Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

6.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54372

⸱

16 december 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In dit artikel

Samenvatting

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten (MEF's) via overexpressie van transcriptiefactoren (TF's). We ontwierpen eerst een reporterscreening met behulp van MEF's van humane CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) dubbel transgene muizen. CD34+ cellen van deze muizen labelen H2B histonen met GFP en stoppen met labelen bij toevoeging van doxycycline (DOX). MEFS werden getransduceerd met kandidaat TF's en vervolgens waargenomen op het ontstaan van GFP+ cellen die zouden wijzen op het verkrijgen van een hematopoietische of endotheelcelbestemming. Beginnend met 18 kandidaat TF's, en door middel van een proces van combinatorische eliminatie, verkregen we een minimale set factoren die de hoogste percentage GFP+ cellen zou induceren. We ontdekten dat Gata2, Gfi1b en cFos noodzakelijk waren en dat de toevoeging van Etv6 de optimale inductie bood. Een reeks genexpressieanalyses uitgevoerd op verschillende tijdstippen tijdens het herprogrammeringsproces onthulde dat deze cellen door een precursorcel leken te gaan die een endotheel naar hematopoietische transitie (EHT) onderging. Als zodanig bootst dit herprogrammeringsproces ontwikkelingsmatige hematopoëse "in een schaal" na, waardoor het mogelijk is om hematopoëse in vitro te bestuderen en een platform te bieden om de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze specificatie te identificeren. Deze methodologie biedt ook een raamwerk voor de translatie van dit werk naar het menselijk systeem in de hoop een alternatieve bron van patiëntspecifieke hematopoëtische stamcellen (HSC's) te genereren voor een aantal toepassingen in de behandeling en studie van hematologische ziekten.

Inleiding

Hematopoiese is een complex ontwikkelingsproces waarbij hematopoietische stamcellen (HSCs) knop uit hemogenic endothelium aanwezig in diverse embryonale hematopoietische sites zoals de aorta-Gonade-mesonephros en placenta 1,2. Het onvermogen cultuur HSCs in vitro voorkomt de grondige analyse van dit proces en de klinische toepassing van deze studies. Om deze beperking te omzeilen, hebben eerdere studies geprobeerd om af te leiden HSC de novo hetzij via differentiatie van pluripotente stamcellen (PSC) 3, of geïnduceerde plasticiteit in somatische cellen en geregisseerd differentiatie met behulp van het herprogrammeren van media 4,5. Deze onderzoeken echter genereren geen klinisch veilig engraftable cellen of toestaan ​​studie van ontwikkeling definitieve hematopoiese "in een schotel."

De roman werk die door Yamanaka en collega's voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van somatische fibroblasten provides een kader voor transcriptiefactor (TF) op basis van overexpressie strategieën herprogrammering lot van de cel 6,7. Dit werk is in verschillende gebieden gevraagd onderzoekers om celtypen van keuze te genereren via TF herprogrammering van gemakkelijk verkrijgbaar somatische cellen. Het doel van de herprogrammering strategie hier beschreven een hemogenic werkwijze uit muizen somatische cellen met een TF gebaseerde herprogrammering benadering met als doel deze bevindingen neerkomt op het menselijke systeem patiëntspecifieke fibroblasten herprogrammeren om humane hematopoiese onderzoeken in vitro en induceren genereren patiëntspecifieke bloedproducten ziektemodel, drug testen en stamceltransplantatie.

