Continue IV Infusion is de keuze behandeling Route voor arginine-vasopressine Receptor Blocker conivaptan in Muizen op de studie-Stroke opgeroepen hersenoedeem

Samenvatting

Onze studies hebben aangetoond dat de gunstige effecten van conivaptan afhankelijk zijn van de methode van toediening na een experimentele beroerte bij muizen. We hebben een onderzoeksprotocol ontwikkeld voor de toediening van de receptorblokker via een IV-katheter op de door beroerte geïnduceerde hersenoedeemvorming bij muizen.

Samenvatting

Beroerte is een van de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in de wereld. Stroke wordt bemoeilijkt door hersenoedeem en andere pathofysiologische gebeurtenissen. Een van de belangrijkste spelers in de ontwikkeling en evolutie van beroerte opgewekte hersenoedeem is het hormoon arginine-vasopressine en zijn receptoren, V1a en V2. Onlangs heeft de V1a en V2-receptor blokker conivaptan het aantrekken van de aandacht als een potentieel geneesmiddel voor hersenoedeem te verminderen na een beroerte. Echter diermodellen die conivaptan toepassingen de beroerte onderzoek moeten worden aangepast op basis van mogelijke toedieningswegen. Hier de resultaten van 48 uur continue intraveneuze (IV) vergeleken met intraperitoneale (IP) conivaptan behandelingen na experimentele beroerte bij muizen. We ontwikkelden een protocol waarin de middelste cerebrale slagader occlusie met catheter installatie werd gecombineerd in de halsader voor IV behandeling van conivaptan (0,2 mg) of voertuig. Verschillende cohorten dieren werden behandeld met 0,2mg bolus van conivaptan of voertuig IP per dag. Experimenteel-takt opgeroepen hersenoedeem werd geëvalueerd in muizen na continue IV en IP-behandelingen. Vergelijking van de resultaten bleek dat de continue intraveneuze toediening van conivaptan vermindert post-ischemische hersenoedeem bij muizen, in tegenstelling tot de IP toediening van conivaptan. Concluderen we dat ons model kan worden gebruikt voor toekomstige studies conivaptan toepassingen in de context van een beroerte en hersenoedeem.

Inleiding

Beroerte blijft een enorme last voor zowel patiënten als clinici. Diermodellen voor beroerte worden al bijna twee decennia in laboratoriumomgevingen gebruikt.¹ Desondanks falen experimentele behandelingen die bij dieren werken vaak bij mensen.² Dit verschil in behandelingsresultaten kan te wijten zijn aan verschillende factoren, zoals toedieningsroutes voor geneesmiddelen die in dieronderzoek worden gebruikt, geneesmiddelenmetabolisme en eliminatiesnelheid, en vele andere aspecten. Een van de belangrijkste complicaties van beroerte, hersenoedeem, is een focus van de huidige neurowetenschappelijke onderzoeken. Mechanismen van hersenoedeemvorming omvatten verstoringen in het water- en elektrolytenevenwicht die worden veroorzaakt door de arginine-vasopressine (AVP) respons op ischemische hersenbeschadiging.³ Daarom zijn AVP en zijn receptoren (V1a en V2) een belangrijke focus van onderzoeksstudies naar post-ischemische hersenoedeemvorming.³

We hebben een methodologie ontwikkeld om de effecten van gemengde arginine-vasopressine (V1a en V2) receptorblokker conivaptan op post-ischemisch hersenoedeem bij muizen te bestuderen.⁴ Moleculaire doelen van conivaptan⁵ maken het geneesmiddel een geschikte kandidaat voor de exploratie van zijn eigenschappen bij het verminderen van hersenoedeem. Bovendien moet conivaptan worden bestudeerd in de context van pathofysiologische gebeurtenissen van beroerte.⁶ Bij het ontwerpen van deze studie hebben we overwogen om de behandelingsresultaten te vergelijken met behulp van twee verschillende toedieningsroutes voor conivaptan: intraveneus (IV)⁴ en intraperitoneaal (IP).⁷ De effecten van de behandelingen op door beroerte geïnduceerd hersenoedeem werden geëvalueerd. Hier worden gedetailleerde protocollen beschreven voor chirurgische inductie van experimentele beroerte door middel van occlusie van de arteria cerebri media (MCAO), gevolgd door continue conivaptanbehandeling met behulp van de installatie van een jugulaire IV-katheter. Na inductie van beroerte werden dieren willekeurig toegewezen aan de volgende groepen: voertuig of conivaptan (0,2 mg/dag) behandeld IV of IP.

