Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy

11.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54066

⸱

23 juni 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science, 2Department of Chemical Research Support, Weizmann Institute of Science, 3Institute of Plant Sciences, Agricultural Research Organization, Volcani Center

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een procedure voor het bestuderen van bevroren-gebarsten plantweefsels. Bladmonsters die op hoge druk zijn bevroren, worden bevroren-gebarsten en dubbel gecoat, waardoor goed bewaarde bevroren-gehydrateerde monsters ontstaan die worden afgebeeld met behulp van de cryo-scannen electronenmicroscoop op hoge vergroting met minimale stralingsschade.

Samenvatting

Cryo-scanning elektronenmicroscopie (SEM) van-freeze gebroken monsters maakt onderzoek naar biologische structuren op near native omstandigheden. We beschrijven een techniek voor het bestuderen van supramoleculaire organisatie van fotosynthetisch (thylakoid) membranen binnen bladmonsters. Dit wordt bereikt door hoge druk bevriezing van bladweefsel, vries-breken, double-layer coating en tenslotte cryo-SEM beeldvorming. Gebruik van een dubbele-bekleding werkwijze maakt het verkrijgen hoge vergroting (> 100,000X) met minimaal beam schade aan de bevroren gehydrateerd monsters en minimale effecten opladen. Met behulp van de beschreven procedures die we onderzoek gedaan naar de veranderingen in de supramoleculaire distributie van fotosysteem en lichte oogsten antenne eiwitcomplexen die plaatsvinden tijdens uitdroging van de opstanding fabriek Craterostigma pumilum in situ.

Inleiding

Oxygenic fotosynthese, van oorsprong uit het oude cyanobacteriën, werd overgenomen door algen en landplanten door endosymbiotic gebeurtenissen die hebben geleid tot de ontwikkeling van de chloroplast organel. In alle hedendaagse oxygenic fototroof zijn fotosynthetische elektronen transport en het genereren van proton-motive force en het verminderen van de macht binnen afgeplatte sac-achtige blaasjes zogenaamde 'thylakoid' membranen uitgevoerd. Deze membranen huis van de eiwitcomplexen die de light-driven reacties van fotosynthese uit te voeren en een medium voor energie transductie. De thylakoïdmembranen van planten en (sommige) algen worden onderverdeeld in twee afzonderlijke morfologische domeinen: strak appressed membraan regio genaamd 'grana' en gestapelde membranen die de grana met elkaar te verbinden, de zogenaamde 'stroma lamellen "1. Diverse freeze-fractuur studies van planten en algen thylakoïdmembranen zijn uitgevoerd, te beginnen in de vroege jaren 1970. Bij bevriezing gebroken, membranenverdelen langs hun hydrofobe kern 2, genereren van een exoplasmatische vlak (EF) en een protoplasma vlak (PF), afhankelijk van de cellulaire compartiment dat helft membraan grenzen, zoals oorspronkelijk bedacht door Branton et al. . in 1975 3 Plant en algen thylakoiden hebben vier verschillende breuk gezichten: EF, efu, PF en PFU, met een 's' en 'u' aanduiding 'gestapeld' en 'gestapelde' membraan regio's, respectievelijk. Het membraan eiwitcomplexen, die niet gesplitst of gebroken, hebben de neiging met ofwel de E of P zijde van het membraan blijft. De initiële observaties dat de verschillende breukvlakken van de thylakoiden bevatten deeltjes van verschillende afmetingen en dichtheden 4, en de talrijke onderzoeken die volgde, leidde tot de identificatie en correlatie tussen de waargenomen deeltjes en het membraaneiwit complexen die de lichtreacties uitvoeren 5-13 (beoordelingen zie ook 14,15).

Freeze-fractuur experimenten van thylakoïdmembranen worden gewoonlijk uitgevoerd over de voorbereidingen van de chloroplasten of geïsoleerde thylakoïdmembranen (maar zie 16,17), met het risico van een wijziging in de structurele en / of supramoleculaire organisatie die zich kunnen voordoen tijdens de isolatie procedure. Na breuk worden replica's bereid door verdamping van platina / koolstof (Pt / C), vervolgens een dikke laag koolstof (C), en tenslotte digestie van het biologische materiaal 18. Replica's zijn gevisualiseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). De traditionele freeze-fractuur-replica techniek blijft om te dienen als een belangrijk instrument voor het bestuderen van de supramoleculaire organisatie van de fotosynthetische membranen en hun aanpassing aan verschillende, bijv., Licht, condities 19-23.