De eerste stap om juiste herprogrammering in deze muis te verzekeren werd een reporter lijn die diende als een uitlezing voor CD34 expressie, een bekende merker in endotheliale progenitorcellen en HSCs ontwikkelen. Om dit te doen, werden de huCD34-tTA en TetO-H2BGFP transgene muis lijnen gebruikt om generate dubbele transgene muis embryonale fibroblasten (MEF), nu aangeduid 34 / H2BGFP, dat groene bij activering van de CD34 promotor 8 fluoresceren. Dit maakte screening van verschillende TF bekend vereist op verschillende momenten tijdens hematopoietische specificatie en ontwikkeling. Beginnend met 18 TF's in PMX retrovial vectoren (bepaald door middel van literatuur en profilering van GFP label behoud van HSC uit de eerder beschreven 34 / H2BGFP muizen), 34 / H2BGFP MEFs werden getransduceerd met alle factoren en gekweekt op AFT024 HSC-ondersteunende stromale cellen. Na de detectie van 34 / H2BGFP activering, werden TF vervolgens verwijderd uit de herprogrammering cocktail tot de optimale set van TFS reporter activering werd geïdentificeerd. Na deze eerste screen werden de factoren naar een DOX pFUW induceerbaar vectorsysteem voor expressie regelbaar van het TF mogelijk. Aangezien beide DOX controleerbare onverenigbaar (de 34 / H2BGFP cellen en de pFUW induceerbare vectoren), MEF uitwild-type C57BL / 6 muizen werden vereist. Het was ook nodig om een ​​geschikte micro-omgeving te laten hemogenesis om verder te gaan en maak multilineage klonogene voorlopercellen te bieden.

Huidige studies een poging om somatische cellen te herprogrammeren in hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) hebben uiteenlopende niveaus van succes 9-11 voldaan. Tot op heden heeft het opwekken van zowel muis en mens transplantable HSPCs met de lange termijn en zelf-vernieuwing repopulatie vermogen niet is bereikt met behulp van dezelfde set van TF's. In dit protocol bieden wij een gedetailleerde beschrijving van de eerder vastgestelde strategie reproduceerbaar hemogenesis induceren in MEFs. We tonen aan dat de invoering van een minimaal aantal TF's (Gata2, Gfi1b, cFos en ETV6) kan aanzetten tot een complex ontwikkelingsprogramma in vitro dat een platform waarmee ontwikkeling hematopoiese en klinische toepassing van hematopoietische herprogrammering verder kan worden onderzocht 12 verschaft.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethiek statement: Muis cellijnen zijn afgeleid volgens de richtlijnen van de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï verzorging van de dieren, en moet worden gedaan in overeenstemming met enige gastinstelling.

1. muis embryonale fibroblast (MEF) Isolatie van C57BL / 6 muizen

  1. Opzetten getimede paring 13. Zodra een vaginale plug wordt gevisualiseerd, overweeg deze Dag 0,5.
  2. Scheid de aangesloten vrouwtjes op de stekker datum en controleren op hen op de Dag van 10-11 om zwangerschap te bevestigen.
  3. Op dag 13,5-14,5 euthanaseren zwangere vrouwelijke muizen via CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie.
  4. Weken zwangere vrouw buik met 70% ethanol, ontleden de buikholte met steriele scharen en pincet langs de middellijn en operatief verwijderen baarmoederhoorns met het embryo 14. Haal de embryo's zachtjes terwijl het afsnijden van de resterende abdominale weefsel.
    OPMERKING: Recover ongeveer 8 embryo's met 4 aan elke kant.
  5. Plaats de baarmoeder hORNs die de embryo's in een 10 cm schaal met 5-10 ml gekoelde steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  6. Met een steriele schaar en pincet, maak dan een incisie langs de baarmoeder horens aan de zakken die de embryo's te isoleren. Breng de zakken om een ​​nieuwe 10 cm schotel met 5-10 ml steriele gekoelde PBS en plaats op ijs.
  7. Plaats een paar van de zakjes in een nieuwe 10 cm schaal met 5-10 ml steriel PBS gekoeld. Met behulp van een steriele schaar en pincet voorzichtig opengesneden de zakken (zonder te snijden te diep) om te voorkomen dat het doorboren van de embryo's.
  8. Scheid de embryo's uit placenta door het snijden van de navelstreng.
  9. Overdracht van de embryo's om een ​​nieuwe 10 cm schotel met 5-10 ml koud PBS en laat op ijs bij het invullen van de resterende dissecties.
  10. Onthoofden het embryo met steriele pincet. Knip voorzichtig langs de middellijn van het embryo met behulp van steriele schaar en pincet, vanaf de onthoofde gebied om het openstellen van de buik. Positie pincet eronder tHij viscerale organen (met inbegrip van het hart, lever en longen) en schrapen ze 15.
  11. Snijd de resterende weefsel in kleine stukjes met een schaar en pincet overgebracht in een 50 ml conische buis met 10 ml van trypsine.
  12. Pipet op en neer met een 10 ml pipet 20-30 keer mengen en dissociëren het weefsel.
  13. Incubeer het weefsel en trypsine mix in een 37 ° C waterbad gedurende 45 min, wervelende af en toe.
  14. Pipet op en neer met een 10 ml pipet ongeveer 5 minuten om de inhoud te mengen.
  15. Voeg getrypsiniseerd cellen hoeveelheid gesteld Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 3x 10 ug / ml penicilline / streptomycine (P / S) en 1 mM L-glutamine (L-GLUT) in 10 cm schalen (~ 10 ml) en kweek bij 37 ° C totdat confluente (ongeveer 2-4 dagen). Cultuur ongeveer 1-2 embryo's per 10 cm schotel.
    LET OP: Freeze cellen eenmaal platen confluent. Bevroren cellen worden ontdooid en 2 keer doorgekweekt. Cellen kunnen als alternatiefsplit 2 keer voor het invriezen, en dan nog eens na te zijn ontdooid.