Protocol

De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health voor de verzorging en het gebruik van dieren in het onderzoek uitgevoerd en goedgekeurd door de Zweedse Medical Center Animal Care en gebruik Comite. Alle procedures werden uitgevoerd met de juiste aseptische technieken. Proefdieren gebruikt voor de studie waren mannen, 3 maanden oud, wild-type C57 muizen met een lichaamsgewicht van 25-27 g.

1. In Vivo Stroke Inductie

1. Pre-coat het filament met Dental Resin Voorafgaand aan de operatie.
   1. Snij een 12 mm lang stuk van de gloeidraad van een 7-0 nylon hechtdraad. Meng 2 delen van het hars met 1 deel van de harder, en vervolgens onmiddellijk dompel de punt van het filament in het mengsel op ongeveer 1/3 van de gehele lengte bedekken. Verwijder het snel en controleer of deze is bedekt met een glad oppervlak coat van tandheelkundige hars.
   2. Lucht drogen het filament 2 uur voor gebruik.
2. Plaats de muis in eenn anesthesie inductie kamer (2 L volume), en zet de stroom van 1,5% isofluraan in 25% zuurstof verrijkte kamer lucht bij 2 L / min in te gaan op de kamer.
3. Laat de muis in de inductie kamer blijven totdat volledig verdoofd, ⁸ zoals bepaald door een gebrek aan respons op staartknijptest.
4. Plaats de muis op de operatietafel met een verwarmd kussen, en zet de isofluraan concentratie op 1% voor het onderhoud van de anesthesie spontaan geleverd via de neuskegel.
5. Klem haar op de voor- en achterkant van de nek, en spuit de hals met alcohol. Solliciteer veterinaire oogzalf aan beide ogen.
6. Om continu te controleren lichaamstemperatuur, gebruik dan een rectale temperatuur sensor is aangesloten op de digitale vertoning tijdens de operatie.
7. Plaats de muis in rugligging, gelden povidonjood 10% scrub oplossing voor desinfectie, dek af met een steriel laken, en vervolgens een middellijn incisie langs de hals met een maat 10 chirurgische scalpel.
8. Tijdelijk ligeren de linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA) met 6,0 zijden hechtdraad.
9. Plaats een andere band op de linker externe halsslagader (ECA).
10. Plaats een microvasculaire clip op de interne halsslagader (ICA).
11. Snij een klein gaatje op de externe halsslagader met microvasculaire schaar. Plaats een filament gemaakt 7-0 nylon hechtdraad bedekt met tandheelkundige hars in de opening van de Europese Rekenkamer, en vooraf te cephalically, terwijl het verwijderen van de clip, tot u weerstand voelt (ongeveer 5-7 mm vanaf het splitsingspunt van het CCA).
12. Plaats een tijdelijke gelijkspel op de interne halsslagader om het filament vast te zetten. Middels de tekening Figuur 1A. Sluit de huid met zijden hechtdraad en infiltreren gewikkeld op de voorzijde van de hals met 0,2 ml 0,5% bupivacaïne, zoals in stap 2,6.
13. Laat de muis te ontwaken uit narcose en weer bij bewustzijn in een herstel kamer voor 60 min. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten totdat het weervoldoende bewustzijn borstbeen recumbence handhaven.
14. Test de muis voor het tekort scoren neurologische (NDS) als volgt: 0 = normale motorische functie, 1 = buiging van de romp en van de contralaterale voorpoot op de laadklep, 2 = cirkelen om de contralaterale kant, maar normale houding in rust, 3 = leunt aan contralaterale side in rust, 4 = geen spontane motorische activiteit. ^4,9
    1. Voor de NDS testen, til de muis bij de staart en leg ze op een vlakke ondergrond ter observatie (2-3 min). Als alternatief, in acht muizen in het herstel kamer. Uitsluiten muizen die NDS lager is dan 2 uit het experiment vertonen als gevolg van onvoldoende occlusie van de MCA.
       Opmerking: Laser Doppler flowmetrie techniek kan worden gebruikt om MCA occlusie bevestigen ^9-11.
15. Opnieuw verdoven van het dier na 60 minuten herstel in de inductie kamer zoals hierboven beschreven, opnieuw steriliseren voorgaande incisie met 10% povidonjood scrub oplossing en open de wond op devoorzijde van de hals door te snijden en het verwijderen van de zijden hechtdraad.
16. Om de draad van de Europese Rekenkamer te verwijderen Voer de volgende stappen:
    1. Plaats een microvasculaire clip op de ICA. Ontbindt de hechting op het ICA en trek de draad eruit terwijl clip geopend.
    2. Sluit de clip en plaats een gelijkspel op de Europese Rekenkamer proximaal aan de snede.
    3. Verwijder de clip en verwijder de ligatuur van de CCA bloedstroom naar de hersenen te herstellen. Middels de tekening, figuur 1B.

