsels met behulp van FRET. 26,27 Bij caspase decollete, de kern gerichte GFP deel van Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) ondergaat subcellulaire herlokalisatie binnen enkele minuten wanneer de plasmamembraan-tether wordt gesplitst door caspases. 28 Evenzo NES-DEVD-YFP-NLS ApoAlert-pCaspase3-Sensor () herlokaliseert van het cytoplasma naar de kern op caspase decollete. 29,30 Meer voor kort werd de chromofoor in iCasper slim ontworpen om fluoresceren wanneer gesplitst door caspases, waardoor de detectie van biosensor in real-time in neuronen van Drosophila embryo's, maar vooral in combinatie met een ontwikkelingsstoornis celdood. 31 caspase-afhankelijke dood van olfactorische neuronen tijdens veroudering was demonstbeoordeeld door immunodetectie van de caspase-gesplitste vorm van CPV biosensoren (bijvoorbeeld mCD8 PARP-Venus). 32,33 Belangrijk is dat de geactiveerde vorm van caspase-3 in afwezigheid van celdood gedetecteerd door gevoelige immunostain in stekels van gekweekte neuronen, en in het soma via caspase-afhankelijke fluorescentie van het nucleaire CellEvent reporterkleurstof, maar probleemgevallen door foto-toxiciteit, hoewel celdood werd uitgesteld tot na wervelkolom eliminatie. 19 Aldus nieuwe caspase biosensoren nodig detecteren en volgen basale cellen met caspase-activiteit in vivo.

Om deze moeilijkheden te overwinnen, genereerden wij een nieuwe tweekleurige caspase biosensor, aangewezen CaspaseTracker. Deze strategie combineert een aangepaste versie van de Drosophila caspase-gevoelige Apoliner biosensor 28 met de Drosophila G-TRACE FRT recombinasesysteem 34 permanent labelen en volgen cellen in vivo. 35 Het Gal4-geactiveerde G-trace systeem maakt het mogelijk zeer lage niveaus van caspases tot CaspaseTracker activeren, wat resulteert in RFP expressie in het cytoplasma en permanente GFP expressie nucleair doelwit in een cel die ooit caspase activiteit heeft meegemaakt. 35 Dit systeem kan labelen cellen in leven in gehele dieren met behulp van Drosophila melanogaster, een soepel en veel gebruikt model voor de studie van caspases en celdood. 36-38

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van CaspaseTracker Flies

  1. Ter voorbereiding CaspaseTracker (DQVD) vliegt voor experimenten uit te voeren deze kruising: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP; Ubi> Stoppen> GFP-NLS), door de overdracht van 7-10 maagd vrouw (of man) vliegen die de caspase biosensor substraat mCD8-DIAP1 Gal4-gedreven door de ubiquitine-promoter 35 tezamen met eenzelfde aantal mannelijke (of vrouwelijke) G-TRACE vliegen, waarbij het tweede chromosoom Cyo balanceerinrichting moet letaliteit van de homozygote combinatie van G- voorkomen TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, en Ubi> Stoppen> GFP-NLS) 34. Plaats vliegt in een vers voedsel flacon met verse gist plakken als eiwitbron.
  2. Incubeer bestanden bij 18 ° C gedurende 5 tot 7 dagen (maximum 2 weken) en verwijder vervolgens de bovenliggende vliegt uit het flesje te vermijden overbezetting met nieuwe nageslacht, en het opzetten van nieuwe veredelingstechnieken flesjes.
  3. Verder incubatie bij 18 ° C tot nageslacht vliegt Eclose. Selecteer de niet-Cyo [non-curly vleugel] nageslacht van de juiste genotype van CaspaseTracker, die transgeen voor CaspaseTracker en G-TRACE elementen 35 zijn.
  4. Tegelijkertijd genereren controle ouderlijke niet-transgene w118 vliegen en caspase-ongevoelige (DQVA) vliegen parallel aan specifieke CaspaseTracker RFP en GFP-fluorescentie te controleren.
  5. Voer PCR genotypering om bestanden met CaspaseTracker met behulp van de primers te bevestigen: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, het produceren van een 3897 bp product. Voor genotypering van de G-Trace loci, gebruik maken van de volgende primers voor GFP (474 ​​bp), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; voor RFP (258 bp), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG AAG GTG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; en voor Flpase (655 bp), 5'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TTG TCT TCT CTG TCA C. Voor genotypering Gal4 in de pUWR vector (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. Tissue Voorbereiding, kleuring en Montage

