Method Article

Monstervoorbereiding Mass Cytometry Analysis

DOI:

10.3791/54394

⸱

April 29th, 2017

 ,  , 
1Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft de verzameling en verwerking van monsters voor massa-cytometrie-analyse.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massa gebruikt cytometrie antilichamen geconjugeerd met zware metalen labels, een benadering die sterk het aantal parameters en mogelijkheden voor diepgaande analyse vormt dan mogelijk is met conventionele fluorescentie gebaseerde stroomcytometrie is toegenomen. Zoals met elke nieuwe technologie, zijn er kritische stappen die bijdragen aan een betrouwbare generatie van kwalitatief hoogwaardige data. Hier voorgesteld is een geoptimaliseerd protocol dat meerdere technieken opneemt voor verwerking van celmonsters voor massa-cytometrie analyse. De hier beschreven methoden zal helpen de gebruiker voorkomende valkuilen te vermijden en het bereiken van consistente resultaten door het minimaliseren van variabiliteit, wat kan leiden tot onjuiste gegevens. Experimenteel ontwerp kennis, is de ratio optionele of alternatieve stappen in het protocol en de werkzaamheid bij het blootleggen van de kennis op de biologie van het systeem dat wordt onderzocht afgedekt. Ten slotte is representatieve gegevens gepresenteerd om de verwachte resultaten van de technieken presente illustrerenHier d.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometrie maakt de gelijktijdige meting van verschillende antilichaam doelen op een enkele cel niveau in grote populaties van cellen. In traditionele fluorescentie gebaseerde doorstroomcytometrie, wordt het aantal parameters dat kan worden gekwantificeerd beperkt door spectrale overlap tussen het emissiespectrum van meerdere fluoroforen, die steeds complexer compensatieberekeningen als het aantal parameters toeneemt vereist. Deze beperkingen worden aangepakt massa cytometrie, waarbij heavy metal-geconjugeerde antilichamen gedetecteerd en gekwantificeerd vluchttijd (TOF) massaspectrometrie om het aantal parameters gelijktijdig verzamelde sterk worden vergroot en op een hoge dimensionele eiwit-overvloed profiel van elke individuele cel.

Een fundamenteel begrip van de werking van de massa cytometrie instrument is gunstig voor de gebruiker en kan essentieel zijn voor het oplossen van problemen. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van tuning en het runnen van een massa cytometrie machine,Zie het verwante manuscript 1. In het kort wordt een celmonster gelabeld met een panel van metaal geconjugeerde antilichamen gericht celoppervlak markers, cytoplasmische eiwitten, kerneiwitten, chromatine-gebonden eiwitten of andere epitopen van belang (figuur 1i). De gelabelde cellen worden geladen op de machine, hetzij een voor een handmatig injectie of via een autosampler dat monsters van een 96-wells plaat. De geladen cellen worden geïnjecteerd via een vernevelaar, waarbij een nevel van vloeistofdruppeltjes inkapselen van de cellen (figuur 1ii) genereert. Deze spray is gepositioneerd dat de cellen worden geïoniseerd door een argon plasmatoorts. Deze ionisatie genereert deeltjeswolk omvattende alle samenstellende atomen van elke cel (figuur 1iii). Aangezien deze deeltjeswolk reist naar de detector worden lage atoommassa atomen gescheiden van de hoge massa ionen door vierpool massa filter. De resterende hoge massa ionen blijft de detector, waarbij de abundance van elke isotoop gekwantificeerd (figuur 1iv). De ruwe gegevens verzameld door de detector, worden geanalyseerd door de massa cytometrie instrumentsoftware naar cel gebeurtenissen te identificeren. Voor elke geïdentificeerde cel geval wordt de in elk kanaalsignaal gekwantificeerd en opgeslagen met een uitgang .fcs bestand. De massa kanalen voor het opsporen van zware metalen geconjugeerde antilichamen vertonen een minimale spectrale overlap, dat varieert van 0-4% meeste bijdragen dan 1%. Vanwege deze lage overspraak tussen kanalen, het in het algemeen onnodig om de gegevens om te zetten met een compensatie voor de analyse matrix 2. Er moet echter bij het ontwerp van de experimentele panel van antilichamen worden gelet dat een antilichaam met hoogabondante epitoop niet is toegewezen aan een massa kanaal signaal bijdraagt ​​aan een kanaal toegewezen aan een laagabondante antilichaam, omdat dit maak een kunstmatig hoge populatie in het kanaal ontvangen van het signaal bijdrage.

