Oprichting van abdominale verklevingen in Muizen

Samenvatting

Buikhachten die zich na een operatie vormen, zijn een belangrijke oorzaak van pijn, onvruchtbaarheid en ziekenhuisopname en heroperatie voor obstructie van de dunne darm. Onze chirurgische procedure voor het creëren van buikadhesies bij muizen is een betrouwbaar hulpmiddel om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van adhesies te bestuderen.

Samenvatting

Buitenvliesaanklevingen bestaan uit fibrotisch weefsel dat zich vormt in de buikholte als reactie op een ontstekingsreactie, meestal door een operatie of een infectie in de buikholte. De precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van aanklevingen worden slecht begrepen. Veel verbindingen en fysieke barrières zijn getest op hun vermogen om aanklevingen na een operatie te voorkomen, met wisselende successen. De muis en de rat zijn belangrijke modellen voor de studie van buikvliesaanklevingen. Er bestaan verschillende technieken voor het creëren van aanklevingen bij de muis en de rat in de literatuur. Hier beschrijven we een protocol dat gebruik maakt van het schuren van het blinddarm met schuurpapier en het plaatsen van hechtingen in de rechter buikwand. De muis wordt onder narcose gebracht en de buik wordt voorbereid. Er wordt een middenlijnlaparotomie gemaakt en de blinddarm wordt geïdentificeerd. Schuren wordt gebruikt om het oppervlak van de blinddarm voorzichtig te schuren. Vervolgens worden er verschillende figuur-van-acht-naden in het buikvlies van de rechter buikwand geplaatst. De buikholte wordt gespoeld, er wordt een kleine hoeveelheid zetmeel aangebracht en de incisie wordt gesloten. We hebben gevonden dat deze techniek de meest consistente aanklevingen produceert met de laagste sterfteratio.

Inleiding

Abdominale adhesies zijn een vorm van littekenweefsel die zich in de buik in reactie op ontsteking, gewoonlijk na een operatie of intraabdominal infectie. Verklevingen zijn een belangrijke oorzaak van chronische buikpijn en onvruchtbaarheid, en zijn de meest voorkomende oorzaak van kleine darmobstructie ^1. De aanwezigheid van adhesies maakt het uitvoeren van een tweede buikoperatie moeilijker en vergroot de kans op complicaties ^2.

Ondanks jaren van onderzoek, blijven de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van verklevingen slecht begrepen. Het is bekend dat een initiële verwonding aan het peritoneale oppervlak veroorzaakt een afscheiding van fibrine-rijke vloeistof, die vervolgens vormt een stolsel dat het oppervlak van de darm en de buikwand elkaar ³ bindt. Later, fibroblasten en andere cellen migreren in de lijm ruimte en uitscheiden bindweefsel ^4. Gedurende maanden tot jaren de hechting rijpt door het ontwikkelen bloedvaten en zenuwen ^5.

Verschillende commerciële producten bestaan ​​die zijn ontworpen om de vorming van verklevingen na een buikoperatie (bijvoorbeeld Seprafilm) verminderen. Al deze producten dienen als mechanische barrières en stop adhesies door het voorkomen van fysiek contact tussen de lussen van de darm en de buikwand ^6,7. Ondanks aanwijzingen bij een gecontroleerd onderzoek met een chirurgische adhesie barrière vermindert de vorming van verklevingen ^8, anekdotische veel chirurgen teleurgesteld met de effectiviteit van mechanische barrière producten.

Er zijn nog geen medicamenteuze anti-adhesie therapieën, waarbij het feit dat de precieze processen van vorming van verklevingen slecht begrepen weerspiegelt. Het ontwikkelen van een therapie gericht tegen cellulaire of moleculaire middelen betrokken bij de vorming van verklevingen zal een beter begrip van de gebeurtenissen die betrokken zijn bij de vorming van de hechting vereisen. verschillende groeps hebben moleculaire wegen die belangrijk zijn voor de vorming van verklevingen ^9-11 kunnen worden geïdentificeerd. Dierlijke modellen bieden een uitstekende omgeving voor het bestuderen van de vorming van verklevingen. Veel studies zijn gepubliceerd waarin de chirurgische creatie van de hechting in verschillende dieren, met name de ratten en muizen ^6,12-14. Gezien onze ervaring met het bestuderen van fibrose in de muis en de ruime beschikbaarheid van transgene muizen en muis-gebaseerde antilichamen, kozen we de muis als ons model voor de studie van verklevingen. Hierin beschrijven we de techniek die we hebben ontwikkeld om reproduceerbare en betrouwbare wijze maken abdominale adhesies in de muis.

