Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54018

⸱

23 augustus 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Samenvatting

Epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) beschrijft het proces van epitheel transdifferentiating in mesenchym. EMT is een fundamenteel proces tijdens de embryonale ontwikkeling die ook voorkomt bij glioblastoma, de meest voorkomende kwaadaardige hersentumor. EMT is ook waargenomen in meerdere carcinomen buiten de hersenen waaronder borstkanker, longkanker, darmkanker, maagkanker. EMT is centraal verbonden met maligniteit door het bevorderen migratie, invasie en metastasering. De mechanismen van EMT inductie zijn niet volledig begrepen. Hier beschrijven we een in vitro systeem voor gestandaardiseerde corticale isoleren van neurale stamcellen (NSC's) en daaropvolgende EMT-inductie. Dit biedt de flexibiliteit om hetzij enkele cellen of explantaatkweek gebruiken. In dit systeem, rat of muis embryonale voorhersenen NSC's gekweekt in een gedefinieerd medium zonder serum en enzymen. De NSCs uitgedrukt Olig2 en Sox10, twee transcriptiefactoren waargenomen in oligodendrocYTE precursorcellen (OPC). Met behulp van dit systeem, interacties tussen FGF-, BMP en TGF-signalering waarbij Zeb1, Zeb2 en Twist2 waargenomen, waar TGF-activering aanzienlijk verbeterd cel migratie, hetgeen duidt op een synergetische BMP / TGF-interactie. De resultaten wijzen op een netwerk van FGF-, BMP en TGF-signalering te worden betrokken bij EMT inductie en onderhoud. Dit modelsysteem is relevant EMT in vitro. Het is kostenefficiënt en geeft hoge reproduceerbaarheid. Het staat ook voor de vergelijking van verschillende verbindingen met betrekking tot hun migratie reacties (kwantitatief afstandsmeting) en high-throughput screening van verbindingen voor het remmen of verbeteren EMT (kwalitatieve meting). Het model is dan ook zeer geschikt voor drug bibliotheken testen voor stoffen van invloed zijn EMT.

Inleiding

Gedurende verschillende stadia van embryonale ontwikkeling, epitheelcellen verliezen hun sterke hechting aan elkaar (bijv tight junctions) en het verwerven van een trekkende fenotype in een proces genaamd epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) 1. EMT is nodig voor de vorming van andere celtypen, zoals mesenchymale neurale cellen, een populatie die scheidt van de neuroepithelium 2. EMT is niet alleen essentieel tijdens embryonale stadia maar ook vereist in latere volwassen leven fysiologische processen in het volwassen organisme, zoals wondgenezing 3 en centraal zenuwstelsel (CNS) regeneratie handhaven demyeliniserende laesies 4.

Epitheliale tumoren is bekend dat EMT reactiveren als een initiatie stap voor de migratie, invasie en metastase, wat uiteindelijk leidt tot de progressie van kanker 1,3. EMT inderdaad centraal gekoppeld aan een sterke migratie 1,3. De cellulaire stappen conditioning, initiëren, ondergaan en onderhouden van EMT niet volledig begrepen en moet verder onderzoek.

Hier wordt een gestandaardiseerde in vitro modelsysteem EMT basis van NSC, met gedefinieerde groeifactoren en media (geen serum en geen enzym gebruik) gepresenteerd. Dit model systeem van belang is voor wetenschappers die werken aan EMT. De Slak, Zeb en Twist eiwit families is aangetoond van cruciaal belang voor EMT, zowel in ontwikkeling en ziekte 1 te zijn. De Slak, Zeb en Twist families zijn ook betrokken bij de gepresenteerde systeem. Het systeem is gebaseerd op een bepaalde regio van de voorhersenen die normaal ondergaat EMT verschaffen van een bijzonder voordeel voor de studie van begingebeurtenissen gedurende EMT inductie.