2. virusproductie

  1. Expand 293T cellen in 10 cm platen met 10 ml DMEM met 10% FBS, 1% P / S, en 1% L-GLUT voor transfectie.
    1. Trypsinize 293T cellen met 2 ml trypsine, incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min, laat de cellen in 15 ml buizen draaien op 300 xg en plaat passend (10 ml per 10 cm schaal).
  2. 24 uur voorafgaand aan transfectie, splitsen confluente 10 cm plaat van 293T cellen 1: 6 en zaad in 10 cm gelatine beklede (0,1% gelatine in PBS) platen.
    LET OP: 4 platen per virus nodig zal zijn.
    1. Bekleden platen in gelatine, voeg ten minste 2 ml van de 0,1% gelatineoplossing bekleden onderaan 10 cm platen. Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 20 min. Aspireren uit gelatine voorafgaand aan het toevoegen van cellen aan de platen.
  3. In een 15 ml buis, voeg 84 ug plasmide (bijv Gata2, Gfi1b, cFos of ETV6 (gesubkloneerd in de pFUW-TetO vectof 16) of FUW-M2rtTA 17), 84 ug psPAX2 en 42 ug pMD2.G. Voeg water toe (H 2 O) om het volume tot 2 ml. Bereid een buis voor elke factor (bijv. Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 en FUW-M2rtTA).
  4. Voeg 250 gl 2M CaCl2 aan elke buis die het mengsel 2 ml bestaande uit 84 ug van het gekozen gen (Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 of FUW-M2rtTA) + 84 ug psPAX2 + 42 ug pMD2.G + H 2 O .
  5. Met een Pasteur-pipet ingebracht in de pipet-steun afgifte bellen in de 2,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl2 mengsel. Aangezien de belletjes worden geproduceerd, plaatst de punt van een P1000 tegen de glazen pipet en langzaam uitwerpen 2 ml van 100 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethaan sulfonzuur (BES) zoutoplossing langs de Pasteur pipet 1 ml per keer.
  6. Incubeer alle buizen in de cultuur kap bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min.
    LET OP: De 4,25 ml mengsel (nu DNA + H 2 O + 2M CaCl2 + BES zoutoplossing) zal er enigszins bewolkt.
  7. Als het mengsel inleggen, zuig media af 293T borden en voeg 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-glutamine + 25 nm chloroquine.
    LET OP: Deze media niet P / S bevatten.
  8. Na ten minste 15 min incubatie (of tot het wijzigen van de media op 293T-cellen), H 2 voeg de 4,25 ml DNA + O + 2 M CaCl2 + BES zoutoplossing mengsel druppelsgewijs naar de 293T-cellen, het verspreiden van gelijkmatig verdeeld over 4 cellen platen per buis (gemiddeld iets meer dan 1 ml van het mengsel per plaat).
  9. Incubeer de platen gedurende de nacht (O / N) bij 37 ° C.
  10. 24 uur na incubatie media vervangen op alle platen met 4 ml standaard DMEM (zie stap 1.15).
  11. Houd cellen in een 32 ° C incubator voortaan.
  12. 24 uur na stap 2,10, het verzamelen van media in afzonderlijke 50 ml buizen. Vervang de verzamelde media uit elke plaat met 4 ml van de standaard DMEM.
    LET OP: 4 platen per eerste buis mengsel resultaten in 16 ml van de verzamelde media.
    1. EENN a 12 uur van incubatie, het verzamelen van de media opnieuw in dezelfde 50 ml buizen en vervangen door een andere 4 ml van de standaard DMEM.
    2. Na 12 uur incubatie, verzamel de media en voeg dezelfde 50 ml buizen.
      LET OP: elke buis moet nu bevatten ongeveer 48 ml van de media met virus.
  13. Om de verzamelde virus, eerste filter de verzamelde media concentreren door middel van 0,45 urn laag-eiwit binding filters.
  14. Giet het gefiltreerde medium dat virus in virale concentratie centrifugebuizen (ongeveer 16 ml per keer).
  15. Spin bij 4000 xg bij 4 ° C gedurende 25 minuten en verwijder doorstroming.
    OPMERKING: Een klein volume geconcentreerd media en virussen zijn zichtbaar in het filter.
  16. Voeg nog 16 ml gefiltreerd virus-bevattende media aan de geconcentreerde media + virus restvolume in het filter en meng door de buis.
  17. Spinbuis opnieuw bij 4000 xg bij 4 ° C gedurende 25 min en gooi doorstroming.
  18. Voeg de resterende gefilterdverzameling aan de geconcentreerde media + virus volume links in het filter en meng door de buis.
  19. Spin opnieuw bij 4000 xg bij 4 ° C gedurende 10-20 min (afhankelijk van het volume in het filter) en om de laatste deel geconcentreerd media + virus nog in het filter ongeveer 1 ml. Indien groter dan 1 ml geconcentreerd media + virus in het filter blijft draaien opnieuw bij 4000 xg gedurende 1 min en herhaal tot 1 ml overblijft in het filter.
  20. Aliquot 200 ul van het geconcentreerde virus in 1,5 ml buisjes en bevriezen bij -80 ° C of onmiddellijk gebruik.

