Methodenartikel

Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie

DOI:

10.3791/53994

⸱

14 mei 2016

 , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een methode van lange-termijn tijds-lapse microscopie om individuele cellen longitudinaal te volgen in reactie op anti-kanker therapieën.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De respons van de individuele cellen op anti-kankergeneesmiddelen belangrijke stap in het bepalen van de populatie respons, en daarom is een belangrijke factor in het algemene resultaat. Immunoblotting, stroomcytometrie en vaste celexperimenten worden vaak gebruikt om te bestuderen hoe cellen reageren op anti-kanker drugs. Deze werkwijzen zijn belangrijk, maar ze hebben een aantal tekortkomingen. Variabiliteit in drug reacties tussen kanker en normale cellen, en tussen cellen van verschillende oorsprong van kanker, en van voorbijgaande aard en zeldzame reacties zijn moeilijk te begrijpen met behulp van de bevolking gemiddelde assays en zonder de mogelijkheid om rechtstreeks te volgen en in lengterichting te analyseren. De microscoop is bijzonder goed geschikt voor het levende cellen. De vooruitgang in de technologie stelt ons in staat om routinematig afbeelding cellen op een resolutie die niet alleen cell tracking, maar ook de waarneming van een verscheidenheid van cellulaire reacties mogelijk maakt. We beschrijven een aanpak in detail die het mogelijk maakt voor de continue time-lapse beeldvorming vancellen tijdens de respons op geneesmiddelen voor wezen zo lang als gewenst, gewoonlijk tot 96 uur. Varianten van de benadering kunnen cellen worden gecontroleerd weken. Met de inzet van genetisch gecodeerd fluorescerende biosensoren talrijke processen, paden en reacties kunnen worden gevolgd. We tonen voorbeelden die volgen en kwantificeren van celgroei en voortgang van de celcyclus, chromosoom dynamiek, DNA schade en celdood omvatten. We bespreken ook variaties van de techniek en de flexibiliteit, en markeer een aantal gemeenschappelijke valkuilen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Levende cellen microscopie en longitudinale volgen van enkele cellen is geen nieuwe techniek. Van de vroegste microscopen, liefhebbers en wetenschappers hebben waargenomen en studeerde enkele cellen en organismen, hun gedrag en de ontwikkeling van 1-3. Een beroemd voorbeeld van de late David Rogers aan de Vanderbilt University in de jaren 1950 toont een menselijke neutrofielen in een bloed uitstrijkje achter een Staphylococcus aureus bacterie en uiteindelijk het proces van fagocytose 4. Deze levende cellen film is een uitstekend voorbeeld van hoe meerdere processen kunnen worden waargenomen en gecorreleerd in een enkel experiment: detectie van een chemische gradiënt, mechanica en snelheid van celmotiliteit, cel vormen dynamiek, hechting en fagocytose van een pathogeen.

De komst van volledig geautomatiseerde microscopen en zeer gevoelige digitale camera's heeft geleid tot een toename van het aantal onderzoekers met behulp van microscopie op fundamentele vragen in de celbiologie, variërend f vragenrom hoe cellen verplaatsen 5,6 en verdeel 7,8 tot dynamiek en membraantransport 9-11 organel. Niet-fluorescerende, helderveld microscopie, met inbegrip van fase-contrast (PC), die de Nobelprijs voor Frits Zernike in 1953 oogstte, en differentieel interferentie contrast (DIC) zorgen voor de waarneming van cellen en kernen, maar ook sub-cellulaire structuren waaronder microtubule bundels , chromosomen, nucleoli, organel dynamiek, en dikke actine vezels 12. Genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten en de ontwikkeling van fluorescerende kleurstoffen tegen organellen dramatisch beïnvloed time-lapse microscopie 13-15. Hoewel niet de focus van dit artikel, beeldvorming in cel sferoïden en in situ (intravitale microscopie) met behulp van confocale microscopie en multi vormen een andere uitbreiding van de aanpak, en er zijn uitstekende artikelen die te gebruiken en te bespreken deze benaderingen 16-19.