Protocol

Het volgende protocol werd goedgekeurd door de Stanford University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en voldoet aan alle institutionele ethische richtlijnen met betrekking tot het gebruik van proefdieren.

1. Oprichting van abdominale verklevingen

1. Start de muis in antibiotische chow dieet een week voorafgaand aan de procedure.
2. Autoclaaf de chirurgische instrumenten en pre-warm het zoute irrigatie-oplossing.
3. Verdoven van de muis met behulp van 2% geïnhaleerde isofluraan.
4. Met een tondeuse gevolgd door een snelle applicatie (5-10 sec) van ontharingsmiddel, verwijder het haar van het grootste deel van het oppervlak van de buik. Verwijder zorgvuldig de ontharingsmiddel door voorzichtig af te vegen met natte gaas en, eventueel, door voorzichtig het onderdompelen de onderste helft van de muis in warm water. Droog het dier.
5. Plaats snuit van het dier in het verdovingsmiddel neuskegel. Gedurende de gehele operatie zorgvuldig toezien op de respiratory snelheid van het dier en titreer de verdoving debiet als dat nodig is.
6. Gebruik een warming-apparaat, zoals een verwarmingselement of een verwarmende lamp, om onderkoeling te voorkomen.
7. Voorafgaand aan prepping de buik, zet de muis met afplakband boven en onder de buik geplaatst om te voorkomen dat de muis verschuift tijdens chirurgie. Ontsmet de buik met betadine, volgt daarna met 70% ethanol. Sluiten zoveel mogelijk gebied in de prep, waaronder het haar op de randen van het geschoren gebied. Plaats een steriel laken over de muis. (Figuur 1)
8. Subcutaan injecteren 0,1 mg / kg buprenorfine of 3 ug voor een 30 g muis.
9. Maak de huid incisie.
   1. Beginnend in de onderbuik middellijn, pakt de huid met een tang en een ondiepe verticale snede in de huid met behulp van een scherpe schaar.
   2. Draag de cut superieur aan de xyphoid met de schaar. Zorg ervoor dat alleen de huid in te voeren.
10. Aangezien de buikspieren now zichtbaar voor de ingewanden, het grijpen van de middellijn van de spieren met een tang en heel voorzichtig een kleine snee in met behulp van een scherpe schaar. Zorg ervoor dat niet per ongeluk in een abdominale orgel te snijden.
11. Na invoer van de peritoneale ruimte met een klein sneetje en zien de spierlaag weg te trekken van de buikorganen verlengen de snede craniaal en caudaal aan door de schaar in de opening en zorgvuldig snijden in beide richtingen. Verleng de incisie van de xyphoid superieur tot boven de blaas inferieur. (Figuur 2)
12. Nu dat de darmen worden blootgesteld, zoek de blindedarm en voorzichtig exterioriseren het. Vermijd grijpen de blindedarm met getande of scherpe tang. In plaats daarvan een atraumatische tang zoals een getande Adson pincet.
13. Schuur de blindedarm met schuurpapier.
    1. Voorzichtig schuren het gehele oppervlak van beide zijden van de blindedarm met 100 grit schuurpapier 30-60 seconden totdat het oppervlak minder glanzend en petechiae appear op het oppervlak. Als de chirurg rechtshandige is, helpt het om de blindedarm met de punt naar rechts te oriënteren en drapeer de blindedarm dan linker wijsvinger van de chirurg. (Figuur 3)
    2. Voer het schuren voorzichtig, omdat het gemakkelijk is om een ​​perforatie van de dunne wand blindedarmkeutels ongeluk veroorzaken. Een kleine hoeveelheid korreligheid worden gevoeld als schuurpapier wordt bewogen langs het oppervlak cecal. Als het schuurpapier herhaaldelijk gevoeld slaat aan de blindedarm, zal dit waarschijnlijk leiden tot een scheur in de cecale wand. Kijk zorgvuldig zodat deeltjes schuurpapier niet los en blijft in de buik door een te hoge vreemd lichaam reactie kan veroorzaken.