3. MEF herprogrammeren

  1. Pre-coat 6 goed platen met 0,5 ml 0,1% gelatine in PBS per well, ervoor te zorgen dat de gelatine bestrijkt het hele gebied van de put. Plaats in een 37 ° C incubator en incubeer gedurende ten minste 20 min. Na incubatie, verwijder de platen en zuig de gelatine.
  2. MEF plaat met standaard DMEM bij een dichtheid van 25.000 cellen per putje (150.000 cellenper 6-wells plaat) op de ontsloten 6-well plaat (s) van stap 3,1 en laat O / N zich in een 37 ° C incubator.
  3. Bereid een 100 ul virus cocktail door 50 gl M2rtTA en de resterende 50 ui van een mengsel van Gata2, Gfi1b, cFos en ETV6 (12,5 pi elk).
  4. Aspireren media van MEFs en voeg 2 ml standaard DMEM met 8 ug / ml hexadimethrinebromide.
  5. Transduceren elk putje van de MEF platen met 15 ul van het virus cocktail en geïncubeerd O / N bij 37 ° C.
    LET OP: Dit is de Dag 0 van de herprogrammering proces.
  6. Op dag 1 na 16-20 h incubatie media te vervangen door 2 ml vers standaard DMEM aangevuld met 1 ug / ml per putje DOX.
  7. Bereid hematopoietische kweekmedium aangevuld met hydrocortison (10 -6 M), 100 ng / ml stamcelfactor (SCF), 100 ng / ml-Fms-gerelateerde tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L), 20 ng / ml interleukine-3 (IL 3), 20 ng / ml interleukine-6 ​​(IL-6), en 1 ug / ml DOX.
  8. Op dag 4 aspirate media uit elk putje en wassen cellen met 1 ml PBS per putje.
  9. Aspireren PBS, dissociëren cellen met behulp van 1 ml 0,05% trypsine per put en het verzamelen van de cellen.
  10. Aantal cellen met een hemocytometer, rotatie bij 300 xg gedurende 5 minuten, resuspendeer in 12 ml hematopoietische media in stap 3.7 beschreven en plaat 60.000 cellen per 6-well plaat op 0,1% gelatine beklede platen (2 ml per putje, 10.000 cellen per putje ).
  11. Vervang de media met verse aangevulde hematopoietische cultuur media om de 6 dagen tijdens de duur van de cultuur (35 tot 36 dagen).
  12. Analyseer middelbaar cellen of opkomende hematopoietische-achtige cellen via immuno-kleuring 12, FACS-analyse 8,12, qRT-PCR 12 en mRNA sequencing 12 tot en met de overname van hemogenic endotheliale of HSC-achtige markers en gen expressie te bevestigen.