De reacties van cellen op anti-Cancer drugs of natuurlijke producten worden bepaald op de moleculaire en cellulaire schaal. Inzicht in cel reacties en lot na behandeling gaat vaak gepaard met de bevolking gemiddeld assays (bijv., Immunoblotting, geheel goed maatregelen), of vaste tijdstippen met immunofluorescentie detectie en flowcytometrie, die enkele cellen te meten. Heterogeniteit in één cel reacties op geneesmiddelen binnen een populatie, in het bijzonder bij tumoren, kan een deel van de variabiliteit verklaren respons gezien in cellijnen en tumoren die worden behandeld met hetzelfde geneesmiddel bij verzadiging. Langdurige longitudinale benaderingen van een bepaalde cel of een populatie van cellen te volgen is een minder voorkomende maar zeer krachtige benadering die het mogelijk maakt de directe studie van moleculaire respons pathways, verschillende fenotypen (bv., Celdood of celdeling), waarneming van cel-tot-cel variabiliteit binnen een populatie, en hoe deze factoren bijdragen aan populatie respons dynamiek 20-22. Optimistisch, in staatom te observeren en te kwantificeren eencellige antwoorden zullen helpen bij het verbeteren ons begrip van hoe geneesmiddelen werken, waarom ze soms niet, en hoe optimaal gebruik te maken hen.

De techniek van lange-termijn time-lapse microscopie longitudinale volgen en analyseren geneesmiddel reacties beschikbaar voor vele onderzoekers en kan eenvoudig zijn met alleen uitgezonden licht fenotype reacties 20,21 observeren. De belangrijkste onderdelen van de aanpak zijn: geschikte voorbehandeling van de cellen van belang, een geautomatiseerde microscoop met omgevingskamer, een camera geïntegreerd met een computer te verwerven en opslaan van de beelden, en software om de time-lapse beoordelen meten en analyseren van de cellen en tl biosensoren. Wij bieden een gedetailleerd protocol met veel tips voor het uitvoeren van time-lapse microscopie van gekweekte cellen voor zo lang als enkele dagen met behulp van helderveld en / of groothoek epifluorescerende microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor elke cellijn kan worden gekweekt in kweekhun reacties op anti-kankertherapieën bestuderen. Wij bieden voorbeelden van data verkregen en geanalyseerd met behulp van meerdere verschillende genetisch gecodeerd fluorescerende biosensoren en een voorbeeld van fase-contrast microscopie, kort ingaan op de verschillende soorten probes, de voor- en nadelen van de lange-termijn time-lapse en longitudinale tracking, wat kan worden geleerd van deze aanpak is dat moeilijk te begrijpen van niet-directe aanpak, en een aantal variaties die we hopen van belang en waarde voor onervaren onderzoekers die niet hebben overwogen met behulp van de aanpak zal zijn, en ervaren onderzoekers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgende protocol gebruikt parameters bepaald door de experimenten in Figuren 4 en 6 betreffende verwerving instellingen en de testomstandigheden. Veel van deze parameters kunnen worden aangepast voor andere experimenten passen (bijv belichtingstijden, binning, fluorescerende kanalen, enz.). Alle procedures moeten voldoen aan institutionele richtlijnen en regelgeving en door de institutionele bioveiligheid commissie worden goedgekeurd. Microscope fabrikant websites bevatten uitstekende informatie voor live-cell imaging.

1. microscopen en Imaging Software

  1. Live cell imaging op een breed scala van omgekeerde microscopen. De meest voorkomende microscopen zijn groothoek epifluorescentie en spinning-disk confocale. Hier, maken gebruik van een geautomatiseerde en gemotoriseerd groothoek epifluorescentiemicroscoop met 200 watt HQI lichtbron.
  2. Zorg voor een stage-top of microscoop klimaatkamer. Hier, gebruik dan een stage-top klimaatkamer.
  3. Gebruik commerciële software aan microscopen werken met hulpprogramma's om time-lapse microscopie te voeren.
  4. Gebruik in de handel verkrijgbare software of ImageJ voor beeldanalyse. Veel andere analyse-instrumenten zijn in de handel verkrijgbaar, en er zijn op maat gemaakte programma's waarvan vele zijn gepubliceerd 8,18.

2. Het visualiseren van cellulaire processen en fenotypische Responses

  1. Visualiseer cellen met helderveld microscopie. Differentiële interferentie contrast en fasecontrast alleen kan zeer informatief tussen reacties op antikankergeneesmiddel responsen bestuderen. Deze werkwijzen kunnen omvatten mitose, celmotiliteit en apoptose.
  2. Visualiseren celstructuren, organellen en processen fluorescerende biosensoren. Fluorescerende probes zijn informatief bij het opsporen van specifieke subcellulaire processen. Deze kunnen onder meer dynamiek van microtubuli, mitochondriale en endoplasmatisch reticulum dynamiek, eiwit accumulatie en lokalisatie, enmoleculaire signalering (bijv., fosforylatie, calcium).