    3. Indien een scheur in de wand optreedt blindedarmkeutels beëindigen het procesverloop en inslapen het dier.
    4. Als een blindedarmkeutels bloedvat wordt geschoren door de schuurpapier en er bloedingen optreden, houdt de druk voor maximaal twee minuten met een gaasje. Echter, als bloeden aanhoudt na deze tijd, plaats een cijfer-van-acht 7-0 monofilament hechtdraad rond depunt van bloeden. Dit betrouwbare stoppen bloeden in bijna alle gevallen. Zorg ervoor dat u een grote hoeveelheid blindedarmkeutels muur op te nemen in de hechtdraad, omdat dit risico veroorzaakt necrose van het betrokken deel van de muur.
14. Verwonden de juiste buik zijwand.
    1. Gebruik een strook schuurpapier om het peritoneale oppervlak van de spier van de rechter abdominale zijwand schuren. Agressiever het schuren hier dan aan de blindedarm en voortgezet totdat het gehele oppervlak van de rechter abdominale zijwand weergegeven opgeruwd. Vermijd het schuren zo hard dat de huid zichtbaar is door de openingen in de spierlaag. (Figuur 4)
    2. Met behulp van een Castro-Viejo naald driver, plaats tussen de twee en vier cijfer-van-acht 4-0 zijde hechtingen in de spierlaag van de rechter abdominale zijwand. Laat de staarten ongeveer 5 mm lang. Zorg ervoor dat u darmwand per ongeluk vangen in de hechtdraad. (Figuur 5)
15. Met behulp van een 10 ml injectiespuit gevuld wet verwarmde zoutoplossing, irrigeren de darmen meerdere malen. Richt de stroom van zoutoplossing in de buikholte naar het inwendige irrigeren ook. Als het oppervlak onder de muis wordt doorweekt, beweeg de muis over of het oppervlak te vervangen, om onderkoeling te voorkomen.
16. Gebruik een steriel gaasje geplaatst over de incisie om te genieten van overtollige irrigatie.
17. Neem een ​​snuifje van zetmeel en strooi het op het oppervlak van de rechter abdominale wand en op beide zijden van de blindedarm. (Figuur 6)
18. Zorg ervoor dat er geen actieve bloeden. Als er is, gebruik dan een gaasje spons om druk rechtstreeks toe te passen op het punt van het bloeden tot hij stopt. Als het bloeden niet snel stopt, plaats een hemostatische hechting zoals hierboven beschreven.
19. Met het stompe uiteinde van de tang en een vinger duw de darm terug in de buikholte. Plaats de blindedarm naast de hechtingen in het rechter abdominale zijwand om adhesies te maximaliseren.
20. Cverliest de incisie in de buik.
    1. Gebruik 6-0 absorbeerbare gevlochten hechtmateriaal, plaats een rijgsteek in de spierlaag aan de bovenkant van de incisie.
    2. Run de hechting beneden naar de onderkant van de incisie, het samenbrengen van de spierlaag. Reis met ongeveer 3 mm en neem 3 mm beten met elke nieuwe steek. Zorg ervoor dat u per ongeluk een hap van de darm te nemen terwijl het plaatsen van hechtingen.
    3. Onderaan de incisie, laat een lus van hechtdraad uit de vorige beet en gebruik dit instrument bind de hechtdraad. Snijd de hechtdraad verlaten 5 mm staarten.
    4. Herhaal de bovenstaande drie stappen met 6-0 nylon monofilament hechting aan de huid te sluiten.
21. Dien een 20 ml / kg subcutaan zoutoplossing bolus (ongeveer 0,5 ml van een 30 g muis).
22. Met behulp van een droog gaas, drogen het hele dier, als de dorsale vacht heeft de neiging om nat te worden tijdens irrigatie.
23. Losjes wikkel een kleefverband rond de buik om de incisie te dekken. Zorg ervoor dat u het een beperkennimal's benen of ademhaling mechanica met de dressing.
24. nauwlettend het dier als het herstelt van anesthesie. Dien buprenorfine elke 12 uur gedurende 2-3 dagen na de procedure voor pijnbestrijding.