In onze recente studie van de homoiochlorophyllous opstanding fabriek Craterostigma pumilum 24, we gericht op de veranderingen in de supramoleculaire organisatie o onderzoekenf thylakoïdmembranen, evenals de totale cellulaire organisatie gedurende dehydratatie en rehydratatie. Het unieke van homoiochlorophyllous opstanding soort is dat ze in staat zijn om de voorwaarden van uitdroging overleven in hun vegetatieve weefsels (bladeren), met behoud van hun fotosynthese-apparaat. Zodra water beschikbaar is, deze planten herstellen en hervatten fotosynthetische activiteit in uren tot enkele dagen 25. Voor dit onderzoek, cryo-EM scanning (SEM) beeldvorming van gevries- gebroken bladmonsters werd gecombineerd met hogedruk freezing sample cryo-immobilisatie. Deze procedures bieden een middel om de bevroren gehydrateerd biologische monsters te visualiseren in een staat dicht bij hun natieve toestand 26. Een belangrijk voordeel is dat de monsters direct na bevriezen-breuk en coating zonder verschillende stappen worden onderzocht. Dit is vooral relevant voor het onderzoek van planten op verschillende relatieve inhoud water (RWC), als hun hydratie toestand tijdens de bereiding wordt gehandhaafd. Hoeooit een belangrijke nadeel is dat bevroren gehydrateerd monsters tijdens beeldvorming kunnen lijden aan beam opleveren, met name wanneer gescand bij hoge vergrotingen, vereist voor nauwkeurige meting van de grootte van fotosynthetische complexen. Om dit te overwinnen, een methode genaamd 'double-layer coating' (DLC) 27,28 gecombineerd met specifieke cryo-SEM beeldvorming omstandigheden werden gebruikt. Deze resulteerden in monsters die zijn aanzienlijk minder beam-gevoelig en toegestaan ​​voor de opheldering van waardevolle informatie over fotosynthetische eiwit supramoleculaire organisatie en andere cellulaire bestanddelen van de opstanding fabriek C. pumilum bij hoge vergrotingen in situ.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cryo-fixatie van Leaf Tissues door Hogedruk Bevriezing

Opmerking: Dit deel beschrijft hoe uit te voeren onder hoge druk bevriezing van blad weefsels voor een freeze-fractuur experiment. Voor de overwegingen in verband met planten monsters te zien 29. Dit kan worden aangepast voor andere typen weefsels of monsters met enkele wijzigingen.