3. Voorbereiding van monsters

  1. Groeien cellen in celkweek gecertificeerd gerechten in een standaard celkweek bevochtigde incubator (bijvoorbeeld 37 ° C, 5% CO2, 80% relatieve vochtigheid).
    1. Groeien HT1080 cellen in MEM met EBSS. Aanvullen van het medium met 10% v / v FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / v natriumpyruvaat en 1% v / v niet-essentiële aminozuren.
  2. Twee dagen voor imaging, plaat 50.000 HT1080 Fucci cellen in 3 putjes van een 12-well # 1.5 glazen bodem schaal in een gecertificeerde steriele laminaire stroming kap. Pas het aantal cellen uitgeplaat bereiken ~ 60% confluentie voor de start van het experiment. Afhankelijk van de cellijn en de aard van het experiment celdichtheid kan minder zijn.
    Opmerking: Celdichtheid kunnen grote invloed hebben op de groei van de cellijn en de experimentele resultaten. Tellen cellen te minimaliseren experiment-to-experiment variability als gevolg van de dichtheid.
    1. Afhankelijk van de klimaatkamer en de noodzakelijke voorwaarden voor het experiment, plaat cellen in enkele putjes (typisch 35- of 60-mm), 4 en 35-mm gerechten, 6-, 12- of 24-well celkweek platen, of dekglaasje dia's in verschillende formaten. Gebruik glazen bodem platen met # 1,5 glas als de meeste objectieven zijn geoptimaliseerd voor deze dikte van het glas, en de beeldvorming door celcultuur plastic is zeer slecht.
      Opmerking: Sommige cellijnen niet groeien en te overleven op glas. In deze gevallen kan het glas worden bekleed om celhechting te verbeteren (bijv., Poly-lysine of collageen). Sommige bedrijven produceren optische celkweek kunststof bestaat, moet empirisch worden bepaald of dit een haalbare optie.

4. Milieu Chamber Set-up

  1. Vóór iedere proefneming, opzet de klimaatkamer zodat het werkt op ~ 80% luchtvochtigheid en zo de temperatuur van het monster positie 37 o C. Meest gekweekte cellen groeien in 5% CO2 / luchtbalans sfeer door natriumbicarbonaat buffer in het medium. Afhankelijk van de set-up, ofwel zet de milieu-controller tot 5% CO 2 en het zal mixen 100% CO 2 met lucht, of gebruik maken van pre-mixed, gecertificeerde 5% CO 2 / balans lucht gas. Volg de aanwijzingen van de fabrikant voor de gasstroom-tarieven.
    Opmerking: Sommige cellijnen groeien in CO 2-onafhankelijke medium in welk geval zij zonder CO 2 kan worden gehandhaafd. Speciaal beeldmedia is ook dat de toevoeging van autofluorescente verbindingen beperkt. De groei in scripties mediums voor het gewenste type cel moet empirisch vooraf worden bepaald.
  2. Voorafgaand aan de beeldvorming, zorgen voor het waterreservoir gevuld is (na aanwijzingen van de fabrikant) met steriel gedestilleerd water. Schakel de klimaatkamer op de gewenste temperatuur en legt deze in de microscooptafel inzet. Om gas op te slaan, hoeft de stroom op dit moment niet starten.
    Opmerking: Als er een vrije ruimte tussen het podium-top kamer en het podium inzet en / of enige spanning op aansluitsnoeren naar de kamer kan bewegingsartefacten te introduceren in het experiment.
    1. Leg stukjes van paraffine film over de randen van het podium inzet opening voorafgaand aan het plaatsen van de kamer erin het koppelen van de kamer naar het podium, en zorg ervoor dat geen verbindingen te trekken op de kamer.
  3. Laat de kamer in evenwicht tot 37 o C. Zorg voor een stabiele temperatuur aan temperatuurschommelingen te voorkomen dat tijdens de beeldvorming welke cel fysiologie van invloed kan zijn en de invoering van drift. Temperatuurevenwicht bereiken vereist gewoonlijk 30 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de omgeving.
    1. Plaats een 'dummy' schotel met water in de putten in de kamer tijdens het opwarmen. Een imaging schotel gevuld met water bootst de steekproef, te helpen zorgen voor de kamer is voldoende opgewarmd en gestabiliseerd. Het vullen van de kamer met voorverwarmde steriel watervermindert de tijd die nodig temperatuurstabilisatie en minimaliseert de temperatuurdaling na toevoeging van het experimentele monster.