2. Installatie van de IV katheter in de halsader voor continue 48 uur Behandeling

Opmerking: Ga verder met de installatie van de katheter onmiddellijk na de stap 1.16.3 zonder ontwaken van de muis.

1. Twee verschillende maten flexibele buis: steek de binnenbuis (0,94 mm uitwendige diameter, om het geneesmiddel bevatten worden toegediend) in de buitenste buis (3,18 mm buitendiameter, ter bescherming van de binnenste buis).
2. Pkant de muis in de buikligging toepassing 10% povidon-jood scrub oplossing voor desinfectie en maak een 1 cm incisie op de rug van de hals met een maat 10 chirurgische scalpel. Draai de muis in rugligging, opnieuw steriliseren de voorzijde van de hals met 10% povidonjood scrub oplossing en open de chirurgische wond aan de voorzijde van de hals. Tunnel de slang onder de huid vanaf de incisie gemaakt aan de achterzijde naar de voorzijde van de hals en exterioriseren uit de open wond 1 cm.
3. Verwijderen onderhuidse vetweefsel van de linkerzijde van de voorzijde van de hals ongeveer 1 cm lateraal van middellijn. Zoek de linker halsader, plaatst u twee banden langs de ader 5 mm van elkaar, en iets rekken de ader. Maak een klein gaatje aan de halsader tussen de twee banden met microvasculaire scharen; Steek het uiteinde van de binnenste buis 5 mm diep caudaal (naar het hart).
4. Zet de buis met beide banden met de halsader. Sluit de huid aan de voorzijde van de halseen 3-0 zijden hechtdraad. Middels de tekening, figuur 1C.
5. Bevestig de slang aan de huid op de rug van de hals met een hechtdraad en sluit de slang aan een microinfusion IV pomp via een wartel. De swivel maakt vrij verkeer van muizen in de kooi met volledige toegang tot het eten en water.
6. Infiltreren huid insnijdingen aan de voorkant en de achterkant van de nek met 0,2 ml 0,5% bupivacaïne voorkomen postoperatieve pijn.
   Opmerking: Afhankelijk van de institutionele specifiek dier protocollen, kunnen de dieren worden behandeld met opioïden, NSAID's, of antibiotica pre- en post-operatief. Echter, genoemd behandelingen resultaten van ischemische beroerte uitkomst veranderen (zie Overleg sectie). ^11-14
7. Laat het dier te ontwaken in het herstel kamer, en vervolgens het huis van het dier in een aparte kooi tot aan het eindpunt van het experiment. Heeft het dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen borstbeen te onderhoudenrecumbence.
8. Stel de infusiesnelheid voor continue 48 uur intraveneuze behandeling van conivaptan (0,14 mg / ml in 5% dextrose) of drager bij 1,5 ml / kg / uur, ⁴ en begin de infusie.
   Opmerking: Het totale bedrag van IV infuus conivaptan moet ongeveer 0,2 mg / muis / dag in een totaal volume van 1,44 ml.
   Opmerking: Voer intraperitoneale (IP) injectie van conivaptan tweemaal daags met een totale hoeveelheid van 0,2 mg in 1,44 ml 5% dextrose. Uitvoering IP injectie zoals eerder beschreven. ¹⁵ Beperken muizen door het vastgrijpen van de huid van de dorsale zijde van het lichaam en de staart. Injecteer conivaptan of voertuigen die in de linker onderste kwadrant van de buik met een 26 G / 1/2 inch naald. ¹⁵
9. Observeer de dieren tweemaal per dag gedurende de gehele duur van het experiment (48 uur). Laat de dieren om volledige toegang tot voedsel en water. Als het dier tekenen van angst of kortademigheid vertoont een dierenarts raadplegen. Wanneer euthanasie is nodig voor dit dier ernstige distruk verwijzen naar de stap 3.1 hieronder, en uitsluiting van het dier uit de studie.