Het modelsysteem zou kunnen worden toegepast op EMT in epithelia buiten het CZS te bestuderen, aangezien belangrijke EMT inductoren, zoals de slak, en Zeb Twist eiwitten, zijn gedurende EMT in weefsel dat zich buiten het CZS. Dit model system laat de gestandaardiseerde isolatie van NSCs uit de ontwikkelingslanden cortex om stamcellen functies in het algemeen en EMT in het bijzonder te bestuderen. Met dit systeem geïsoleerde we NSC geïnduceerde EMT en bestudeerden de daaropvolgende migratie onder invloed van FGF2 en BMP4. We zagen dat FGF- en BMP-signalering interageert met TGFp-signalering naar cel migratie te bevorderen, waardoor de validatie van het model systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke procedures volgden de 'Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren' (NIH publicatie, 8e editie, 2011) en goedgekeurd door de Animal Welfare Comité van Basel (Zwitserland Richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van dieren). Door deze richtlijnen het dier protocol wordt beschouwd van de "laagste dierlijke ernstgraad".

1. Bereiding van Expansion Medium

Opmerking: Het werk in aseptische omstandigheden als standaard voor de weefselkweek.

  1. Neem twee 15 ml buisjes en voeg 5 ml L-glutamine-vrij DMEM / F12 (1: 1) van een 500 ml medium fles in elk van de twee 15 ml buisjes. Om de eerste buis van 15 ml, voeg 50 mg humane apo-transferrine, 50 pi putrescine 1 M voorraad (0,1 mM uiteindelijke concentratie) en 30 pi van natrium selenium 500 uM voorraad (eindconcentratie 30 nM).
    1. Filteren door middel van een 0,2 um spuit filter in de originele DMEM / F12 fles.
  2. Om de tweede buis van 15 ml, voeg 12,5 mg insuline. Toevoegen6-9 druppels 1 M NaOH. Vortex voor insuline volledig op te lossen. Filteren door middel van een 0,2 um spuit filter in de originele DMEM / F12 fles.
    Let op: NaOH is giftig en bijtend. Gebruik beschermende handschoenen, jas, en een veiligheidsbril.
  3. Voeg 5 ml penicilline (10.000 eenheden / ml) / streptomycine (10.000 ug / ml) / amfotericine B (25 ug / ml) aan de DMEM / F12 medium fles.
  4. Voeg 5 ml 200 mM L-glutamine voorraad vers ontdooid of oligopeptiden die glutamine (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) aan de DMEM / F12 medium fles.
  5. Goed schudden. Bereid 50 ml aliquots.
    Opmerking: Expansion medium kunnen worden opgeslagen gedurende ten minste 2 weken bij 4 ° C. Porties verdeeld buizen vertoon minder pH veranderingen ten opzichte van medium in 500 ml flesjes bewaard.

2. Voorbereiding van de Passage Medium

  1. Om 1 L Ca 2 + - en Mg 2 + -vrij HBSS media, voeg 990,85 mg Glucose (5 mM uiteindelijke concentratie) en 840,10 mg NaHCO3 (10 mM uiteindelijke concentratie). Stel de pH tot 7,3 met HCl (1 M voorraad). Filter steriliseren met 0,2 urn filter en maak 50 ml aliquots.
    Opmerking: passage medium kunnen worden opgeslagen gedurende ten minste 4 weken bij 4 ° C.

3. Bereiding van groeifactoren

  1. Bereid steriele 1x PBS met 1% BSA (PBS-BSA) alleen of met zoutzuur (HCl) en 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Let op: HCl is bijtend en giftig en vereist speciale veiligheidsmaatregelen (jassen, bril, handschoenen, afzuigkap).
  2. Los 10 gg / ml recombinant humaan fibroblast groeifactor 2 (rhFGF2) in PBS-BSA (10 ng / ml eindconcentratie), 10 ug / ml recombinant humaan botmorfogenetisch eiwit 4 (rhBMP4) in PBS-BSA (10 ng / ml uiteindelijke concentratie), en 20 ug / ml recombinant humaan transformerende groeifactor ß 1 (rhTGFβ1) in PBS-BSA-HCl (40 ng / ml uiteindelijke concentratie).
    1. Heeft steriliseren niet filteren. Bereid hoeveelheden.
      Opmerking: Groeifactor monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C gedurende ten minste 2 jaar.