De exacte bereiding van monsters voor massa-cytometrie analyse is sterk afhankelijk van de soorten monsters verzameld en experimentele hypothese te testen. Wij voorbeelden van twee protocollen voor het oogsten van verschillende typen cellen (humane embryonale stamcellen) en primaire cellen (muis borsttumor epitheelcel isolaat). Bij het begin van een massa cytometrie studie, is het raadzaam om eerst het uitvoeren van een kleine pilot experiment dat alle protocollen en antilichamen worden gebruikt functioneren goed in handen van de onderzoeker. Dit is in het bijzonder essentieel wanneer aangepaste geconjugeerde antilichamen te gebruiken als gedeeltelijke reductiereactie gedurende de antilichaamconjugatie heeft het potentieel om antilichaamaffiniteit verstoren; derhalve elke aangepaste antilichaam moet empirisch gevalideerd om nauwkeurig gegevens. Andere overwegingen omvatten het bepalen of celoppervlak antilichamen in de assay te gebruiken hun epitopen herkennen na fixatie of als ze need moet worden toegepast op levende cellen. Bepaalde fixatie kunnen goede kleuring te voorkomen met celoppervlak antilichamen zoals bekend zijn voor peptide-MHC kleuring 3, 4. Uitvoeren celoppervlak antilichaam kleuring van levende cellen noodzakelijk zijn voor sommige antilichamen, maar de mogelijkheid uitsluit barcodes vóór antilichaammerking de meeste barcodes werkwijzen worden uitgevoerd na fixatie 5 hoewel antilichaam gebaseerde barcoding 6, 7 is een uitzondering.

De bepaling van het aantal cellen te bereiden voor analyse, is het belangrijk te weten dat slechts een fractie van de cellen op het apparaat geladen wordt gedetecteerd en te produceren. Dit verlies is vooral te wijten aan inefficiëntie wanneer de vernevelaar sprays het monster bij de toorts. Het exacte percentage verlies is afhankelijk van de massa cytometrie machine setup en celtype, maar kan variëren van 50-85% bedraagt ​​en moet wordenoverwogen bij het ontwerpen van het experiment. Dit protocol is geoptimaliseerd voor 2x10 6 cellen per monster, maar kan worden aangepast voor het verwerken van kleinere of grotere steekproefomvang. Dit protocol kan worden gebruikt met minimale wijzigingen voor steekproefomvang van 1 x 06-04 oktober x 10 6, maar het is essentieel dat steekproefomvang overeenstemming binnen een experiment worden bewaard. Veranderingen in celaantal kan invloed hebben op de intensiteit van barcodes en antilichaamkleuring en ruwweg overeen worden bewaard in monsters direct te vergelijken.

Sommige procedures, zoals dode cellen en labeling DNA labeling dient in de overgrote meerderheid uitgevoerd, zoniet allemaal proefopzetten. De etikettering van dode cellen in experimenten analyse alleen oppervlaktemerkers kan worden bereikt met behulp Rh103, maar Rh103, te vermijden voor experimenten waarbij permeabilisatie nodig omdat het resulteert in kleuring verlies. Voor experimenten met permeabilisatie, is het raadzaam om cisplatine gebruiken 8 en, indien mogelijk, een antilichaam dat gesplitst PARP of gesplitst caspase apoptotische en dode cellen te detecteren.