4. Placenta Samenvoeging en kiemgetal (CFU) Testen in Methylcellulose

  1. Ontleden placenta van zwangere C57BL / 6-muizen zoals eerder beschreven 18 aan E12.5 en houdt weefsel op het ijs.
  2. Om placenta dissociatie 19 start, wassen placenta weefsel in 2-5 ml 0,2% collagenase type I in PBS met 20% FBS en mechanisch dissociëren met een 18G naald in een 5 ml injectiespuit voorzien door passage van de placenta en PBS door de naald ten minste Drie keer.
  3. Na mechanische dissociatie Houd placenta cellen in 2-5 ml collagenase oplossing bij 37 ° C gedurende 1,5 uur.
  4. Passage cellen door 20-25 G naalden aangebracht op 5 ml spuiten meerdere malen verder mechanisch te distantiëren van de cellen van de placenta.
  5. Filter enkele cel suspensies m 70 micrometer cel zeven.
  6. Aantal cellen met een hemocytometer en bestralen van 2000 cGy voor mitotische 20 inactivering.
  7. Voeg 10 ml hematopoietische kweekmedium gesupplementeerd met 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6 en 10 ng / ml trombopoietine (TPO) met een 10 cm schotel.
    OPMERKING: DOX is niet op dit moment noodzakelijk.
  8. Plaats een 0,65 urn filter direct op hematopoietische kweekmedia in de schaal, zodat het drijven van een vloeistof-gas-interface en zet de schotel opzij.
  9. Distantiëren dag 25 getransduceerd MEFs (verkregen uit stap 3,11) zoals beschreven in stap 3,8-3,10 en meng 33.000 van de getransduceerde MEF met 167.000 cellen van de placenta aggregaten van stap 4,6 (1: 6 verhouding).
  10. Om een aggregaat 18,21, eerste spin langs de MEF en placenta cel mix uit stap 4.9 te genereren gedurende 5 min bij 300 x g. Aspireren de media en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 30-50 ul van standaard DMEM met behulp van een P200 pipet, het tekenen van de enkele celsuspensie in de 200 ul nonbevelled pipet tip.
  11. Afsluiten van de pipet tip met paraffine film. Plaats de geblokkeerde tip in een 15 ml centrifugebuis en spin down gedurende 5 min bij 300 xg zodat een pellet vormt op het bedekte uiteinde van de punt.
  12. Haal de tip van de 15 ml buis zorgvuldig en plaatsde punt op het uiteinde van het P200 pipet. Gooi de paraffine folie en extrusie van de celpellet op de drijvende filter uit stap 4.8.
    LET OP: Plate ten hoogste 3 aggregaten per filter.
  13. Cultuur de aggregaten op de drijvende 0,65 urn filters gedurende 4-5 dagen in 37 ° C met 5% CO2.
  14. Verzamel de aggregaten (maximaal 3 per filter) met een cel schraper, combineren en verteren met 0,2% collagenase, volgens hetzelfde protocol als gedaan met de hele placenta om de cellen te scheiden (stappen 4,2-4,5).
  15. Na dissociatie, was de aggregaten met 2-5 ml PBS aangevuld met 5% FBS en spin down cellen bij 300 g gedurende 5 min.
  16. Resuspendeer de aggregaten in 500 pl DMEM zonder FBS, P / S of L-GLUT. Neem deze 500 ul resuspensie toevoegen aan 3 ml 1% méthylcellulose medium aangevuld met 10 ng / ml TPO, daarbij vermijdt blaasvorming. Plate gelijke volumes van dit mengsel in 3 35 x 10 mm niet-behandelde cultuur gerechten voorCFU assays 12.
  17. Als controle cultuur bestraald placenta aggregaten zonder menging in reprogrammed MEFs 4-5 dagen plaats CFU assays zoals hierboven beschreven in stappen 4,7-4,16.
    LET OP: Deze aggregaten alleen niet kolonies vormen.