  1. Gebruik de hoek van een scheermesje, krassen op de bodem van de 0,1 mm holte van een 0,1 / 0,2 mm aluminium plaatjes (figuur 1). Maak minstens tien bloedplaatjes (6 monsters). Wees voorzichtig mes merken te creëren op de omtrek van de schijf.
    1. Na krabben, wassen schijven in absolute ethanol, laten drogen en bewaren op een schone schotel.
  2. Bereid de hoge druk bevriezing machine volgens de instructies van de fabrikant. Vul het hoge druk bevriezing machine alcohol kamer met isopropanol.
  3. Bereid een zelfgemaakte vacuüm bijgestaan ​​infiltration apparaat om gas te vinden in het blad weefsel met vloeibare vervangen.
    1. Aansluitbare verbinding een 200 ul pipetpunt het einde van een 10 ml spuit. Snijd ~ 1 cm van de tip. Maak een gat in de dop van een 1,5 ml microcentrifugebuis om strak de cut tip. Vacuüm kan in de buis worden gemaakt door aan de zuiger van de spuit.
  4. Snijd een klein stukje blad van de plant met behulp van een scheermesje en met een pincet plaatst het blad in een microcentrifugebuis half gevuld met 1-hexadeceen. Infiltreren in de intercellulaire ruimten van het blad met de vloeistof door zachtjes trekken van de zuiger om vacuüm te creëren, houdt ongeveer 30 seconden, en dan langzaam de zuiger los.
  5. Verwijder het blad stuk uit de buis met behulp van een pincet. Trim het blad met een scheermesje in geval is dikker dan 0,2 mm en snijd een klein stukje dat past in een bloedplaatjes.
  6. Plaats een schone bloedplaatjes met de bekraste kant naar boven in de houder van de bevriezing machine en plaats de cut stuk leaf in de bloedplaatjes. Vul de resterende ruimte rondom het blad met 1-hexadeceen. Sluit de sandwich met een andere plaatjes, met de krassen tegenover het blad.
  7. Sluit en draai de houder en steek hem in de kamer van de machine. Druk vervolgens op de 'Jet' knop te bevriezen (~ 2100 staven voor 300-500 msec), en snel de houder te zetten in vloeibare stikstof. Haal de bevroren sandwich uit de houder met behulp van pre-gekoelde pincet, het verzorgen van de sandwich niet te breken.
    Opmerking: Gesloten bevroren broodjes kunnen bevriezen gebroken onmiddellijk of bewaard in vloeibare stikstof voor later gebruik. Gebruik beschermende kleding en een veiligheidsbril bij het hanteren van vloeibare stikstof.

2. Freeze-breuk en Double-layer Coating 27,28

  1. Bereid de bevriezing breuk machine voor gebruik, zowel pistolen voor de verdamping van platina / koolstof (Pt / C) en koolstof, volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de Pt / C pistool op 45 graden eennd de carbon pistool op 90 graden.
    1. Pre-programma een bekleding schema van een 2-nm laag van Pt / C (bekledingssnelheid 0,02-0,04 nm / sec) en een 6-nm laag van koolstof (bij ~ 0,1 nm / sec).
      1. Voer de setup op het scherm van de freeze-fractuur machine. Selecteer een gebruikersnummer waar de coating-systeem wordt opgeslagen.
      2. Kies Pt / C "Layer 1 '. Selecteer een tijdsbestek, bijv., 5 min (de noodzakelijke tijd nodig om de coating te voltooien overschrijden). Gebruik de omhoog-omlaag om een ​​dikte van 2 nm te bepalen.