Barcodes monsters kan verminderen consumptie antilichaam acquisitietijd verminderen en elimineren van monster tot monster variabiliteit 9. De werkwijze omvat het aanbrengen van barcodes unique sample-specifieke code voor alle cellen, die wordt gebruikt om elke cel toe te wijzen aan het monster van herkomst. Na barcodes de monsters vóór antilichaamkleuring, een proces waarbij alle monsters zijn gelijk gekleurd worden samengevoegd. Experimentele fouten te minimaliseren, is het verstandig om barcode en alle monsters die rechtstreeks worden vergeleken met elkaar bundelen. Momenteel bestaan er verschillende werkwijzen voor barcodes monsters voor massa-cytometrie analyse 5, 6, 7, waarvan er twee worden hier gepresenteerd (zie hieronder).

Met de huidige beschikbare Reagents is het mogelijk om de overvloed van 38 antilichaamdoelen kwantificeren, te identificeren cellen in S-fase 10 onderscheiden levende en dode cellen 8 en meet cellulaire niveaus van hypoxie 11 in een gemultiplexte experiment meerdere monsters. Dit vermogen om hoge parameter eencellige verzamelen van grote celpopulaties maakt verbeterde profilering zeer heterogene celpopulaties en heeft reeds een aantal nieuwe biologische inzichten 12, 13, 14, 15, 16 gevormd. Het destilleren van de resulterende complexe gegevens interpreteerbaar is het gebruik van algoritmes zoals spanning tree progressie van Density genormaliseerde Events (SPADE) 17 en viSNE 18 vereist.

Dit artikel presenteert een toegankelijkeoverzicht van hoe het ontwerpen en uitvoeren van een massa cytometrie experiment en introduceert fundamentele analyse van de massa cytometrie data.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cell Oogsten