4. Coating van celcultuurschalen

  1. Ontbinding 1875 mg poly-L-ornithine (PLO) in 500 ml gedestilleerd H2 O een 250x PLO voorraad te bereiden. Filter steriliseren onder toepassing van een 0,2 urn spuitfilter en maak 2 ml aliquots.
    Opmerking: Deze monsters kunnen gedurende ten minste 2 jaar worden opgeslagen bij -20 ° C.
  2. Los 1 mg bovine fibronectine in 1 ml steriel gedestilleerd H 2 O tot 1000x fibronectine voorraad bereiden. Niet vortex als dit de kleverige eiwit kan stollen. Schud voorzichtig met de hand gedurende 10 min.
    1. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder af en toe schudden. Controleer op volledig oplossen. Verwarm de oplossing tot minder dan 37 ° C voor de volledige oplossing van fibronectine. Niet filteren-steriliseren.
      Opmerking: De oplossing kan maximaal 6 maanden worden bewaard bij 4 ° C.
  3. Gebruik plasma voorbehandelde plastic celcultuurschalen (100 mm of andere formaten zoals vereist voorhet experiment). Om migratie te beoordelen, gebruiken 35 mm gerechten met 500 urn rooster. Incubeer overnacht schotels met 2 ml 1x PLO 12 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 weefselkweek incubator. Was tweemaal met 2 ml 1x PBS.
  4. Voeg 2 ml 1x fibronectine (1 ug / ml eindconcentratie) en incubeer gerechten gedurende ten minste 12 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Fibronectine verwijderen net voor het uitplaten van de cellen.
    Opmerking: fibronectine beklede schalen worden opgeslagen gedurende ten minste 2 weken bij 37 ° C.

