De synthese van RGD-gefunctionaliseerde Hydrogels als een instrument voor therapeutische toepassingen

Samenvatting

We presenteren een protocol voor de synthese van RGD-gefunctionaliseerde hydrogels als apparaten voor cel- en geneesmiddelafgifte. De procedure omvat koper gekatalyseerde alkyn-azide cycloadditie (CuAAC) tussen alkyn-gemodificeerde polyacrylzuur (PAA) en een RGD-azide-derivaat. De hydrogels worden gevormd met behulp van microgolf-geassisteerde polycondensatie en hun fysisch-chemische eigenschappen worden onderzocht.

Samenvatting

Het gebruik van polymeren als biomaterialen heeft aanzienlijke voordelen opgeleverd in therapeutische toepassingen. Met name de mogelijkheid om polymeerketens te modificeren en functioneel te maken met verbindingen die de biocompatibiliteit, mechanische eigenschappen of cellevensvatbaarheid kunnen verbeteren, maakt het ontwerp van nieuwe materialen mogelijk om aan nieuwe uitdagingen in de biomedische sector te voldoen. Met de functionele polymere strategieën is klikchemie een krachtig hulpmiddel om de celcompatibiliteit en eigenschappen voor geneesmiddelafgifte van polymere apparaten te verbeteren. Evenzo leidt de fundamentele behoefte van de biomedische wetenschap om steriele gereedschappen te gebruiken om mogelijke nadelige bijwerkingen, zoals toxiciteit of besmetting van de biologische omgeving, te voorkomen, tot een toenemende interesse in de microgolf-geassisteerde strategie.

De combinatie van klikchemie en de microgolf-geassisteerde methode is geschikt om biocompatibele hydrogels met gewenste functionaliteiten en verbeterde prestaties in biomedische toepassingen te produceren. Dit werk heeft tot doel RGD-gefunctioneerde hydrogels te synthetiseren. RGD (arginylglycylasparaginezuur) is een tripeptide dat celadhesie-eiwitten kan nabootsen en zich kan binden aan celoppervlaktereceptoren, waardoor een gastvrije micro-omgeving voor cellen binnen het 3D-polymere netwerk van de hydrogels wordt gecreëerd. RGD-functionalisatie vindt plaats door middel van Huisgen 1,3-dipolaire cycloadditie. Sommige PAA-carboxylgroepen worden gemodificeerd met een alkyngroep, terwijl RGD wordt gefunctioneerd met azidozuur als de terminale rest van de peptidesequentie. Ten slotte worden beide producten gebruikt in een kopergekatalyseerde klikreactie om het peptide permanent aan PAA te koppelen. Dit gemodificeerde polymeer wordt gebruikt met carbomer, agarose en polyethyleenglycol (PEG) om een ​​hydrogelmatrix te synthetiseren. De 3D-structuur wordt gevormd door een veresteringsreactie waarbij carboxylgroepen van PAA en carbomer en hydroxylgroepen van agarose en PEG betrokken zijn door microgolfgeassisteerde polycondensatie. De efficiëntie van het gelatiemechanisme zorgt voor een hoge mate van RGD-functionalisatie. Bovendien is de procedure om therapeutische verbindingen of biologische gereedschappen binnen dit gefunctioneerde netwerk te laden zeer eenvoudig en reproduceerbaar.

Inleiding

Hydrogelen driedimensionale netwerken gevormd door hydrofiele verknoopte polymeren, die natuurlijk of synthetisch, en gekenmerkt door een opvallende driedimensionale structuur. Deze apparaten zijn steeds aantrekkelijker in de biomedische gebied van drug delivery, tissue engineering, gen vervoerders en slimme sensoren ^1,2. Inderdaad, het hoge watergehalte, evenals hun reologische en mechanische eigenschappen maken ze geschikte kandidaten zacht weefsel micromilieus nabootsen en ze doeltreffende instrumenten voor in water oplosbare cytokine of groeifactor levering. Een van de meest veelbelovende toepassing is als een injecteerbaar biomateriaal dragende cellen....

Protocol

Opmerking: De chemicaliën worden gebruikt zoals ontvangen. Lineair RGD wordt gekocht, maar het kan worden bereid met standaard Fmoc vaste fase peptidesynthese ^16,19. Oplosmiddelen zijn van analytische kwaliteit. De dialyse vereist het gebruik van een membraan met _Mw cut-off gelijk aan 3500 Da. De gesynthetiseerde verbindingen worden gekenmerkt door ^1H NMR-spectra opgenomen op een 400 MHz spectrometer met chloroform _(CDCI3) of deuteriumoxide _(D2O) als oplosmiddelen en chemische verschuivingen worden weergegeven als δ waarden in ppm. Bovendien zijn hydrogels onderworpen FT-IR analyse met KBr pellet techniek en de f....

Resultaten

De PAA alkyn derivaat efficiënt gesynthetiseerd uit polyacrylzuur en propargylamine, zoals getoond in figuur 1 waarbij n labelt de monomeren waarvan de carboxylgroepen reageren met het amine. De identiteit van het product wordt bevestigd door ^1H-NMR spectroscopie. Figuur 5 toont het ^1H-NMR spectrum van PAA gemodificeerd met drievoudige binding.

Discussie

De PAA post-polymerisatiemodificatie met alkyngroepjes en de RGD functionarisering met de azidegroep garanderen de vorming van een stabiele binding tussen het polymeer en het peptide. Inderdaad dient triazool als een stijve verbindingseenheid tussen de koolstofatomen, bevestigd aan de 1,4 posities van de 1,2,3-triazoolring en het kan niet hydrolytisch of anderszins worden afgebroken. Bovendien is triazool uiterst moeilijk te oxideren en te reduceren, in tegenstelling tot andere cyclische structuren zoals benzeenoïden en .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Poly(acrylic acid) oplossing gemiddeld Mw ~100.000, 35 wt% in H2O	Sigma Aldrich	523925	CAS 9003-01-4
Poly(ethyleenglycol) 2.000	Sigma Aldrich	84797	CAS 25322-68-3
Carbomer 974P	Fagron	1387083
Agarose	Invitrogen Corp.	16500-500	UltraPure Agarose
RGD-peptide	abcam	ab142698
4-azidobutaanzuur	Aurum Pharmatech	Z-2421	CAS 54447-68-6
Oxalylchloride	Sigma Aldrich	O8801	CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95%	Sigma Aldrich	P50919	CAS 15430-52-1
Koper(I)jodide	Sigma Aldrich	3140	CAS 7681-65-4
Natriumascorbinat	Sigma Aldrich	Y0000039	CAS 134-03-2
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	Sigma Aldrich	P4417
Dialysemembraan	Spectrum Laboratories, Inc.	132725	Spectra/Por 3 dialysemembraan  Standaard RC-slang MWCO: 3,5 kD