3. Evaluatie van-Stroke opgeroepen hersenoedeem op het eindpunt

1. Offer de muis door over-verlamming met 5% isofluraan.
2. Gebruik een scalpel een incisie in de huid over de schedel bot over de middellijn te maken en trek de huid om de hele schedel over de hersenen bloot te leggen. Beginnend bij het foramen magnum, snijd de schedel bot zijdelings langs de omtrek van de hersenen aan elke kant, en til het zonder het aanraken van de hersenen eronder. Scheiden de hersenen van de rug en bevestigd aan de basis van de schedel zenuwen.
3. Verwijder de hersenen, scheiden van de bulbus olfactorius en het cerebellum en cerebrum ontleden de interhemisferische langs de spleet in de ischemische en niet-ischemische cerebrale hemisferen, zoals eerder beschreven. ⁹
4. Beoordelen hersenoedeem door vergelijking nat-op-droog-verhoudingen (WDR) zoals eerder beschreven ^4,9. Weeg weefselsvóór en na drogen gedurende 3 dagen bij 100 ° C in een oven. Bereken hersenen watergehalte (BWC) als% H ₂ O = (1-droog gew. / Nat gew.) X 100%.

Resultaten

De lichaamstemperatuur van de dieren was in het fysiologische bereik en stabiel tijdens de chirurgische procedure beroerte inductie. Twee muizen die NDS lager vertoonden dan 2 direct na MCAO uit de studie werden uitgesloten.

MCAO in muizen produceert infarct volume in de ipsilaterale hemisfeer na 48 uur. Evaluatie van de TTC gekleurde plakjes blijkt dat ongeveer 50% van de halve bol wordt beïnvloed door infarct na MCAO

Discussie

Deze studie heeft belangrijke waarde voor preklinisch beroerte onderzoek. Deze studie toont aan dat continue IV infusie van conivaptan (0,2 mg / dag) na experimentele beroerte bij muizen vermindert efficiënt hersenoedeem na 48 uur behandeling. Het effect van IP injectie van dezelfde dosis conivaptan op hersenoedeem werd eveneens onderzocht. Conivaptan behandeling van zowel IV en IP routes produceert aquaresis bij muizen aangegeven: 1) verhoging van plasma osmolaliteit iets boven fysiologische niveaus; en 2) afname van u...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Heated Pad	K&H Manufacturing Inc	1060
Temperature Monitor with Rectal Probe	Physitemp	7029
Silk Suture Spool, 6-0	Surgical Specialties Corporation	SP114
Silk Suture on a Needle, 3-0	Ethicon	1684G
Nylon Suture, 7-0	Ethicon	1696G
Dental Resin Polysiloxane with Hardener	Heraeus Kulzer	65817930
Microinfusion IV Pump	Kent Scietific	GT0897
Swivel 22GA	Instech	375/22PS
Laboratory Tubing, 0.94 mm x 0.51 mm	Dow Corning	508-002
Laboratory Tubing, 3.18 mm x 1.98 mm	Dow Corning	508-009