  1. Oogsten van cellen uit primair weefsel
    OPMERKING: De werkwijze beschreven voor het oogsten van cellen uit primair weefsel is specifiek van toepassing op muis borst tumor weefsel en mogelijk niet van toepassing zijn primaire weefsels uit andere bronnen.
    1. Bereid digestie buffer door oplossen van 5 mg hyaluronidase en 30 mg collagenase in 10 ml DMEM / F12-medium per gram weefsel te verwerken. Filter steriliseren spijsvertering buffer.
    2. Isoleer primaire tumor borstklier van muizen en opnemen tumorgewicht.
    3. Gehakt weefsel met # 10 scalpel gedurende minstens 5 minuten.
    4. Voeg gehakt weefsel geschikt volume digestiebuffer (10 ml buffer per gram weefsel).
    5. Schud gehakt weefsel in digestiebuffer bij 100 rpm gedurende 1-3 uur bij 37 ° C.
    6. Enkele celsuspensie te verkrijgen door het passeren cellen door 0,4 urn filter in een 50 ml buis.
    7. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 10 min bij 4 °; C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
    8. Resuspendeer pellet in 4 ml DMEM / F12 en overbrengen in 5 mL ronde bodem buis.
  2. Het oogsten van cellen uit weefselkweek
    1. Was plaat of de kolf van hechtende cellen met calcium en magnesium vrij fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur.
      Opmerking: De techniek beschreven voor het oogsten van cellen is specifiek van toepassing op menselijke embryonale stamcellen (hESC) kweekcellen hechtend. De rest van het beschreven protocol is breed toepasbaar op andere gekweekte cellijnen, niet-hechtende lijnen en primaire cellen.
    2. Voeg verwarmde (37 ° C) trypsine of andere enzymatische digestie reagentia geoptimaliseerd voor het bereiken van een enkele celsuspensie van de hechtende cellen. Volg de protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: trypsine en andere enzymatische dissociatie reagentia hebben het potentieel om cellulaire markers beïnvloeden.
    3. Incubeer de plaat 37° C gedurende 2-5 minuten om cellen los te maken. Voor hoge confluentie culturen Tik de plaat voorzichtig los om de cellen.
    4. Transfer vrijstaande cellen van de plaat in een 5 ml rondbodemkolf buis en voorzichtig pipetteren met een 1 ml pipet aan cellen dissociëren.
      OPMERKING: Bij het verwerken van grote aantallen monsters alle stappen kunnen ook worden uitgevoerd in een 96 well plaat met ronde bodem. Onderzoek van de monsters in een well formaat 96 Alle wassingen kan worden uitgevoerd bij een volume van 250 pl. De andere stappen beschreven volumes kunnen worden aangepast zodat het totale volume niet meer dan 300 pl.
    5. Schrik de enzymatische digestie reagens met een gelijk volume wasbuffer (0,5% BSA en 0,02% natriumazide in PBS).
      NB: Natriumazide is een gevaarlijke chemische stof. De juiste voorzorgsmaatregelen in acht worden genomen voor de voorbereiding en behandeling.
    6. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
    7. Resuspendeercellen in 1 ml serumvrij medium.
    8. Aantal cellen door overdracht 10 pi van de celsuspensie op een 1,5 ml microcentrifugebuis. Verdund monster met een bekende verhouding in trypan blauw en overbrengen in een hemocytometer of geautomatiseerde cel telsysteem.
  3. Labeling van S-fase bevolking
    OPMERKING: als S-fase labeling niet te worden uitgevoerd gaan tot stam 1.4.
    1. Bereid 1 ml 10 uM 5-jood-2'-deoxyuridine (IDU) in serumvrij DMEM F12 of andere geschikte media voor elke 2 x 10 6 cellen te analyseren.
    2. Voeg 500 ul van 10 uM IDs uit serumvrij medium per 2 x 10 6 cellen.
      OPMERKING: Hoewel IDU labeling kan worden uitgevoerd in medium dat serum, zal vrij proteïne reageren met cisplatine, zodat deze niet goed labeling van dode cellen. Als medium dat serum bevat wordt gebruikt tijdens het labelen IDU een additionele wasstap is serumvrij medium moet serumeiwitten te verwijderen vóór cisplatine levende / dode staining.
    3. Voorzichtig mengen korrels met 1 ml pipet.
    4. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C onder voorzichtig schommelen.
  4. Levend / Dead labeling
    1. Voor elk monster te bereiden 500 pl 50 pM cisplatine in serumvrij DMEM-F12 of celtype geschikte media.
      Opmerking: Als het kenmerken van de S-fase bevolking IDU niet wordt uitgevoerd, resuspendeer monsters in een concentratie van 4 x 10 6 cellen / ml. Resuspenderen van de cellen voor het toevoegen van cisplatine in staat stelt sneller mengen van oplossingen voor uniforme levend / dood labeling.
    2. Voeg 500 ul van 50 uM cisplatine per 2 x 10 6 cellen monsters.
    3. Incuberen bij kamertemperatuur (KT) gedurende 1 minuut op een orbitale schudder onder constant mengen.
    4. Schrik de cisplatine met een gelijk volume wasbuffer.
    5. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
    6. Spoelmonsters tweemaalmet 500 ui wasbuffer gewassen om overmaat cisplatine te verwijderen.
    7. Spoelmonsters tweemaal met 500 pl PBS om overmaat eiwit te verwijderen.
  5. sample fixatie
    1. Resuspendeer monster in 500 pl PBS.
    2. Voeg gelijk volume 4% PFA in PBS om een ​​uiteindelijke concentratie van 2%; pipet te mengen.
      OPMERKING: Bereid 4% PFA vers van poeder, de pH instellen op 6,9 en door een 0,44 urn filter. 4% PFA in PBS kunnen tot twee weken worden bewaard bij 4 ° C. Voorkomen premade formaline in ampullen geleverd, tenzij specifiek getest door, aangezien vaak metaalverontreinigingen die kunnen interfereren met de gemeten massa kanalen. Lagere concentratie van PFA voldoende zijn en om het effect van fixatie op antilichaambinding minimaliseren maar moet empirisch worden getest.
    3. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder onder constant mengen.
    4. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Decanteren of voorzichtig zuig het supernatant without verstoring van de pellet.
    5. Wassen monsters met PBS PFA oplossing te verwijderen.
      OPMERKING: Bij deze stap monsters kan kort worden bewaard bij 4 ° C. Langdurige opslag bij 4 ° C kan leiden tot degradatie van het monster en verminderde kleuring.