  18. Aantal hematopoietische kolonies handmatig onder de microscoop na 10-14 dagen kweken bij 37 ° C met 5% CO2.
  19. Cytospin 22 kolonies uitgekozen morfologische fenotype van afzonderlijke cellen vertonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hematopoiese is een complexe ontwikkelingsstoornis proces dat begint in verschillende embryonale sites. Hemogenic endotheelcellen wonen in deze sites en aanleiding geven tot HSC via de mobiele ontluikende 23 geven. Dit proces kan op dit moment niet worden gereproduceerd door het plaatsen van HSC of hematopoietische voorlopers in de cultuur, noodzakelijk een methode om deze cellen in vitro of andere manier te verkrijgen, hetzij door HSPC uitbreiding ex vivo of...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Genereren HSPCs de novo uit makkelijk bereikbaar somatische cellen een unieke methode om hematopoëse in vitro, en de mogelijkheid te bestuderen om potentieel deze technologie toe te passen op het menselijk lichaam. Deze vertaling zou een nieuw instrument genereren menselijke hematologische ziekte te bestuderen in een schotel, en verstrekt drug testplatformen en gene targeting mogelijkheden talrijke aandoeningen met nieuwe therapieën of HSC transplantaties behandelen. Ter plaatse recente studies uitgebr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een NHLBI-subsidie aan K.M. en I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was de ontvanger van een Revson Senior Biomedical Fellowship. We danken hartelijk de Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility en S. D'Souza voor hun hulp met materialen en protocollen. We danken ook de Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics en Mouse-faciliteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEMInvitrogen11965-092
0.45 μM filtersCorning430625
Amicon Ultra centrifugal filtersMilliporeUFC900324
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
FBSGemini's Benchmark100-106
PBSLife Technologies14190-144
18 G naaldenBD305195
20 G naaldenBD305175
25 G naaldenBD305125
Collagenase Type ISigmaC0130-100MG
TrypLE ExpressInvitrogen12605-010
Myelocult mediaStem Cell TechnologiesM5300
SCFR & D Systems455-MC
Flt3LR & D Systems427-FL
IL-3R & D Systems403-ML
IL-6R & D Systems406-ML
TPOR & D Systems488-TO
DoxycyclineSigmaD9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide)SigmaAL-118
Durapore 0.65 μM membraanfiltersMilliporeDVPP14250
Methylcellulose mediaStem Cell TechnologiesMethocult M3434
HydrocortisonStem Cell Technologies07904
C57BL/6 muizenThe Jackson Laboratory000664
GelatineSigmaG-1890 100g
pFUW-tetOAddgenePlasmid #20321
Gata2OrigeneMR226728
Gfi1bOrigeneMR204861
cFos AddgenePlasmid #19259
Etv6OrigeneMR207053
psPAX2AddgenePlasmid #12260
pMD2.GAddgenePlasmid #12259
CaCl2SigmaC5670-100g
FUW-M2rtTAAddgenePlasmid #20342
35 mm x 10 mm kweekschotelsThermo Scientific171099

Referenties

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372(2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Overexpressie van transcriptiefactoreninductie van het hemogene programmahematopo tische precursorcellenendotheliale naar hematopo tische transitieGata2 Gfi1b cFos Etv6CD34 tTA TetO H2BGFP muizenCFU assay met methylcellulosekweek van placentale aggregatenDOX induceerbaar systeem
Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.