      3. Druk op de 'Layer' knop om naar 2. Herhaal stap 2.1.1.2 Laag, behalve dat je koolstof en definiëren een dikte van 6 nm.
    2. Te testen en aan te passen pistool operatie.
      1. Selecteer 'Layer 1'. Selecteer de Pt / C pistool door het indrukken van de 'gun1 "knop en druk op de" ON "knop op de verdamping regeleenheid van de freeze-fractuur machine. Bewaken van de verdampingssnelheid en stel met behulp van de spanning en emissie knoppen until bereiken van een snelheid van 0,02-0,04 nm / sec. Druk op 'UIT' de Pt / C pistool uit te schakelen.
      2. Selecteer 'Layer 2'. Herhaal 2.1.2.1, behalve dat je 'GUN2' en aan te passen voor een verdampingssnelheid van ~ 0,1 nm / sec.
  2. Koel de bevriezing breuk systeem etappe naar -140 ° C of -160 ° C (voor gehydrateerd of gedroogde bladeren, respectievelijk). Bevestig het vacuüm cryo shuttle transfer naar de machine en vul de kamer met vloeibare stikstof. De druk in de gekoelde vries-breuk kamer ligt gewoonlijk tussen 1-8 x 10 -7 mbar.
  3. Plaats een freeze breken preparaathouder (geschikt voor 3-mm bloedplaatjes) in het laadstation. Overspoelen de laadstation kamer met vloeibare stikstof.
  4. Plaats twee bevroren broodjes op de houder één voor één met behulp van hoge-precisie-kwaliteit pincet. Draai de eerste sandwich in de houder en klap de houder over om te controleren of het past stevig op zijn plaats. Herhaal dit voor de tweede sandwich.
  5. Detach de afgekoelde shuttle van het bevriezen breuk machine en sluit deze aan op het laadstation. Open de shuttle ventiel, introduceren de terugtrekkende arm in de houder en zet deze op zijn plaats. Opnieuw in te voeren de arm met de houder in de shuttle en sluit de shuttle klep met behulp van de laadstation knop. Bevestig de shuttle naar de freeze-fractuur machine en de houder te introduceren in de kamer met het terugtrekken arm. Maak de shuttle uit de machine.
  6. Lijn de bevriezing breuk microtoom mes om een ​​zodanige hoogte dat het zal kloppen de top plaatjes van de broodjes.
  7. De microtoom mes snel breken de broodjes, en onmiddellijk op- getrokken tot contaminatie van monsters door puin vasthouden voorkomen dat het mes en draai de gekoelde sluiter boven de nieuw blootgestelde vlak op de monsters van mogelijke verontreiniging te beschermen door watermoleculen in de Kamer.
  8. Coat de monsters met platina en koolstof.
    1. Voer 'Layer 1' op de screen. Schakel de Pt / C pistool door het indrukken van de 'gun1' knop, gevolgd door de 'ON' knop. Onderzoek de verdampingssnelheid en als het eenmaal heeft bereikt 0,02 - 0,04 nm / sec, tegelijkertijd bloot de monsters en druk op de 'Measure' om de dikte van de afgezette laag te bewaken.
      Opmerking: Gun wordt automatisch uitgeschakeld wanneer de dikte van de vooraf ingestelde waarde heeft bereikt.
    2. Bedek de monsters met een foto wanneer Pt / C verdamping is voltooid.
    3. Druk op de 'Layer' knop om naar 'Layer 2'. Herhaal stap 2.8.1 en 2.8.2, behalve selecteren 'GUN2' (voor koolstof) en een verdampingssnelheid van ~ 0,1 nm / sec.
  9. Verwarm de bevriezing breuk systeem etappe naar -120 ° C.