2. Barcoding

Opmerking: Als methode voor het gebruiken monoisotopisch cisplatine barcodes en palladium barcodes gelijktijdig gepresenteerd, ofwel onafhankelijk worden gebruikt of geheel vermeden indien niet vereist het experiment.

  1. Monoisotopisch Cisplatin barcodes
    OPMERKING: Omdat cisplatine barcoding en cisplatine Levend / Dead kleuring vertrouwen op overlappende kanalen zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de achtergrond cisplatine Levend / Dead kleuring in de levende cellen wordt geminimaliseerd, omdat dit kan interfereren met de nauwkeurigheid van de cisplatine barcode.
    1. Verdun 1 mM monoisotopisch cisplatine voorraadoplossingen tot 200 uM in PBS.
    2. voor each unieke barcode cisplatine stelt een 1,5 ml buis met 500 ui PBS per 2 x 10 6 cellen ontvangen die barcode.
    3. Ter voorbereiding elke unieke barcode toe te voegen elke toepasselijke monoisotopisch cisplatine tot een uiteindelijke concentratie van 200 nM.
    4. Resuspendeer cellen in 500 pl PBS per 2 x 10 6 cellen.
    5. Voeg een gelijk volume van de corresponderende streepjescode oplossing aan elk monster.
    6. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op een schudapparaat onder constant mengen.
    7. Blus cisplatine met een gelijk volume wasbuffer.
    8. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
    9. Spoelmonsters tweemaal met 500 ui wasbuffer gewassen om overmaat cisplatine te verwijderen.
  2. palladium barcodes
    OPMERKING: Palladium barcoding reagentia kunnen zowel bereid 5 of commercieel gekocht.
    1. voorbijgaande gedeeltelijkepermeabilisatie 19
      OPMERKING: Palladium chelatie barcodes vereist partiële permeabilisatie van de reagentia door het celmembraan passeren en robuust etiket van de cel.
      1. Spoelmonsters met 500 pi PBS.
      2. Spoelmonsters met 500 pi PBS plus 0,02% saponine.
      3. Resuspendeer pellet in restvolume.
    2. Breng palladium barcoding.
      1. 100x verdunde stock palladium barcodes reagens in 1 ml ijskoude PBS plus 0,02% saponine.
      2. Voeg snel verdunde barcode reagens geresuspendeerd monster.
      3. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder bij onder constant mengen.
      4. Spoelmonsters tweemaal met 500 ul wasbuffer.

3. celoppervlakkleuring

OPMERKING: celoppervlakkleuring kan worden uitgevoerd op levende cellen voorafgaand aan de fixatie. Dit kan nodig zijn om antilichamen die affiniteit verliezen their epitoop na fixatie. Sommige mobiele monsters kunnen profiteren van extra blokkeren, zoals Fc blokkeren voor leukocyten, voorafgaand aan het antilichaam labeling om de achtergrond te verminderen. Optimale blokkering moet empirisch worden bepaald voor specifieke monster.

