Een efficiënte methode om gededifferentieerde Fat cellen te verkrijgen

Samenvatting

We hebben de omstandigheden voor de DFAT-celgeneratie aangepast en geven hierbij informatie over het gebruik van een verbeterd groeimedium voor de productie van deze cellen.

Samenvatting

Tissue engineering en celtherapie veelbelovend klinisch. In dit verband kan multipotente cellen, zoals mesenchymale stamcellen (MSCs), therapeutisch worden toegepast, in de nabije toekomst de functie herstellen beschadigde organen. Toch een aantal technische kwesties, waaronder de zeer invasieve procedure voor het isoleren van MSC's en de inefficiëntie rond hun versterking, momenteel belemmeren de potentiële klinische gebruik van deze therapeutische modaliteiten. Hierin introduceren we een zeer efficiënte werkwijze voor de productie van gededifferentieerde vetcellen (DFAT), MSC-achtige cellen. Interessant is DFAT cellen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen waaronder adipogenic, osteogene, chondrogene en cellen. Hoewel andere groepen die eerder verschillende methoden hebben ingediend voor het genereren van DFAT cellen uit volwassen vetweefsel, onze methode laat ons toe om DFAT cellen efficiënter te produceren. Hierbij tonen we dat DFAT kweekmedium (DCM), aangevuld met 20% FBS,effectiever in het genereren DFAT cellen dan DMEM, aangevuld met 20% FBS. Bovendien kan de DFAT cellen die door onze celkweek methode redifferentiated in verschillende weefseltypen. Als zodanig is een zeer interessant en nuttig model voor de studie van weefsel dedifferentiatie gepresenteerd.

Inleiding

Celtherapie en tissue engineering zijn hot topics op het gebied van regeneratieve geneeskunde ^1-5. Hoewel deze therapeutische modaliteiten zijn veelbelovend, een aantal technische kwesties die momenteel belemmeren hun klinisch gebruik. In dit opzicht, zoals bij het genereren van iPS cellen, alle weefselmanipulatie therapieën moeten cellen aan externe gen transductie produceren om patiëntveiligheid handhaven. Daarom waren we de eerste groep met succes de productie van menselijke cellen DFAT ^6. Verscheidene andere onderzoeksgroepen hebben sindsdien aangenomen onze methode om DFAT cellen van zoogdieren oorsprong ^7-9 te genereren, verder aandacht voor de bruikbaarheid van ons model.

Gedurende verscheidene studies hebben we gevonden dat de kwaliteit van de celkweek omgeving kan worden gewijzigd door instellen van de inhoud van het celmedium. Deze bevinding heeft geleid tot een verhoging van de slaagkans van DFAT celproductie en cellen kwaliteit verbeterd; zowel kritische factoren inefficiënt genereren van cellen voor toekomstige klinische trials. In dit opzicht een verbeterde DFAT kweekmedium (DCM, een medium vergelijkbaar met mesenchymale stamcel medium dat recombinant humaan insuline, serum albumine, L-glutaminezuur, verscheidene vetzuren bevat, en cholesterol) en een werkwijze voor DFAT celgeneratie en proliferatie werd ontwikkeld (meer informatie over de inhoud van DCM is beschikbaar op aanvraag). Deze methode hoogwaardige DFAT cellen werden gegenereerd met de mogelijkheid om te differentiëren in verschillende celtypes waaronder adipogenic, osteogene, chondrogene en cellen. Al met al, deze gevalideerd celkweek protocol verhoogt de kwaliteit van DFAT cellen en kunnen zeer bruikbaar voor het verbeteren van klinische toepassingen van celtherapie en tissue engineering.

Protocol

Monsters van menselijk onderhuids vet werden verkregen van patiënten die een chirurgische ingreep in de afdelingen plastische chirurgie, urologie, Pediatrische Chirurgie en Orthopedie van Nihon University Itabashi Hospital (Tokyo, Japan). De patiënten gaven schriftelijk informed consent, en de ethische commissie van Nihon University School of Medicine ingestemd met de studie.

1. Tissue Voorbereiding

1. Breng het weefselmonster van de operatiekamer naar het laboratorium.
2. Wassen 1-2 g vetweefsel met 5 ml PBS (-) bij kamertemperatuur (KT) eenmaal in een 50 ml buisje en plaats het monster in een 10 cm plastic schaaltje.