3. Cryo-scanning elektronenmicroscopie

  1. Bereid de scanning elektronenmicroscoop voor cryo werk.
    1. Selecteer Stage / Stage initialiseren in het hoofdmenu en bevestig.
    2. Selecteer Extra / GotO-paneel en open het paneel 'Airlock' door deze in de lijst te selecteren. Klik op 'Sluiten Column Chamber Valve' knop. Vent de microscoop kamer door te klikken op de Vent knop onder het tabblad 'Vacuum'.
    3. Selecteer Extra / Goto Configuratiescherm en open de 'Stage Points List' panel. Selecteer de cryo-uitwisseling plaats op het podium te verplaatsen naar de juiste coördinaten voor het accepteren van de monsterhouder. Opmerking: De "cryo-uitwisselstand 'is ingesteld om in aanpassing aan de positie van het vacuüm transporteenheid.
    4. Open het monster kamer met een schone paar handschoenen en steek de cryo-podium op het grote podium van de microscoop. Sluit de kamer en klik op de knop Pump onder het 'Vacuum tabblad'.
    5. Koel de microscoop naar -120 ° C. Vul het microscoop Dewar met vloeibare stikstof. Activeer de functie hitte op de cryo-overdracht regeleenheid -120 ˚C zodra de temperatuur van het podium daalt tot onder -120 ° C.
  2. attACH de cryo-overdracht shuttle naar de microscoop en de overdracht van de monsterhouder met behulp van de terugtrekkende arm in de microscoop cryo fase (zoals in stap 2.5). Maak de shuttle van de microscoop.
  3. Klik op de 'Open Column Chamber Valve' knop in het Airlock Panel.
  4. verplaats de monsterhouder in de buurt van het objectief (werk afstand 1-2 mm) voorzichtig met behulp van de joystick. Selecteer een 10-um opening in het tabblad 'openingen'. Dubbelklik op het veld EHT in het tabblad 'Gun'. Voer 10 (kV) voor de EHT target en klik op OK. Klik op het tabblad onderkant EHT en selecteer 'EHT On'.
  5. Selecteer 'InLens' uit de detectoren drop-down lijst in het tabblad 'detectoren'. Optimaliseer imaging voorwaarden (focus, helderheid en contrast, de koplampen, astigmatisme), naargelang het geval.
  6. Klik op het tabblad 'Scannen'. Kies een snelle scan ( 'Scan Speed ​​= 1', wat overeenkomt met een verblijftijd van 100 nanoseconden per pixel) te stralen schade te minimaliseren, eneen 'Store resolutie "van 1024 x 768 pixels. Selecteer 'Line Gem' in de 'Noise Reduction' drop-down lijst. Stel de waarde van N tot 20 - 30 lijnen voor het zoeken. Verplaats het monster met behulp van de functie van het 'Centre Point' (door te drukken op de controle-tab op het toetsenbord) om te zoeken naar regio's met een gebroken cellen en chloroplasten (Figuren 2A en 2B).
  7. Acquire beelden van gebroken chloroplasten bij lage vergrotingen (50-70 kX) (figuur 2C en 2D). Gebruik de functie 'Centre Feature' (door te drukken control-shift-tab op het toetsenbord) in interessante chloroplast breuk gezichten te zoomen en afbeeldingen te verwerven bij hoge vergrotingen (100-200 kX figuren 3 en 4). Gebruik dezelfde parameters als in stap 3.6 voor het verwerven, maar verander de Line Gem waarde N> 100 voor ruisonderdrukking 30.
    1. Druk op Freeze op de belangrijkste microscoop controle-eenheid of in het tabblad 'Scannen' om het scannen te stoppen en op te slaanhet beeld door te drukken op de 'Save TIFF' knop.