  1. Bereid celoppervlak antilichaamkleuring paneel.
    1. Combineer 0,5 gl of empirisch bepaalde hoeveelheid van elk 0,5 mg / ml celoppervlak antilichaam per monster in een 1,5 ml buis. Voeg wasbuffer eventueel volume te brengen tot 10 pi per monster. Meng door pipetteren.
      OPMERKING: Bepaal werken verwatering voor elk antilichaam voorafgaand aan empirisch experimenteren door titratie experiment.
    2. Gespleten celoppervlak antilichaampoel even in een 1,5 ml buis voor elk monster te worden gemerkt.
    3. Bereid 500 pl wasbuffer in een 1,5 ml buis voor elk monster.
  2. Breng celoppervlakkleuring om monsters in genormaliseerd volume voor alle monsters.
    LET OP: Om ensure consistente antilichaam labeling meerdere monsters is het essentieel om het monstervolume en de antilichaamconcentratie zorgvuldig controleren. De volgende stappen proberen dit consistentie door ervoor te zorgen dat de uiteindelijke monstervolumes nadat het antilichaam is toegevoegd uniform.
    1. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
    2. Met een 200 pl pipet ingesteld op 50 pl, verwijdert overgebleven oplossing uit monster pellet overgebracht in een buis van de gealiquoteerde celoppervlak antilichaampoel.
    3. Pipet alle vloeistof in het monster buis zonder daarbij lucht in de pipetpunt.
    4. Houd de pipet zuiger te voorkomen waardoor lucht beweegt de punt in een voorbereide buis van 500 pi wasbuffer en de plunjer los.
    5. Weer toevoegen van de inhoud van de pipetpunt het monster en resuspendeer het monster in de vloeistof met voorzichtig pipetteren.
    6. Incubeer de monsters gedurende 1h bij kamertemperatuur op een orbitale schudder onder constant mengen.
    7. Spoelmonsters tweemaal met 500 ui wasbuffer dat alle vrije antilichaam wordt weggewassen.
    8. Spoelmonsters met 500 pi PBS.
    9. Resuspendeer de celpellet in 500 ui PBS.
    10. Voeg gelijk volume 4% PFA in PBS; pipet te mengen.
    11. Incubeer gedurende 10 minuten op een rondschudapparaat.

4. celpermeabilisatie en intracellulaire kleuring

  1. celpermeabilisatie
    1. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
    2. Resuspendeer cellen in restvolume door voorzichtig vortexen totdat de pellet wordt gedissocieerd.
      OPMERKING: Niet cellen voorafgaand aan het toevoegen van MeOH resulteert in cellen elkaar hechten en het vervaardigen van een dunne film die resulteert in deelmonsters verlies dissociëren.
    3. Onmiddellijk voeg 1 ml 100% MeOH per 2 x 10 6 </ Sup> cellen en voorzichtig pipet te mengen.
      OPMERKING: Andere permeabilisatie werkwijzen kan vervangen MeOH en kan nodig zijn om optimale permeabilisatie bereiken voor bepaalde celtypen. Voor sommige celbronnen 0,1% Triton X-100, 0,2% Tween-20 en 0,1% saponine in PBS oplossing permeabilisatie kan celintegriteit beter handhaven terwijl toch consistente permeabilisatie.
    4. Incubeer monsters gedurende ten minste 1 uur en tot maximaal 24 uur bij 4 ° C gedurende permeabilisatie.
      LET OP: Bij deze stap samples in MeOH kan worden opgeslagen voor maximaal 1 maand bij -80 ° C.
    5. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
    6. Voeg 1 ml wasbuffer per ml MeOH gebruikt om het monster permeabel. Voorzichtig resuspendeer celpellet.
    7. Was monster tweemaal met 500 ul wasbuffer.
  2. Bereid intracellulaire antilichaam kleuring paneel.
    1. Combineer 0,5 gl of empirisch bepaalde hoeveelheid van elk 0,5 mg / ml antilichaam intracellulair per monster in een 1,5 ml buis. Voeg wasbuffer eventueel volume te brengen tot 10 pi per monster. Meng door pipetteren.
    2. Split intracellulaire antilichaamverzameling even in een 1,5 ml buis voor elk monster.
    3. Bereid 500 ul wasbuffer in een 1,5 ml buis voor elk monster.
  3. Breng intracellulaire kleuring om monsters in genormaliseerd volume voor alle monsters.
    Opmerking: Voor een betrouwbare antilichaam labeling meerdere monsters is het essentieel om het monstervolume en de antilichaamconcentratie zorgvuldig controleren.
    1. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
    2. Met 200 pi pipet wordt 50 pl verwijderen resterende oplossing uit monster pellet overgebracht in een buis van de gealiquoteerde celoppervlak antilichaampoel.
    3. Pipetalle vloeistof in het monster buis zonder daarbij lucht in de pipetpunt.
    4. Houd de pipet zuiger te voorkomen waardoor lucht beweegt de punt in een voorbereide buis van 500 pi wasbuffer en de plunjer los opstelling wasbuffer voor een totaal monstervolume van 50 ul.
    5. Weer toevoegen van de inhoud van de pipetpunt het monster en resuspendeer het monster in de vloeistof met voorzichtig pipetteren.
    6. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een orbitale schudder onder constant mengen.
    7. Spoelmonsters tweemaal met 500 ul wasbuffer.
    8. Spoelmonsters met 500 pi PBS.