5. Microscoop Set-up

  1. Schakel de microscoop, bijbehorende computer en alle benodigde randapparatuur.
    1. Afhankelijk van de lichtbron, wacht aan te zetten totdat het nodig is (bijv., LED).
  2. Met het doel torentje in een lage positie, selecteer de 20X 0,7 NA doel worden gebruikt.
  3. Plaats het monster op het streven - dit maakt het makkelijker om de cellen te vinden wanneer het monster in de kamer.
  4. imaging parameters op dit moment als deze bekend uit eerdere experimenten.

6. Het transport van cellen op een microscoop en in de Kamer

  1. Vervoer de cellen af ​​te beelden uit de incubator naar de klimaatkamer. Zorg ervoor dat deze snel wordt gedaan om de effecten van een relatief lage CO 2 beperken sfeer en verlaagde temperatuur op de cellen. Volg alle institutionele bioveiligheid richtlijnen voor het monster transport en clean-up in geval van een lekkage.
    1. Plaats de cellen in een afgesloten container Styrofoam of geïsoleerde zak om grote veranderingen in het milieu te voorkomen.
  2. Plaats het monster beeldvorming schaal in de kamer volgende aanwijzingen van de fabrikant.
  3. Nadat de cellen hebben in de klimaatkamer veiliggesteld, sluit de kamer naar een stabiele omgeving te onderhouden en meteen weer op de bron (nen) van de atmosferische gas.
    1. Aangezien sommige klimaatkamers geen strakke, gesloten deksel gebruiken, verdamping, laag steriele embryo gecertificeerde minerale olie vertragen bovenop het groeimedium. Wikkel gas-permeant paraffine film rond de omtrek-randen van de schaal voor monsters zorg dat u de glazen imaging gebied niet te hinderen. Gelokaliseerde bevochtiging secundaire werkwijzen kunnen worden toegepast. Condensatie op het deksel van de schaal voor monsters kan verminderen uitvoeMance van helderveld microscopie.
  4. Om de effecten van thermische drift vroeg tijdens het experiment te minimaliseren Wacht 30 minuten voordat de time-lapse. De benodigde tijd is afhankelijk van imaging gerecht en andere factoren. Bepaal empirisch.

7. Instellen van de Imaging

  1. Selecteer imaging voorwaarden die het beste de gegevens zal vertegenwoordigen. Neem voorzorgsmaatregelen om fototoxiciteit te voorkomen door het beperken van de blootstelling keer, met behulp van een lagere intensiteit van het licht en het selecteren van probes die zijn enthousiast over langere golflengten van het licht.
  2. Definieer x, y en z-vlak en de gewenste golflengte (n) voor elke positie af te beelden. De tijdsresolutie wordt beperkt door het aantal posities en golflengten. Voor de lange termijn time-lapse van de meeste cellulaire processen, het verwerven van een afbeelding om de 10 - 20 min; hogere tijdsresolutie (met korte tussenpozen, bijv., 1 min) zorgt voor meer datapunten en daardoor robuuster cell tracking, maar ook resulteert in een meer geïntegreerdeblootstelling aan licht en grotere datasets.
    1. Zoals HT1080 Fucci hebben dynamisch groen en rood fluorescerende eiwitten (zie Representatieve resultaten), gebruikt u de volgende belichtingstijden: FITC / GFP - 50 msec, Texas Red / TRITC - 40 msec, Helderveld - 20 msec. Gebruik een 2 x 2 bin.
  3. Enable software gecontroleerde autofocus met behulp van de standaard parameters onder geavanceerde instellingen. Definieer een autofocus bereik van 10 urn met de aanbevolen stapgrootte. Zorg ervoor dat u dit te doen voordat het starten van de time-lapse. Autofocus met helderveld beelden en nooit met fluorescentie tot fototoxiciteit en fotobleken te verminderen.
    1. Gebruik software gecontroleerde autofocus systemen op een microscoop met een gemotoriseerde podium, en direct gericht op het monster. Ze kunnen echter de meetsnelheid van het experiment beperken. Hardware gecontroleerde continue focus systemen werken goed voor time-lapse microscopie en het verbeteren van de snelheid, waardoor meer posities af te beelden of een hoger percentage van de overname. Echter, zijvertrouwen op detectie van lucht-glasgrensvlak en kunnen focus van het monster verliezen met variaties in glasdikte in de put.
  4. Vervang de helft van de media met media die de gewenste geneesmiddelconcentratie die is verwarmd tot 37 oC Gedeeltelijke vervanging media helpt om thermische drift te verminderen. De omstandigheden in dit experiment zijn Vehicle (DMSO), 1 uM selinexor en 10 uM PD0332991.
    Opmerking: Deze stap kan ook na het starten van de overname door onderbreken en opnieuw starten van de proef. Dit maakt lengterichting volgen van pre- en post-drug reacties van enkele cellen. Als geneesmiddel stabiliteit of metabolisme is een zorg, pauzeren en vervangen van de media kan met dezelfde methode. Om te testen voor drug afbraak of metabolisme, media van behandelde cellen kunnen zich ook bevindt op naïeve cellen geplaatst om drug actie te testen.
  5. Start de time-lapse.
  6. Als de time-lapse loopt, ervoor te zorgen dat de afgebeelde velden in focus en de chambe blijvenr handhaaft een vochtige 37 o C.
    1. Pas de scherpstelling zo nodig door het pauzeren van de overname gedurende de tijd tussen tijdstippen.
  7. Indien nodig, voeg water toe tot de kamer tijdens langere experimenten. Vermijd het koelen van de kamer door het toevoegen van voorverwarmde, steriel gedestilleerd water bij 37 o C.