4. Beeldanalyse

Opmerking: Dit deel beschrijft een korte procedure voor segmentatie van membraan deeltjes uit freeze-fractuur SEM beelden met behulp van de Fiji-31 open-source-pakket. Soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen met andere beeldanalyse software.

  1. Open afbeelding met Fiji door image-bestand te slepen naar het hoofdvenster van het programma. Omzetten op de afbeelding om 8-bit door het selecteren van Image / Type / 8-bit. Kies Afbeelding / Aanpassen / Helderheid / Contrast en pas als dat nodig is (figuur 5A).
  2. Met behulp van de rechte lijn gereedschap, trek een lijn van de grootte van de ingesloten afbeelding schaal bar. Selecteer Analyseren / Set Scale. Voer de juiste schaal informatie (bekend afstand en de Eenheid van de lengte) en klik op OK. Sla deze geschaald beeld aangepast.
  3. Select Process / Filters / Gaussiaanse vervaging (1,5 nm straal) en klik op OK (Figuur 5B).
  4. Afbeelding selecteren / aanpassen / Auto Lokale Threshold (met behulp van de Niblack methode) en klik op OK (figuur 5C).
  5. Selecteer Bewerken / omkeren en vervolgens Proces / Binary / Watershed (figuur 5D).
  6. Teken een rand rond de regio van belang (ROI) met het gereedschap Selectie uit vrije hand. Voeg de selectie om de ROI manager door Bewerken / Selectie / Voeg toe aan Manager of door 't' klikken.
  7. Selecteer Bewerken / Clear Outside (Figuur 5E).
  8. Selecteer Analyseren / Set Metingen, kiest u de juiste parameters (bijv gebied, fit ellips).
  9. Selecteer Analyze / Analyseer Deeltjes. Voer een passend aanbod voor de grootte van de deeltjes en markeer 'Toon resultaten', 'Toevoegen aan Manager' en, indien nodig, de 'Uitsluiten op de randen' optie en klik op OK. Het resultaat wordt getoond in figuur 5F.
  10. Open het opgeslagen geschaald afgebeeld bestand (stap 4.2). Selecteer 'Show All' en schakel 'Labels' in de ROI Manager. Geef je mening over de geselecteerde particles gelegd op het oorspronkelijke beeld en handmatig toevoegen of verwijderen van selecties met behulp van de 'toevoegen' of 'Verwijderen' knoppen van de ROI Manager. Corrigeer selecties nodig met behulp van de functie Selectie uit vrije hand en de knop 'Update' van de ROI Manager (Figuren 5G en 5H).
  11. Analyseer de gegevens waarbij de verkregen metingen. In het venster Resultaten, klikt u op Resultaten / Vat te verkrijgen, bijvoorbeeld, de gemiddelde omgeving, en de gemiddelde Major en Minor assen van de in de ROI Manager opgenomen deeltjes. Klik Uitslagen / Distribution, selecteer een parameter (zoals Area) en klik op OK om een ​​histogram voor deze parameter te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 toont cryo-SEM beelden van plaatjes met hoge druk bevroren, bevriezen-gebroken Craterostigma pumilum blad stukken. In sommige monsters worden grote gebieden van gebroken cellen verkregen (Figuur 1A). In andere gevallen blijft het blad stuk strak gebonden aan de bovenste schijf en wordt geklopt met zich mee (Figuur 1B). Zelfs in het tweede geval kunnen sommige bladweefsel blijft vastzitten aan het mes groeven op de bloed...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De in dit document beschreven techniek maakt onderzoek gevries- gebroken membranen in de context van goed bewaarde hogedruk bevroren plantenweefsel door cryo-scanning elektronenmicroscopie. Het grote voordeel van het gebruik van deze procedures is dat de bereiding van de monsters is puur lichamelijk; geen stappen met chemische stoffen of uitdroging zijn noodzakelijk. Zo staat het bestuderen van biologische structuren op een near-native state 26,32. Het voordeel van bladweefsel is dat informatie over de totale...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken Andres Kaech (Universiteit van Zurich) voor zijn nuttig advies over het scannen van elektronen microscopie beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door de Verenigde Staten en Israël binationale Agricultural Research and Development Fund (verlenen no. US-4334-10, ZR), de Israel Science Foundation (verlenen nr. 1034/12, ZR) en het Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). De elektronen microscopie studies werden uitgevoerd bij de Irving Moskowitz en Cherna Center for Nano en Bio-Nano Imaging aan het Weizmann Institute of Science.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ethanol absBio-Lab052505
IsopropanolBio-Lab162605
1-hexadeceneSigma-AldrichH7009
0.1/0.2 PlateletsEngineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland241Platelets zijn van 3 mm diameter en 0,5 mm dik (Type A) met 0,1/0,2 mm diepe holtes (met een diameter van 2 mm). Vergelijkbare platelets kunnen worden verkregen van Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezersElectron Microscopy Sciences72706-01Dumont (Zwitserland) Durostar stijl #5 pincetten; Kan worden vervangen door andere hoge precisie pincetten.
High-pressure freezing machineBal-TecHPM 010High-pressure freezing alternatieven: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture systeemLeica MicrosystemsEM BAF 060
Cryo voorbereiding laadstationLeica Microsystems16770228
Specimen houder voor universele freeze fracturingLeica Microsystems16LZ04746VNKlemhouder voor specimen carriers met een diameter van 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttleLeica MicrosystemsEM VCT 100
Scanning elektronenmicroscoopZeissUltra 055
Cryo SEM-platformLeica Microsystems16770299905
BeeldverwerkingssoftwareSmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
BeeldanalysesoftwareFiji/Image J, National Institute of Healthhttp://fiji.sc/Fiji

Referenties

  1. Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
  2. Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
  3. Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
  4. Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
  5. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
  6. Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
  7. Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
  8. Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
  9. Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
  10. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
  11. Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
  12. Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
  13. Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
  14. Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
  15. Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
  16. Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
  17. Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
  18. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694(2014).
  19. Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
  20. Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
  21. Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
  22. Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
  23. Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
  24. Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
  25. Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
  26. Walther, P. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. Schatten, H., Pawley, J. B. , Springer. New York. 245-261 (2008).
  27. Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
  28. Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, (Pt 3) 229-237 (1995).
  29. Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
  30. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
  33. Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Freeze-fractuurtechniekorganisatie van het thylakoïdmembraanhogedrukvriesmethodedubbellaagse coatingfractuurvlakken van chloroplastendistributie van fotosysteem IIdehydratie-effectenopstakingsplant
Het bestuderen van de Supramoleculaire organisatie van Photosynthetic Membranen binnen Freeze-gebroken Leaf Tissues door Cryo-Scanning Electron Microscopy
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.