5. Gestandaardiseerde Dissection en voorbereiding van de corticale subventricular zone (SVZ)

  1. Verkrijgen van rat embryonale dag 14,5 (E14.5, Sprague-Dawley) en muis E13.5 (C57BL / 6) embryo's door getimede-paring. Mate dieren van 18:00 tot 08:00 uur de volgende ochtend. 'S middags na de dag van de paring wordt beschouwd E0.5.
  2. Verdoven de zwangere dier met 5% isofluraan en 0,8 l / min zuurstof flow. Controleer reactie van poot compressie met scherpe dissectie tang. Onthoofden het dier. Vermijd CO 2 stikken als CO 2 beïnvloedt stamcel herstel.
  3. Ophalen embryo's door een keizersnede.
    1. Plaats dier in liggende positie en desinfecteren bont met 70% ethanol. Gebruik chirurgische pincet en schaar V-vormige incisie van ongeveer 8 cm te maken in de onderbuik boven de baarmoeder. Incise alleen de huid met bont terwijl gespierde muren intact.
    2. Gebruik verse pincet en een schaar om de spieren en de buik- spierwand incise om het buikvlies in te voeren.
    3. Identificeer de baarmoeder in de onderste achterste buikvlies. Verwijder de baarmoeder door scherpe scheiding van de omringende weefsels.
    4. Was de baarmoeder met embryo's met steriel 1x PBS en plaats in ijskoude 1x PBS.
    5. Gebruik fijne punt schaar om de baarmoeder muren te openen om embryo's vrij te maken door embryo onder een dissectie microscoop (3x vergroting, figuur 1B). Gebruik een pincet om de embryonale rompen verwijderen ( Figuur 1B). Houd embryo's in de uitbreiding medium op ijs.
    6. Controleer of de juiste ontwikkelingsstadium door de Atlas van de ontwikkelingslanden Rat Nervous System 5. De embryo juiste grootte wordt getoond in Figuur 1B.
    7. Controleer de juiste leeftijd verder door de aanwezigheid van beginnende vorming cijfer bij ratten voorpoot (FL) zoals weergegeven in figuur 1A.
      Opmerking: Het achterste been (HL) maakt scheiding cijfer (Figuur 1B) nog niet vertonen.
  4. Voor dissectie, transfer embryo ongecoate petrischalen gevuld met ijskoude 1x PBS. Voer dissectie onder een stereo dissectie microscoop (3x tot 20x vergroting) met behulp van een autoclaaf fijn pincet.
    Opmerking: De Petrischalen voorkomen hechting van weefsel om de schotel oppervlak kan gebeuren met plasma bekleed celcultuurschalen. Wolfraamdraad geslepen naalden en dergelijke kunnen ook nuttig voor bepaalde stappen van dissectie.
  5. Verwijder de hoofdhuid en de schedel te beginnen bij de intersection van de ontwikkeling telencephalon (TEL) en diencephalon (DI) (Figuur 1B) door gelijktijdig ventraal en dorsaal met twee tang trekken om toegang tot de zich ontwikkelende neurale buis (figuur 1C) te verkrijgen.
  6. Identificeer de middenhersenen-achterhersenen-grens (MHB, zwarte pijlpunt in Figuur 1B-D), het scheiden van het mesencephalon (MES) vanaf het rhombencephalon. Snijd de rhombencephalon net op of onder de MHB (figuur 1D, driehoekige pijl).
    Opmerking: De extra subcutane ruimte bij de MHB vergemakkelijkt verwijdering huid zonder nadelige gevolgen voor de neurale buis.
  7. Verbreken de verbinding tussen de telencephalon / diencephalon aan de schedelbasis met het gezicht skelet (figuur 1E). Dit resulteert in een blok met het telencephalon, diencephalon en mesencephalon (TEL-DI-MES) (figuren 1F-H).
  8. Breng de TEL-DI-MES blok in uitbreiding medium op ijs. Keep it completely bedekt met uitbreiding medium in een niet-gecoate petrischaal. Houd het blok aan het mesencephalon met een pincet aan raak de telencephalon de corticale SVZ met NSC bevat.
  9. Herhaal stap 5,5-5,8 alle embryo's (Figuur 1F-H).
  10. Transfer een TEL-DI-MES te blokkeren in de frisse ijskoude 1x PBS. Snijd langs de stippellijn in de voorste mesencephalon (Figuur 1F-H), scheiden van het mesencephalon van het diencephalon, zie figuur 1I.
  11. Scheid de DI van de TEL door te snijden langs de stippellijnen in figuur 1F. Zie geïsoleerde telencephalon in figuur 1J.
  12. Splits de twee hersenhelften telencephalic, snijden langs de gestippelde lijn in figuur 1J. Dit resulteert in twee afzonderlijke helften zie figuur 1K.
    Opmerking: de linker hersenhelft wordt uitvergroot in figuur 1L.
  13. Identificeer de mediale bendelionic eminenties (MGE, figuur 2A; *) en laterale ganglion grootheden (LGE, figuur 2A; +) zichtbaar door de toekomst foramen interventriculare.
    1. Met behulp van een tang of naald, ontleden langs een rechte lijn op de kruising tussen de MGE en LGE en de voorste cortex (ant-CTX, Figuur 2B). Snijd een rechte lijn door cortex, hippocampus (heup) en choroid plexus (CP). Dit scheidt de anterieure cortex inclusief de bulbus olfactorius (ob) vanaf het ganglion grootheden (GE, figuren 2B, C).
  14. Snijd een tweede rechte lijn op de kruising van de caudale ganglion eminence (CGE, figuur 2C, D) en het achterste cortex (figuur 2C), opnieuw snijden door cortex, hippocampus en choroid plexus.
  15. Plat uit het telencephalon. Volledig verwijderen van de achterste paal en de olfactorische bulb (figuur 2D). Identificerenhet corticale zoom die de hippocampus en de choroid plexus (figuur 2C), zoals eerder gedefinieerd 6,7.
    Opmerking: De hippocampus is een dunnere neuroepithelium dan de cortex. De CP bevat rode vaartuigen.
    1. Scheid de corticale zoom van de cortex, waardoor de grootte van de cortex identiek aan de grootte van de ganglion grootheden (figuur 2D). Dit resulteert in een blok van de cortex (het doelweefsel) en de ganglion grootheden (GE figuur 2D).
  16. Flip de cortex-GE blok met de ventriculaire (binnen) kant van de schotel oppervlak.
    Opmerking: Het buitenoppervlak van de hemisfeer de experimentator (figuur 2E) geconfronteerd. Op het buitenoppervlak is de bloed- vat dat meninges (figuur 2E).
    1. Speld de GE om de schotel oppervlak met de linkerhand en schil de hersenvliezen met een pincet in de juiste (dominant) met de hand (zie figuur 2F ).
      Let op: Dit is de technisch meest veeleisende stap, omdat de meningen sterk hechten aan de cortex. De scheiding van hersenvliezen van de cortex wordt vergemakkelijkt door het snijden van een volledig rechte lijn (niet gekarteld) in stappen 5.13.1 en 5.14.
  17. Herhaal stap 5,12-5,16 de andere halfrond alle embryo. Snijd de cortex langs de LGE op een afstand van de halve diameter van de belangrijkste LGE (figuur 2G, 2H). De ontleed cortex beslaat een oppervlakte van 1,2 mm x 2,4 mm (figuur 2H) en omvat de SVZ / germinal laag met de NSC.