8. Het beëindigen van de Time-lapse

  1. Wanneer het experiment is uitgevoerd voltooid, stoppen de overname als deze niet is ingesteld op automatisch stoppen.
  2. Zorg ervoor dat de time-lapse de juiste manier is opgeslagen op de harde schijf, hoewel de meeste software pakketten automatisch op te slaan tijdens de overname zo niet klaar met de juiste gegevens verloren kunnen gaan.
  3. Verwijder de kamer van de microscoop en gooi de cellen in biologisch gevaarlijk afval volgende goedgekeurde institutionele bioveiligheid procedures.

9. Longitudinal Tracking en analyse van Time-lapse gegevens

  1. Kies de methodologie voor de analyse die iseigenen voor de biologische processen van belang. Veel plugins voor ImageJ, programma's met behulp van Matlab, en aangepaste platforms zijn geproduceerd voor specifieke toepassingen. De volgende methode omvat het volgen van kernen en analyse van nucleaire fluorescente probes zoals aangetoond in figuren 4 en 5.
  2. Open de .tif beeld stacks voor de gebruikte kanalen in ImageJ. Als alternatief geopend oorspronkelijke bestanden uit de overname programma rechtstreeks in ImageJ met de Bioformats plugin.
  3. Teken een regio van belang (ROI) binnen de kern van een cel met behulp van beeld helderveld of de nucleaire label kanaal (indien gebruikt) en voeg deze toe aan de ROI manager. Opmerking: Als de afgebeelde cellen een nucleaire label (bijvoorbeeld histon H2B-EGFP.), Vervolgens automatisch cell tracking worden toegepast om gebieden van belang (ROI) die individuele kernen maken door de tijd.
  4. Ga door naar de volgende keer punt en de positie van de ROI binnen dezelfde nucleus. Voeg de ROI van de ROI manager.
  5. Deze volgen en te ROI voor de individuele cel totdat een cellulaire gebeurtenis (mitose, apoptose, enz.) Of de cel kan niet meer worden gevolgd (bijv., Beweegt van frame of het experiment is beëindigd).
  6. Wanneer ROI vastgesteld voor cellen door de tijd dat ze in het veld, op elkaar leggen op de fluorescerende kanalen van belang. Meet de gemiddelde intensiteit van de fluorescentie in elk kanaal voor elk tijdstip. Sla de ROI lijst voor later gebruik.
    1. Verschillende metingen kunnen worden gedaan binnen de ROI voor toepassingen in verschillende experimenten. Klik Analyse → Set Metingen ... om een menu te brengen tot de analytische methode te kiezen (bijv., Gemiddelde intensiteit binnen de ROI, geïntegreerde intensiteit, enz.).
  7. Opmerking cel lot voor individuele cellen (bijv., Apoptose, afdeling, overleving), terwijl het bijhouden van. Dit maakt het mogelijk voor de oprichting van de overleving bochten en further populatie-analyse.
  8. Met de gemiddelde intensiteit voor beide kanalen, maakt u een scatterplot te celcyclus dynamiek weer te geven in reactie op Therapeutics (Figuur 5B, C).
    Noot: Plots kan worden gemaakt voor individuele cellen in de tijd gemiddeld over een of populatie van cellen gevolgd. Kwantitatieve beeldvorming kan kritisch voor het vaststellen van complexe reacties en cel verhoudingen als reactie op kanker therapeutische middelen. Langdurig time-lapse microscopie longitudinale tracking en hierbij zijn een meerstaps proces met vele mogelijkheden voor het type microscopie en analyse, en volgt de hoofdlijnen gegeven in Figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lange-termijn time-lapse microscopie en directe longitudinale tracking kan voor de studie van veel anti-kanker effecten tijdens drug reactie. Volgens de algemene schets in figuur 1, worden meerdere voorbeelden van cellen weergegeven expressie gevalideerd fluorescente reporters die behandeld met anti-kankergeneesmiddelen, gevolgd en geanalyseerd met behulp van verschillende methoden.