  1. Voor fly dissecties, voorkomen ontleed weefsel van het vasthouden aan plastic pipet tips en centrifugebuizen, jas tips en buizen met 1% runderserumalbumine (BSA), opgelost in water.
  2. Ontleden vliegt op een siliconen kussen behulp van een tang.
    1. Om beschadiging van de uiteinden van de forceps op een hard oppervlak bij het uitvoeren van het weefsel dissectie voorkomen, mag dissectie op een siliciumoppervlak. Voor het maken van siliconen dissectie platen, smelt het silicium in de commerciële kit volgens instructies van de fabrikant (Materials List). Na smelten van de siliconen, voeg 3-4 ml van een 60 mm weefselkweekplaat. Silicon gerechten kunnen worden hergebruikt.
    2. Verdoven een vlieg met CO 2, en overgebracht naar een silicagel platen met 1 ml koude PBS. Introduceer de CO 2 om een flacon met het vliegen met behulp van een blaaspijp, en vervolgens over het verdoofd vlieg toa Pad dat een CO 2 aanbod heeft.
    3. Gebruik een tang om de vlieg greep hoofd, en een tweede tang de thorax trekken in de tegenovergestelde richting van de vlieg kop los te koppelen van het lichaam die zonder de verbinding tussen de kop en voordarm.
    4. Gebruik 2 paar tang om de vleugels en poten van de thorax te verwijderen.
    5. Gebruik een tang om de thorax te houden en een tang om de buik te trekken om het opnieuw scheiden van de thorax zonder beschadiging van de verbinding tussen de voordarm en middendarm.
    6. Ontleden inwendige organen, inclusief de hersenen, darmen, Malpighian buisjes en de eierstokken, zoals eerder aangetoond. 39-41
    7. Verwijder alle stukken van de cuticula en het vet lichamen met een tang als deze weefsels te produceren sterke autofluorescentie. Geduld en oefening moeten een compleet orgaansysteem bereiden zijn.
  3. Transfer ontleed weefsels tot 1,5 ml centrifuge buizen, en bevestig weefsels wiste 0,5 ml 4% paraformaldehyde in PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) bij kamertemperatuur gedurende 20 tot 30 min met rotatie in het donker bleken RFP en GFP in de weefsels voorkomen. Vermijd langdurige fixatie die volgende kleuring resultaten in gevaar kunnen brengen.
  4. Verwijder de paraformaldehyde door voorzichtig pipetteren en was 3 maal met 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) bij kamertemperatuur.
  5. Permeabilize de weefsels met 0,5 ml PBST bij 4 ° C geïncubeerd onder zacht schudden. Kortere incubaties kunnen onvolledig permeabilisatie en compromissen vlekken resultaten opleveren.
    1. Als het nodig is om achtergrondkleuring te verminderen, overwegen incuberen weefsels in 0,5 ml PBST met 1% BSA in plaats van PBS.
  6. Was de weefsels 3 maal met 0,5 ml PBST.
  7. Kernen en filamenteus actine (F-actine) vlek toepassen 0,5 ml PBST met 10 ug / ml Hoechst 33342 kleurstof en blauw nucleaire 0,3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-actine kleurstof en incubeer gelijktijdig met weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur wie zachte rotatie in het donker. Vermijd langdurig kleuring omdat dit de achtergrond zal toenemen.
    1. Voor immunokleuring Incubeer gefixeerd en gepermeabiliseerd weefsels met 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml PBS overnacht bij 4 ° C, vlek met 1: 100 verdunning van anti-Elav antilichaam of 1: 200 verdunning van anti-caspase-3 nacht bij 4 ° C (300 ui). Volg de overeenkomstige secundaire antilichaam verdund 1: 100 en incubeer gedurende 1 tot 3 uur bij kamertemperatuur. Zie Materialen List voor specifiek antilichaam informatie.
  8. Was de weefsels 3 maal, telkens 5 min in 0,5 ml PBST met zachte rotatie.
  9. Met een pipet, verwijder alle PBST en voeg 200 ul anti-bleekmiddel montagemiddel (zie materialen) volledig te bedekken weefsels gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur of 4 ° C overnacht. Optimale weefsels die volledig zijn opgenomen het montagemiddel zal zinken naar de bodem van de buis.
  10. Pre-Clean het glaasje met water of 70% ethanol en de overdracht van de weefsels met montage agent om het glass glijbaan.
  11. Plaats een glazen afdekplaat slip over de weefsels voorzichtig. Solliciteer vaseline aan het glaasje en het deksel slip te voorkomen dat het vernietigen van het weefsel door overkompressie. Verwijder extra bevestiging agent met vloeipapier.
  12. Dicht de dekglas door toepassing nagellak langs de randen van het dekglas om lekkage montage stoffen uit de weefsels voorkomen.