6. Bereiding van explantkweken

  1. Snijd de cortex in explantaten van minder dan 400 urn diameter (figuur 2I). Gebruik een 400 pm rooster (aanvullende figuur 1) onder de dissectie petrischaal geplaatst voor de referentie (figuur 2H en 2I). Breng alle explantaten in een frisse petrischaal met ijs-cold expansie medium.
  2. Verwijder het fibronectine uit een weefselkweek schotel (stap 4.4). Laat ze drogen. Voeg 1 ml koude expansie medium naar het midden van de 35 mm schaal met rastermaat van 10 mm x 10 mm (figuur 3). Het medium laten een bolvormige druppel (figuur 3) te vormen.
  3. Plaats maximaal 8 explantaten naar het midden van de druppel. De explantaten moet idealiter worden gevestigd op de grid met minstens 3 mm afstand tussen elkaar voor de migratie-analyse (zie paragraaf 8).
  4. Incubeer de schaal gedurende ongeveer 1 uur in een celkweek incubator (37 ° C, 21% O2, 5% CO 2) voor bevestiging van de explantaten. Laat de explantaten om zich te vestigen en hechten aan de fibronectine gecoate oppervlak. Niet schudden het gerecht, omdat de explantaten kan los te maken en uit te gaan van de optimale rooster centrum.
  5. Na 1 uur incubatie (37 ° C, 21% O2, 5% CO2), vul de schaal tot een totaal volume van 2 ml medium met de expansie groei facteurs of stoffen die van belang zijn voor testen en te broeden.
    Opmerking: Noch enzymatische digestie, of serum of centrifugatie die nodig zijn voor explantatie bereiden zijn. Dit is optimaal voor celintegriteit.