2. Oogsten Adhesie Tissue

1. Wacht minimaal zeven dagen na de initiële operatie. Nogmaals, autoclaaf chirurgische instrumenten en verdoven de muis met isofluraan.
2. Steriliseer de buik met betadine, gevolgd door 70% ethanol. Scheren en ontharen extra haar van de rechterkant van de buik, zodat de hechting specimen met de huid niet zal worden besproken in haar, dat histologie bemoeilijkt.
3. Gebruik een links paramediane incisie, omdat darm vaak vast aan de oorspronkelijke incisie. Vanaf het ondereinde van de buik, ongeveer 5 mm links van de bodem van de oorspronkelijke incisie, grijpen de huid met kleine getande pincet en in de huid met scherpe schaar knippen. Verleng deze cut superieurely de ribbenkast. (Figuur 7)
4. Met een schaar, in de spierlaag en na het invoeren van de peritoneale ruimte snijden, uit te breiden gesneden om de boven- en onderkant van de incisie. Er wordt lijm weefsel waardoor de blindedarm en de dunne darm te houden aan de juiste zijwand van de buik en mogelijk ook de oorspronkelijke incisie. (Figuur 8)
5. Met de schaar en vanaf de rand van de incisie, boven het niveau van de blindedarm, kan beginnen in de buikwand in een cirkel rond het gebied waar de darm is adherent.
6. Afwisselend boven en onder het niveau van de blindedarm, geleidelijk snijden helemaal rond de hechting en vul de cirkel, waardoor een "eiland" huid en buikwand aanhanger van de darm. (Figuur 9)
7. Opnieuw met een schaar, gesneden in de darm en scheiden de hechtende deel van de rest van de darm, waardoor een sandwich van weefsel dat bestaat uit huid en buikwandenerzijds darm aan de andere kant en lijm weefsel tussen de twee daartussen. (Figuur 10)
8. Eventueel met een puntig schaar om de huid te sterk te scheiden van de buikwand spier. Voor histologie overwegen waardoor de huid bevestigd, maar voor de spijsvertering en celisolatie de huid kan worden verwijderd. Als het weefsel zal worden gebruikt voor histologie, zorg ervoor dat zo veel hechtmateriaal mogelijk te verwijderen zonder overmatig verstoring van de lijm interface. Voor digestie en celisolatie is het acceptabel om de hechtingen te laten staan ​​zolang het weefsel digest wordt gefilterd.
9. Na het uitsnijden van de hechting weefsel, euthanaseren de muis met behulp van een humane wijze door uw institutioneel gebruik dier commissie goedgekeurd.

Resultaten

Zeven dagen na de operatie, de blindedarm en eventueel colon ascendens, lever en lussen van de dunne darm moet aanhanger van de rechterkant van de buik muur. (Figuur 8) uitgesneden weefsel worden ingebed en coupes en uitstekende histologische coupes verkregen. (Figuur 11, 12)

Als de procedure goed is uitgevoerd, moet 100% muizen aanzienlijke verklevingen ten zeven dagen. Sterk moet minde...

Discussie

De kritische stappen in deze procedure zijn: grondig schuren de blindedarm zonder dat perforatie, het plaatsen van hechtingen in de abdominale zijwand en toepassen van de juiste hoeveelheid zetmeel. Slechts schuurpapier toepassing op de blindedarm, of een klein specifiek gedeelte van de darm. Ruim gebruik van schuurpapier op grote hoeveelheden kleine darm vaak aanzienlijke ileus veroorzaken. Zorg ervoor dat de blindedarm met genoeg kracht dat het oppervlak wordt ruw schuren, maar niet zo veel dat de muur tranen. Het vin...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fisherbrand Absorbent Onderlagen, 20" x 24"	Fisher Scientific	14-206-62
Polylined steriele veld, 18" x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Snijd een rechthoekig gat van de juiste maat
Isothesia isofluraan	Henry Schein	050033
Fisherbrand steriele katoengaas, 4" x 4"	Fisher Scientific	22-415-469
Puralube petrolatum oftalmische zalf, 1/8 oz. tube	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Nair ontharingscreme	Church & Dwight Co.	22339-05
Buprenex buprenorfine  0,3 mg/ml	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-5
1 cc insulinespuit, 27 G	Becton Dickinson	329412
Povidon-jodium voorbereidingsoplossing	Medline	MDS093944H
Webcol alcohol prep swabs	Covidien	6818
Algemeen Labarotory Labelband	VWR	89097-912
BioGel PI chirurgische handschoenen	Mölnlycke Health Care	ALA42675Z
Micro Forceps met tanden	Roboz	RS-5150
Fijne schaar - scherp	Fine Science Tools	14060-09
Rechte getande pincet	Fine Science Tools	11050-10
Castro-Viejo naalddriver	Fine Science Tools	12565-14
100 grit 1/4 blad zandpapier	ACE Hardware	1010446	Snijd in stroken
4-0 zijde draad, 30", SH naald	Ethicon	K831
7-0 PDS II absorbeerbare monofilamentdraad, 30", BV-1 naald	Ethicon	Z135	Komt meestal dubbel gearmd. Snijd de draad halverwege om twee bruikbare draden te genereren.
Rijstzetmeel	MP Biomedicals	102955
0,9% natriumchloride irrigatie	Baxter	BHL2F7121	Voor gebruik opwarmen tot 37 °C
10 ml spuit	Becton Dickinson	309604
6-0 Vicryl absorbeerbare gevlochten draad, 18", RB-1 taps toelopende naald	Ethicon	J212H
6-0 Ethilon nylon monofilament  draad, 18", P-3 naald,	Ethicon	1698G
Tegaderm Transparant Filmverband Framestijl, 6 cm x 7 cm	3M	1624W	Halveren in de lengte