3. Confocale microscopie

  1. Gebruik een omgekeerde confocale epi-fluorescentie microscoop. Echter, rechtopstaande microscopen worden gebruikt. Om het gebruik van weefsels tiling handhaven stabiele kamertemperatuur drift van focus en verschuiving van xy vlak voorkomen door de thermische uitzetting en krimp van de componenten. Milieu-controle systemen en aandacht driftcompensatie systemen helpen om dit probleem te voorkomen als gevolg van het verlies van thermo-evenwicht van de microscoop systeem.
  2. Plaats het preparaat op het podium van de microscoop. Neem een ​​paar testbeelden met behulp van lage resolutie (125 x 125 pixels), eend het juiste aantal tegels nodig bestrijken het gehele gebied van belang (ROI) te bepalen.
  3. Stel de microscoop scansysteem om beelden met scanresolutie zoals 500 x 500 pixels vast te leggen. Selecteer het doel zoals een 20x NA 0,8 of een 63x NA 1,4 Plan-Apochromat doelstelling voor het analyseren van weefsel door glazen dekglaasjes, zodat elk van de afbeeldingen (tegels) overlapt 20% aan alle kanten.
  4. Stel de afbeelding sequentie uit langste excitatiegolflengten kortste als de lange golflengte van licht veroorzaakt lagere foto-bleken. De sequentie van het langste tot excitatiegolflengte kortste is: (i) 633 nm voor Phalloidin F-actine en antilichaam tegen geactiveerde caspasen, (ii) 561 nm voor RFP, (iii) 488 nm voor GFP, en (iv) 405 nm voor Hoechst nucleaire vlek.
  5. Tijdens de beeldvorming, minimaliseren de blootstelling van cellen aan fluorescente laser excitatie bij beeldvormend proces foto-bleken voorkomen doordat de laserintensiteit om beelden van hoge kwaliteit van weefsels te verkrijgen.
  6. Nadat ikmages worden verzameld, het samenvoegen van de beelden met behulp van microscoop software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er zijn twee belangrijke componenten waarmee CaspaseTracker om caspase-activiteit te detecteren in de normale gezonde cellen (figuur 1a). De eerste is een 146 aminozuur caspase afsplitsbare polypeptide gemodelleerd naar de caspase biosensor Apoliner (figuur 1b). 28 Deze polypeptide is afgeleid van DIAP1 (Drosophila remmer van apoptose) met een natuurlijk voorkomend caspase plaats die wordt gesplitst tijdens apoptose typisch door caspa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier illustreren we de bouw en de innerlijke werking van CaspaseTracker dat de detectie van een brede basale caspase-activiteit in gezonde weefsels te vergemakkelijken. De kritische stappen voor het detecteren van niet-apoptotische caspase activiteit in vivo zijn: 1) het genereren van vliegen met de biosensor transgen 2) na caspase-reporter functie met geschikte controles, 3) de toepassing dissectie technieken om alle interne orgaansystemen van de volwassen Drosophila observeren, en 4) onderscheiden bi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Polan Santos en Darren Obbard voor Drosophila illustraties in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena voor het gebruik van de JHMRI insectary. Dit werk werd ondersteund door het Life Science Research Foundation fellowship (HLT), University Grants Committee van de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF), en NIH subsidies NS096677, NS037402 en NS083373 (JMH). Ho Lam Tang is een Shurl en Kay Curci Foundation Fellow van de Life Sciences Research Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Verbruiksartikelen en reagentia
VectashieldVector ProductsH-1000Montagemedium
PincetTed Pella#505 (110mm, #5)Dumont pincet biologiekwaliteit, roestvrij staal
Hanging Drop SlidesFisher Scientific12-565BGlazen platen
Hoechst 33342Molecular ProbesH1399DNA-kleuring
Alexa Fluor 633 PhalloidinMolecular ProbesA22284Actine-kleuring
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antilichaamDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)Antibody Registry ID:  AB_528218 Kleuring voor Drosophla pan-neuronale ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antilichaamCell Signaling Technology#9661Kleuring voor actief fragment van caspase-3
ProLong Gold antifade reagensLife TechnologiesP36934voor het behoud van fluoroforen 
ProLong Diamond Antifade MountantLife TechnologiesP36961voor het behoud van fluoroforen 
SylGard 182 Silicone Elastomer KitDow Corning Productcode: 0001023934voor dissectieplaten
Apparatuur
LSM780 confocale microscoopCarl ZeissN/ABeeldvorming
Carl Zeiss Stereomicroscoop Stemi 2000Carl ZeissN/ADrosophila dissectie
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscoop Illuminator, 150 WAmScopeWBM99316Lichtbron

Referenties

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8(2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265(2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15(2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437(2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015(2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52(2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223(2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408(2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Drosophila melanogasterCaspaseTracker-biosensorfluorescerende reporterconfocale microscopieweefseldissectiegenetische kruisingRFP GFP-expressiecaspase-splitsing
In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.