7. Voorbereiding van de NSC Single Cell Culture

  1. Warmen expansie en passage van medium bij 37 ° C.
  2. Breng de ontleed cortex stukken (uit stap 5.17) in een 15 ml buis met koude expansie medium (tube A). Centrifugeer de cortex stukken voor 5 min bij 1200 x g. Zuig het supernatant. Voeg 200 ul voorverwarmd medium expansie naar de cortex stukken resuspenderen.
  3. Voeg 700 ul voorverwarmde passages medium aan de 15 ml buis met een P1,000 uiteinde (buis A). Voorzichtig resuspendeer de pellet. Plaats het uiteinde onder aan de 15 ml buis. Voorzichtig en langzaam te distantiëren van het weefsel stukken van uitzuigen drie keer met de P1,000 tip.
    Opmerking: Passage medium bevordert celscheiding en vereist het gebruik van enzymen voorkomen.
  4. Laat de buis zitten 30 tot 60 seconden voor grotere (zwaardere) gedissocieerde stukken bezinken op de bodem. Één gedissocieerde cellen in het supernatant blijven. Breng ongeveer 700 pl van het supernatant naar een nieuwe 15 ml buis (tube B).
  5. Herhaal de stappen 7,3 en 7,4 om de grotere stukken dissociëren.
  6. Herhaal stap 7.3 en 7.4 een tweede keer om de grotere stukken te scheiden. Breng alle bovenstaande aan de verse 15 ml buis (tube B).
  7. Voeg expansie medium tot een totaal volume van 5 ml. Aantal cellen met een hemocytometer. Beoordelen van dode cellen door trypan-blauw kleuring.
    Opmerking: Kleine NSC tolereren stappen 7,2-7,6 beter dan grotere cellen. Van 10 embryo's verwachten ongeveer 4 x 10 6 cellen met 10% dode cellen.
  8. Uitzetting van NSC, plaat 1,5 x 10 6 cellen per 10 cm met fibronectine beklede weefselkweekplaat in een volume van 8 ml medium expansie. Voor standaard uitbreiding, voeg 8 pi 1000x rhFGF2 voorraad. Voeg 8 ul rhFGF2 elke dag en veranderen media om de andere dag.
    Opmerking: De cortex in deze ontwikkelingsfase bevat een meerderheid van NSCs en slechts een minderheid van de gedifferentieerde cellen. De gedifferentieerde cellen minderheid niet reageren op de rhFGF2-behandeling en sterven tijdens de expansie cultuur.
  9. Passage geëxpandeerde NSC bij 60% confluentie.
    1. Om passage NSCs, verwijder uitbreiding medium. Was de cellen snel driemaal met 5 ml medium passage. Wacht 2-4 min. Zonder Ca 2 + en Mg 2 + de cellen langzaam los te maken van het oppervlak, oppakken. Controleer loslaten van cellen onder de microscoop fase. Wacht een paar minuten, indien nodig, totdat visuele loslating van het oppervlak waargenomen.
      Let op: Single cellen helemaal los, maar de meeste cellen zullen blijven aan de schotel oppervlak. De tijdsduur nodig voor onthechting afhankelijk van de duur van fibronectine coating. Een korte fibronectine coating (12 uur of minder) resulteert in een snellere mobiele onthechting. Voor langere experimenten (>; 1 week) fibronectine coating van meer dan 24 uur geadviseerd.
  10. Gebruik een 10 ml pipet voorzichtig los van de cellen van het oppervlak. Verzamel de passage 5 ml medium met cellen en overbrengen naar een verse 15 ml buis. Herhaal met 5 ml medium passage.
  11. Distantiëren de cellen in 15 ml buisje en neer te pipetteren drie maal, het plaatsen van de 10 ml pipet op de bodem van de buis. Spin de buis gedurende 15 minuten bij 1200 xg bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 ml medium expansie. Aantal cellen met een hemocytometer. Gebruik trypan blauw om dode cellen te beoordelen.
    Opmerking: Na expansie tot 60% confluentie verwachten 4-5 x 10 6 cellen met dode cellen op ongeveer 10%.
  12. Plaat 8 x 10 5 cellen per 10 cm schotel voor verdere passages.

