Hier beschrijven we een procedure voor het bestuderen van bevroren-gebarsten plantweefsels. Bladmonsters die op hoge druk zijn bevroren, worden bevroren-gebarsten en dubbel gecoat, waardoor goed bewaarde bevroren-gehydrateerde monsters ontstaan die worden afgebeeld met behulp van de cryo-scannen electronenmicroscoop op hoge vergroting met minimale stralingsschade.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cryo-scanning elektronenmicroscopie (SEM) van-freeze gebroken monsters maakt onderzoek naar biologische structuren op near native omstandigheden. We beschrijven een techniek voor het bestuderen van supramoleculaire organisatie van fotosynthetisch (thylakoid) membranen binnen bladmonsters. Dit wordt bereikt door hoge druk bevriezing van bladweefsel, vries-breken, double-layer coating en tenslotte cryo-SEM beeldvorming. Gebruik van een dubbele-bekleding werkwijze maakt het verkrijgen hoge vergroting (> 100,000X) met minimaal beam schade aan de bevroren gehydrateerd monsters en minimale effecten opladen. Met behulp van de beschreven procedures die we onderzoek gedaan naar de veranderingen in de supramoleculaire distributie van fotosysteem en lichte oogsten antenne eiwitcomplexen die plaatsvinden tijdens uitdroging van de opstanding fabriek Craterostigma pumilum in situ.
Inleiding
Oxygenic fotosynthese, van oorsprong uit het oude cyanobacteriën, werd overgenomen door algen en landplanten door endosymbiotic gebeurtenissen die hebben geleid tot de ontwikkeling van de chloroplast organel. In alle hedendaagse oxygenic fototroof zijn fotosynthetische elektronen transport en het genereren van proton-motive force en het verminderen van de macht binnen afgeplatte sac-achtige blaasjes zogenaamde 'thylakoid' membranen uitgevoerd. Deze membranen huis van de eiwitcomplexen die de light-driven reacties van fotosynthese uit te voeren en een medium voor energie transductie. De thylakoïdmembranen van planten en (sommige) algen worden onderverdeeld in ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cryo-fixatie van Leaf Tissues door Hogedruk Bevriezing
Opmerking: Dit deel beschrijft hoe uit te voeren onder hoge druk bevriezing van blad weefsels voor een freeze-fractuur experiment. Voor de overwegingen in verband met planten monsters te zien 29. Dit kan worden aangepast voor andere typen weefsels of monsters met enkele wijzigingen.
- Gebruik de hoek van een scheermesje, krassen op de bodem van de 0,1 mm holte van een 0,1 / 0,2 mm aluminium plaatjes (figuur 1). Maak minstens tien bloedplaatjes (6 monsters). Wees voorzichtig mes merken te creëren op de omtrek van de schijf.
- Na krabben, w....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont cryo-SEM beelden van plaatjes met hoge druk bevroren, bevriezen-gebroken Craterostigma pumilum blad stukken. In sommige monsters worden grote gebieden van gebroken cellen verkregen (Figuur 1A). In andere gevallen blijft het blad stuk strak gebonden aan de bovenste schijf en wordt geklopt met zich mee (Figuur 1B). Zelfs in het tweede geval kunnen sommige bladweefsel blijft vastzitten aan het mes groeven op de bloed.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De in dit document beschreven techniek maakt onderzoek gevries- gebroken membranen in de context van goed bewaarde hogedruk bevroren plantenweefsel door cryo-scanning elektronenmicroscopie. Het grote voordeel van het gebruik van deze procedures is dat de bereiding van de monsters is puur lichamelijk; geen stappen met chemische stoffen of uitdroging zijn noodzakelijk. Zo staat het bestuderen van biologische structuren op een near-native state 26,32. Het voordeel van bladweefsel is dat informatie over de totale.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken Andres Kaech (Universiteit van Zurich) voor zijn nuttig advies over het scannen van elektronen microscopie beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door de Verenigde Staten en Israël binationale Agricultural Research and Development Fund (verlenen no. US-4334-10, ZR), de Israel Science Foundation (verlenen nr. 1034/12, ZR) en het Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). De elektronen microscopie studies werden uitgevoerd bij de Irving Moskowitz en Cherna Center for Nano en Bio-Nano Imaging aan het Weizmann Institute of Science.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| Isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 Platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets zijn van 3 mm diameter en 0,5 mm dik (Type A) met 0,1/0,2 mm diepe holtes (met een diameter van 2 mm). Vergelijkbare platelets kunnen worden verkregen van Leica Microsystems. |
| High-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Zwitserland) Durostar stijl #5 pincetten; Kan worden vervangen door andere hoge precisie pincetten. |
| High-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatieven: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| Freeze-fracture systeem | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| Cryo voorbereiding laadstation | Leica Microsystems | 16770228 | |
| Specimen houder voor universele freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Klemhouder voor specimen carriers met een diameter van 3 mm |
| Vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| Scanning elektronenmicroscoop | Zeiss | Ultra 055 | |
| Cryo SEM-platform | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| Beeldverwerkingssoftware | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| Beeldanalysesoftware | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
Referenties
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Pro....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