5. Iridium Labeling

  1. fix monsters
    1. Resuspendeer monsters in 500 ul PBS.
    2. Voeg 500 ul van 4% PFA in PBS.
    3. Incubeer gedurende minimaal 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder onder constant mengen.
  2. Breng Iridium etikettering van DNA
    1. Verdun 125 uM 500x iridium intercalatie reagens in 4% PFA in PBS tot een concentratie van 62,5 nM.
    2. Voeg 500 ul 62,5 nM iridium PFA oplossing voor samples.
      LET OP: Voor experimenten met gepermeabiliseerde cellen, verdunnen de 500x Ir191 / 193 voorraad voor een uiteindelijke verdunning van 1: 2.000 tot overstaining voorkomen.
    3. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder onder constant mengen.
      OPMERKING: Bij het uitvoeren monoisotopisch cisplatine barcodes niet monsters met iridium incuberen langer dan 15 minuten sinds Ir193 sterke signalen kunnen bijdragen aan het Pt194 massa kanaal en negatieve invloed barcodes kwaliteit.
    4. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
    5. Spoelmonsters tweemaal met 500 gl 0,1% BSA in gefilterd gedeïoniseerd water.
      LET OP: Na bereiding we raden u monsters binnen 24 uur indien mogelijk. Bereide monsters kunnen worden opgeslagen op korte termijn bij 4 ° C,maar zorg moeten worden genomen om degradatie te voorkomen. Indien mogelijk eindspoelingen worden uitgevoerd in gefilterd gedeïoniseerd water zonder BSA omdat dit de afzetting op de sproeikamer samplerprimitieven kegels van de machine die instrument reiniging afneemt zal afnemen. Voor hESCs is het noodzakelijk deze wasbeurten uitvoeren terwijl inclusief BSA monster verlies plakken aan het buisoppervlak te vermijden.