2. Collagenase Spijsvertering

1. Verwijder het monster uit de PBS (-) toegevoegd, waarna 10 ml steriel 0,1% (w / v) oplossing collagenase (collagenase type II) het schaaltje met het weefselmonster.
2. Gehakt het weefsel met chirurgische schaar ongeveer 15 minuten, totdat een gepureerd bestaan ​​bereiktrantie.
3. Vervolgens verteren gehakt weefsel in 0,1% (w / v) collagenase oplossing bij 37 ° C gedurende 30 min (60 rpm) in een 50 ml buis met zacht schudden op een schudder.
4. Filtreer het gedigereerde monster door een 100 urn filter in een 50 ml buis. Daarna worden 10 ml DCM (zie tabel of Materials) aangevuld met 2% FBS door het filter.

3. Cel Isolatie

1. Centrifugeer de gefilterde cellen bij 100 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
2. Op dit moment bereiden 5 ml DCM aangevuld met 2% FBS in een 50 ml buis.
3. Vervolgens stellen de drijvende vetcellen met behulp van een 1000 ui pipet en voeg de cellen om een ​​50 ml buis met medium.
4. Vervolgens schud de 50 ml buis zachtjes aan de DCM medium met de cellen te mengen.
5. Vervolgens centrifugeer de buis bij 100 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
6. Gooi het medium bij de bodem van de buis met een 18 G naald en een 20 ml spuit.
7. Voeg vervolgens 10 ml DCM supplemented met 2% FBS aan de cellen verzameld.
8. Meng de DCM met de cellen door schudden van de 50 ml buis voorzichtig.
9. Centrifugeer de buis bij 100 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur.

4. Plating Cellen

1. Voeg 41 ml DCM of DMEM aangevuld met 20% FBS tot een 12,5 cm kolf.
2. Dan worden op een 200 ul pipet voeg 40 ul van vetcellen aan de kolf.
3. Vervolgens vul de kolf met DCM of DMEM aangevuld met 20% FBS. Kritische stap: Op dit punt, ervoor te zorgen dat de cellen liggen verspreid over het medium. Controleer visueel de vrijstaande cellen en daarna houden de kolf op het deksel van een ronde petrischaal om het plat te houden.
4. Tenslotte zet de kolf in de couveuse en laat het ongestoord in een _5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 7 dagen.
5. Na een week van incubatie, draai de fles en controleer DFAT cellen. Vervolgens beoordeelt DFAT cel generatie vaardigheid zoals beschreven ¹⁰ omdat op dit punt fibroblast-achtige cellen (DFAT cellen) bevinden zich in de regio's verschillend van vetcellen.
6. Voeg 5 ml DCM of DMEM aangevuld met 20% FBS aan de fles na verwijdering van de vorige celkweekmedium. Laat de DFAT cellen om te groeien voor nog een week na het wijzigen van het medium.
7. Met behulp van een cel teller, tel het aantal DFAT cellen die onder verschillende celcultuur condities (DCM vs. DMEM).

Resultaten

In deze studie, de werkwijze en toolkit voor DFAT celgeneratie verbeterd (figuur 1). Onze methode kunnen we DFAT cellen te genereren met zowel DCM en DMEM medium met 20% FBS (figuur 2A). Daarom, hebben we de doelmatigheid van DCM en in DMEM genereren DFAT cellen. In dit verband DCM DFAT verhoogde celproliferatie driemaal vergelijking met DMEM, ongeacht het aantal adipocyten (figuur 2A en B). Gebruik 20% FBS verbete...

Discussie

Volwassen adipocyten dat ondergaan in vitro dedifferentiatie, een proces dat bekend staat als het plafond cultuur, kan terugkeren naar een meer primitieve fenotype en krijgen proliferatieve capaciteiten. Deze cellen worden aangeduid als gededifferentieerde vet (DFAT) cellen. De multilineage differentiatiepotentiaal van DFAT cellen werd geëvalueerd. Flow cytometrie analyse en genexpressie analyse bleek dat DFAT cellen zeer homogeen vergeleken met ASC ^6. In feite, de cel-oppervlakte-antigeen profiel va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CSTI303-MSC medium	CSTI	87-671	Dit medium wordt in de tekst gedefinieerd als DCM
PBS(-)	Wako	166-23555	Het bevat geen Mg2+ en Ca2+
DMEM medium	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012
Collagenase type II	Sigma	C-6885
Schaar	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Shaker	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100 μm Geel	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12,5 cm² Rechthoekige Canted Neck Celcultuurfles met Blauwe Ventielschroefdop	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18 G naald	NIPRO	02-002
20 ml Spuit	NIPRO	08-753
Z Series Coulter Teller	BECKMAN COULTER	383550