8. Migration Assessment

  1. Voor migratie assessment, isoleren explantaten volgens hoofdstuk 5. Seed de explantaten in35 mm raster gerechten. Een uur na plating, voeg FGF2 (rhFGF2). De schaaltjes worden in een 37 ° C incubator gedurende 2 dagen.
    Opmerking: Voor een optimale explantaat bevestiging, vermijd het verplaatsen van de gerechten.
  2. Verwijder medium door 1.000 III tip. Voeg 2 ml medium expansie van 1000 gl punt vanaf de binnencirkel (figuur 3). Dit vermindert de oppervlaktespanning op explantaten.
  3. Voeg groeifactoren alleen of in combinatie zoals vereist voor experiment. Gebruik FGF2 / BMP4 / TGFB1 als een positieve controle. Opmerking: In dit experiment werden 2 pi FGF2 per 35 mm schaal, 2 pl BMP4 en 4 pl TGFB1 alleen en in combinatie (figuur 5) toegevoegd.
    1. Voeg extra factoren en / of toetsbaar stoffen. Houd gerechten weer onaangeroerd gedurende 2 dagen bij 37 ° C.
  4. Neem foto's van de explantaten op een omgekeerde microscoop.
    Opmerking: Living explantaten op een betere fase contrast beelden dan vaste cellen. Beide kunnen worden gebruikt.
  5. voor de migratieassessment, gebruik dan een grafische software die pixel metingen mogelijk maakt (bv, Fiji 8).
  6. Meet de schotel raster van 500 pm afstand in pixels en gebruik het als interne referentie.
  7. Bepaal het midden van het explantaat migratie startpunt. Meet de afstand tussen het middelpunt van het explantaat en de buitenste groep 10 cellen.
    Let op: Alle cellen migreren centrifugaal weg van het explantaat. Ze vormen spontaan een vel aan de omtrek onder de geteste omstandigheden (Figuur 5).