Fasecontrastmicroscopie all...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voordelen van de Time-lapse Microscopie en Longitudinal Tracking

De microscoop is een ideaal instrument voor longitudinale studies van geneesmiddelrespons omdat hiermee onderzoekers individuele cellen en hun lot en de gehele populatie te volgen. Variabiliteit in drug antwoord binnen een populatie van cellen is een groot probleem voor anti-kanker therapeutische design. Longitudinaal volgen van enkele cellen kunnen onderzoekers deze variabiliteit observeren en beginnen de onde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Joshua Marcus voor technische ondersteuning en Jolien Tyler, Ph.D., directeur van de Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, voor technisch advies. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de University of Colorado Boulder en de University of Colorado Boulder Graduate School aan J.D.O. R.T.B. wordt gedeeltelijk ondersteund door een pre-doctorale opleidingsbeurs van de NIH (T32 GM008759). We danken Karyopharm Therapeutics, Inc. voor selinexor en Merck Serono voor Kinesin-5-remmer. FUCCI-plasmiden zijn afkomstig van Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was afkomstig van Addgene. HeLa die H2b-mCherry en β-tubulin-EGFP tot expressie brengen, zijn afkomstig van Daniel Gerlich (IMBA, Oostenrijkse Academie van Wetenschappen, Oostenrijk).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Taxol (paclitaxel)SigmaT7191microtubule stabilisatiemiddel
EtoposideSelleckchemS1225topoisomerase II-remmer
SelinexorKaryopharm TherapeuticsnaXPO1/CRM1-remmer, geschenk
Kinesin-5-remmerMerck Serononageschenk, ook verkrijgbaar bij American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
CelgroeimediumHyClone (Fisher) of Mediatechveel bedrijven beschikbaar
5% CO2/luchtbalans, gecertificeerdAirgasZ03NI7222004379
35 mm Schaal, 20 mm glazen bodemCellvisD35-20-1.5-Nveel bedrijven beschikbaar
35 mm 4-welp Schaal, 20 mm glazen bodemCellvisD35C4-20-1.5-Nveel bedrijven beschikbaar
35 mm Schaal, rasterglazen bodemMatTekP35G-2-14-CGRDveel bedrijven beschikbaar
Multi-well, glazen bodemCellvisP12-1.5H-Nveel bedrijven beschikbaar
Olympus IX81 omgekeerde epifluorescentiemicroscoopOlympus
Olympus IX2-UCB controllerOlympus
PRIOR LumenPro200Prior ScientificLumen200PRO
PRIOR Proscan III gemotoriseerde standaardPrio ScientificH117
STEV-kamerInVivo ScientificSTEV.ECU.HC5 STAGE TOP
OmgevingsregeleenheidInVivo ScientificSTEV.ECU.HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD met controllerHamamatsuC10600
Nikon Eclipse TiNikon
Nikon laserlanceringNikon
SOLA lichtmotorlumencor
iXon Ultra 897 EM-CCDANDOR 
TOKAI HIT incubatiekamerTOKAI HITTIZSH

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
  2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
  3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
  4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. , Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
  5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
  6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
  7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
  8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
  9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
  10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
  11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
  13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
  14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
  17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
  18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
  20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
  21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
  22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
  23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
  24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
  25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
  26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
  27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
  29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
  32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
  33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
  34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391(2015).
  35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
  36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
  38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
  39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
  40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
  41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
  42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
  43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
  44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
  45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
  46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
  47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
  49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
  50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
  51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
  53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
  54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tracking van individuele cellenHT1080 cellenmilieukamerfluorescerende biosensorenanalyse van celgroeichromosoomdynamiekDNA schadeceldood

Gerelateerde artikelen