6. Bereid Monsters voor Acquisition

  1. tellen cellen
    1. Resuspendeer cellen in 500 gl 0,1% BSA in gefilterd gedeïoniseerd water en filter in een nieuwe buis door een 35 urn zeef cel cap.
      Opmerking: Het verlagen van de BSA-niveau voor de eindspoelingen vermindert het residu op Mass cytometrie vernevelaar. Niet hechtende cellen worden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in gedeïoniseerd water gefilterd.
    2. Aantal cellen door overdracht 10 pi van de celsuspensie op een microcentrifugebuis. Verdund monster met een bekende verhouding intrypan blauw (om te helpen bij celvisualisatie) en overbrengen naar een hemocytometer of geautomatiseerde cel telsysteem.
    3. Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Giet of voorzichtig het supernatans aspireren zonder de pellet te verstoren.
  2. Voorbereiden en load samples
    1. Ter voorbereiding kalibratie korrels te verwijderen uit de koelkast en schud krachtig mengen.
    2. Als running monsters met behulp van een massa cytometrie autosampler, voeg 50 ul van kalibratie kralen aan elk putje van de monsterplaat voeg het gewenste aantal cellen te analyseren. Indien monsters lopen door handmatige injectie voeg 50 ul van kralen kalibratie monsters, verdund monster in gefilterd gedeïoniseerd water, meng en laden monster in Mass cytometrie monster injectiepoort. De juiste verdunning van het monster kan variëren afhankelijk van het celtype geanalyseerd, maar een verdunning van 10 6 1 algemeen geschikt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier gepresenteerde kunnen algemeen worden toegepast op een grote verscheidenheid van gekweekte primaire en celmonsters met slechts geringe modificaties. Afhankelijk van de vereisten van het experiment kan worden uitgevoerd op een modulair wanneer bepaalde elementen, zoals barcodes of celoppervlakkleuring, niet nodig. Gebruikt in zijn geheel dit protocol maakt de bereiding gemultiplexte massa cytometrie monsters gelabeld voor dood voor cellen, S-fase identificatie van popula...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier gepresenteerde is met succes toegepast voor het verwerken van verschillende gekweekte cellijnen (H1 en H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) en monsters primair weefsel (muisbeenmerg, muis embryonale lever, muis volwassen lever, muizentumor). Ongeacht de bron, elk weefsel dat kan worden gedissocieerd tot losse cellen met behoud van de cellulaire toestand vatbaar zijn voor analyse met massa- cytometrie moet zijn, maar kunnen een protocol optimalisatie vereisen. Het is belangrijk op te merk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in het Barton-lab werd ondersteund door een subsidie van het Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door een trainingssubsidie voor Ryan L. McCarthy van het National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. De kernfaciliteit die het massa-cytometrieapparaat onderhoudt en beheert, wordt ondersteund door CPRIT-subsidie (RP121010) en NIH-kernsubsidie (CA016672).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
mTeSR1 medium kitStem Cell technologies05850Opwarmen op kamertemperatuur voor gebruik
DMEM F-12ThermoFisher11330-032Opwarmen op 37 °C voor gebruik
AccutaseStem Cell technologies07920Opwarmen op 37 °C voor gebruik
Bovine serum albuminEquitechBAH62
phosphate buffered salineHycloneSH30256.01
SaponinSigma-Aldrich47036
Cell ID Pt194FluidigmWordt geleverd bij 1 mM
Cell ID Pt195FluidigmWordt geleverd bij 1 mM
Cell ID Pt196FluidigmWordt geleverd bij 1 mM
CisplatinEnzo Life SciencesALX-400-040-M250Oplosbaar tot 25 mg/mL in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding KitFluidigm201060
5-Iodo-2'-deoxyuridineSigma-AldrichI7125Oplosbaar tot 74 mg/mL in 0.2 N NaOH
Rhodium 103 intercelating agentFluidigm201103A
MethanolFisherBP1105-4Afkoelen bij -20 °C voor gebruik
Sodium AzideSigma-AldrichS2002
5 mL round bottom tubesFalcon352058
5 mL 35 μm filter cap tubesFalcon352235
EQ four element calibration beadsFluidigm201078
Hyaluronidase Type I-SSigma-AldrichH3506
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma-AldrichC9891
Disposable Scalpel #10Sigma-AldrichZ69239

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398(2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
  3. Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
  4. Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
  5. Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
  6. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
  7. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
  8. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
  9. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
  10. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
  11. Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
  12. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  13. Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).
  14. Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
  15. Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
  16. Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
  17. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  18. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
  19. Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
  20. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
  21. Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
  22. Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
  23. Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
  24. van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
  25. Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
  26. Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
  27. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
  28. Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
  29. Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass CytometrySample PreparationCell StainingCisplatin LabelingAntibody CocktailIridium LabelingSPADE AlgorithmFlow CytometrySingle Cell AnalysisCell Permeabilization

Related Articles