9. Invasion Assessment

  1. Bereid met fibronectine gecoate weefselkweek 24-well platen volgens protocol afdeling 4.
  2. Plaats 300 ul warm expansie medium in de top put van cel invasie kamers. Incubeer de kamers gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
  3. Verwijder het medium expansie van de bovenste wellen en plaats de Boyden-kamer in de gecoate 24-well plaat.
  4. Voeg 500 ul warm expansie medium met 0,5 pi rhFGF2 en 0,5 ul rhBMP4 naar de bodem ook.
  5. Passage NSCs en tel zoals beschreven in paragraaf 7. Passages 1-4 zijn geschikt.
  6. Plaat 5 x 10 5 cellen in een volume van 300 pl warm expansie medium met 0,3 gl rhFGF2 en 0,3 pl van rhBMP4 in de bovenste put van de Boyden-kamer.
  7. De cultuur van de gezaaide NSCs gedurende 24 uur.
  8. Voeg extra factoren en / of testbaar stoffen aan de kamer en kweken van de cellen gedurende nog 48 uur.
    Opmerking: Als de cellen invasief, zullen ze gaan van de bovenste wellen door het basaal membraanlaag naar beneden ook. Invasieve cellen vasthouden aan de bodem van de Boyden-kamer.
  9. Volg het protocol van de fabrikant. Wattenstaafjes (bij de invasie assay kit) aan de niet-invasieve cellen in de bovenste wellen verwijderen door reinigen tweemaal.
  10. Verwijder het medium uit de putjes en voeg 500 ul medium met expansieeen plasmamembraan kleuring van levende cellen en met de nucleaire kleurstof DAPI aan de putjes.
  11. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
    Opmerking: De kleurstoffen te integreren in het membraan en de kern van de invasieve cellen, respectievelijk voor optimale visualisatie 8. Optie: weglaten plasmamembraan kleurstof als multicolor immunocytochemie is gepland.
  12. Verwijder het medium met de kleurstoffen en tweemaal wassen met groei medium. Visualiseren en tellen invasieve cellen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop zoals eerder 8 getoond.
    Opmerking: Sommige invasieve cellen kunnen uit de bodem van de kamer zijn losgemaakt en zijn gedaald tot het bronoppervlak hieronder waar zij zich aan de beklede oppervlak. Voor volledige analyse omvatten de cellen op het putoppervlak.
  13. Verwijder het medium en vast de cellen in ijskoude vers 4% PFA gedurende 10 min. Wash 3x met 1x PBS. Voeren immunocytochemie invasieve cellen, zoals eerder beschreven 8-10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit EMT model is gebaseerd op de gestandaardiseerde isolatie van NSC zowel als enkele cellen of als explantaten van een specifiek gebied van de ontwikkeling van neurale buis, de centrale cortex (figuren 1 en 2). Voor kwantitatieve beoordeling werden explantaten geënt exact in het midden van een 500 urn rooster kweekschaal (figuur 3). Explantaten van de centrale cortex werden eerst blootgesteld aan FGF2 twee dagen, gevolgd door twee extra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie gestandaardiseerd systeem voor EMT analyse gebruik NSC is beschreven (samengevat in aanvullende figuur 3). De reproduceerbaarheid Standaardisatie (Tabel 1 en 2). De NSCs zijn afgeleid van de ontwikkeling cortex, een weefsel dat normaliter EMT niet ondergaat. Dit is van voordeel voor de analyse van de eerste stappen in EMT. Eerste stappen in EMT kan niet voldoende worden bestudeerd in tumorcellen die genetische veranderingen hebben opgebouwd en kunnen al EMT kenmerken vast...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De studie werd ondersteund door de Universiteit van Basel Science Foundation en de Zwitserse National Science Foundation door een subsidie ​​aan MHS en AG (SNF IZLIZ3_157230). Wij danken: Dr. Tania Rinaldi Burkat voor royaal verstrekken van infrastructuur; alle leden van de Bettler groep voor discussies en commentaar. Wij danken Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Zwitserland) voor de professionele en deskundige installatie van de Full HD MC170 videocamera (Leica Microsystems, Zwitserland).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BMP4, rhBMP4RnD Systems 314-BP-01M
Bovine pancreas insulinSigma I1882
Boyden chamber, CytoSelect cell invasion assayCell BiolabsCBA-11024 well plate systeem
Cell culture dish with gridIbidi 500 mm dish, 35 mm80156
CellMask OrangeLife TechnologiesC10045Plasma membraandkleurmiddel, gebruik op 1:1.000.
DAPILifeTechnologiesD1306Voorraad bij 5 mg/ml. Gebruik op 1:10.000. Kankerverwekkend. Passende bescherming (handschoenen, jas, veiligheidsbril) vereist.
DMEM/F12 1:1 medium bottleGibco Invitrogen21331-020
FGF2, rhFGF2RnD Systems233-FB-01M
Fibronectine, bovineSigma F4759
Glutamax supplement Gibco Invitrogen 35050-061
Graphics software with pixel measurement featureFijifiji.sc/Fijiversie 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS mediaSigma H9394
Human apo-TransferrinSigmaT1147Mogelijk longirriterend. Inademing vermijden. Gebruik geschikte bescherming.
L-glutamineGibco Invitrogen 25030-024
Nestin, Mouse anti Nestin antibodyGenetexGTX26142Gebruik op 1:100, 4% PFA fixatie, Triton X100 bij 0,1%
Olig2, Rabbit anti Olig2 antibodyVerstrekt door Hirohide TakebayashPersoonlijke voorraadGebruik op 1:2.000, 4% PFA fixatie, Triton X100 bij 0,1%
Penicillin/Streptomycin/FungizoneGibco Invitrogen 15240-062
Podoplanin, Mouse anti Podoplanin antibodyAcrisDM3614PGebruik op 1:250, 4% PFA fixatie, vermijd Triton X100
Poly-L-ornithineSigma P3655
PutrescineSigma P5780Huid- en oogirriterend. Passende bescherming vereist.
Sodium seleniteSigma S5261
Sox10, Rabbit anti Sox10 antibodyMillipore ChemiconAB5774Gebruik op 1:200, 4% PFA fixatie, Triton X100 bij 0,1%
TGFb1, rhTGFb1RnD Systems240-B-010
Uncoated Petri dishesFalcon Corning351029

Referenties

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14(2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763(2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

neurale stamcellenEMT-inductieexplantaatkweekcelmigratieTGF-bèta-signaleringBMP4-behandelingcorticale dissectiefibronectine-coatinghigh-throughputscreening
Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.