Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit Escherichia coli: Ontwerp, Productie en zuivering

Summary

Een protocol voor de productie, zuivering en het gebruik van enzymverpakte buitenmembraanvesikels (OMV) dat zorgt voor verbeterde enzymstabiliteit voor implementatie in diverse toepassingen wordt gepresenteerd.

Abstract

Toenemende belang bij synthetische biologie technieken om buitenmembraan vesicles (OMV) programmeren leiden tot een aantal zeer interessante en unieke toepassingen voor OMV waarin traditionele nanodeeltjes te moeilijk te synthetiseren blijken. Tot op heden zijn alle Gram-negatieve bacteriën is aangetoond dat OMV demonstreren verpakken van diverse lading die kleine moleculen, peptiden, eiwitten en genetisch materiaal omvat te produceren. Op basis van hun verschillende lading worden OMV betrokken bij vele biologische processen gaande van cel-cel communicatie genoverdracht en levering van virulentiefactoren afhankelijk van welke bacteriën produceren het OMV. Pas onlangs zijn bacteriële OMV geworden toegankelijk zijn voor gebruik in een breed scala van toepassingen door de ontwikkeling van technieken voor de controle en de directe verpakking van recombinante eiwitten in OMV. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de productie, zuivering en gebruik enzym verpakte OMV wijze verbeterd overall productie van recombinant enzym, verhoogde vesiculatie en verbeterde enzymstabiliteit. Succesvolle gebruik van dit protocol zal resulteren in de creatie van een bacteriestam die tegelijkertijd produceert een recombinant eiwit en stuurt het voor OMV inkapseling door het creëren van een synthetische binding tussen het recombinante eiwit en een buitenste membraananker eiwit. Dit protocol Gegevens ook werkwijzen voor het isoleren van OMV uit bacteriële culturen evenals juiste behandeling technieken en dingen te overwegen bij de aanpassing van deze protocol voor gebruik voor andere unieke toepassingen zoals: farmaceutische afgifte van geneesmiddelen, medische diagnostiek, en het herstel van het milieu.

Introduction

Hier gepresenteerd is een methode voor het ontwerp, de productie en zuivering van enzym geladen bacteriële buitenste membraan blaasjes (OMV). OMV zijn klein, vooral unilamellaire, proteoliposomen die variëren in grootte 30-200 nm ^1,2. Alle Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën die zijn tot nu toe onderzochte aangetoond loslaten van OMV of extracellulaire blaasjes (EV) vanaf hun oppervlak ^3,4. Het precieze mechanisme waardoor OMV geproduceerd nog niet volledig opgehelderd door de diverse bacteriële populaties die hen evenals de variërende functies die zij dienen afscheiden. OMV is aangetoond dat een breed scala van vracht van kleine moleculen, peptiden en proteïnen genetisch materiaal waar een verscheidenheid aan complexe signaal, gen translocatie en virulentie functies ^5,6.

De exacte mechanismen van OMV biogenese zijn niet goed gekarakteriseerd, en lijken te verschillen tussen bacteriesoorten. ondanks this feite hebben wij een werkwijze voor het verbeteren van de verpakkingsefficiëntie van een recombinant eiwit in OMV door een synthetische binding tussen een eiwit van interesse en een zeer overvloedige eiwit endogeen voor de bacteriële buitenmembraan en daaropvolgende OMV ontwikkeld. Aangezien een synthetische verbinding of kunstmatig opgenomen affiniteit tussen het recombinant tot expressie gebrachte eiwit en het OMV de waargenomen verpakkingsefficiëntie zeer laag ^7. Dit resultaat is als incorporatie van de eiwitten in de OMV hetzij gebeurt door toeval inkapseling precies op het moment van OMV formatie op het bacteriële oppervlak of via gerichte verpakkingen met mechanismen die niet goed begrepen worden verwacht. Enig succes is waargenomen bij het verpakken eiwitten eenvoudig door overexpressie in de periplasmatische ruimte die berust op toeval inkapseling maar effectieve verpakking is sterk afhankelijk eiwit met sommige eiwitten verpakking hoog rendement in vergelijking met andere ebij niet verpakken helemaal ^8-10. Door gebruik gemeenschappelijke synthetische biologische technieken zochten we Escherichia coli (E. coli) gelijktijdig produceren, verpakken en uitscheiden een actief enzym plaats in OMV dat beperkingen huidige kennis over hoe OMV gevormd en hoe lading wordt geselecteerd door de bacteriën omzeilt ingenieur verpakking.

Voor de toepassing van deze applicatie is een split-eiwit bioconjugatie systeem gekozen als de synthetische verbinding van de keuze om gerichte verpakkingen in het OMV vergemakkelijken. Zoals de naam suggereert een split eiwit bioconjugatie systeem bestaat uit twee complementaire domeinen subeenheid die interageren met elkaar. De splitsing eiwitdomeinen geselecteerd voor de toepassing van dit protocol worden aangeduid als de SpyCatcher (SC) en SpyTag (ST) domein en zijn afgeleid van de Streptococcus pyogenes-fibronectine bindend eiwit (FbaB) ^11. Deze splitsing proteïnesysteem is ongebruikelijk doordat wanneer de twee subeenheden in de nabijheid een isopeptidebinding spontaan vormt tussen het proximale asparaginezuur en lysine aminozuurresiduen waardoor een covalente binding. Vorming isopeptidebinding niet de toevoeging van chaperone eiwitten, katalytische enzymen of cofactoren, en kan gemakkelijk plaatsvinden bij kamertemperatuur (KT) en over een groot aantal fysiologisch relevante omstandigheden ^12.

Als een proof of concept, phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) van Brevundimonas diminuta werd geselecteerd om te worden verpakt in E. coli afkomstig OMV ^13. PTE bevat een binucleair Zn / Zn actieve plaats en heeft de mogelijkheid organofosfaten afbreken door een hydrolysereactie omzetten aryldialkylphosphates in dialkylphosphates en arylalcoholen ^14. Blootstelling aan organofosfaten schaadt juiste neurotransmitter functie door middel van het remmen van de hydrolyse van acetylcholine door acetylcholinesterase bij neuromusculaire verbindingen making organofosfaat afgeleide verbindingen uiterst gevaarlijk ^15. Langdurige of significante blootstelling aan organofosfaten vaak resulteert in oncontroleerbare stuiptrekkingen en meestal de dood veroorzaakt via stikken. Hoewel PTE vertoont de hoogste katalytische activiteit ten opzichte paraoxon, een zeer krachtige insecticide, maar ook kan hydrolyseren van een hele reeks andere pesticiden en V / G soort chemische zenuwgassen ^16. Om OMV verpakking te vergemakkelijken, werd een bacterieel plasmide geconstrueerd dat codeert voor een genconstruct dat een induceerbare promoter, een periplasmatische lokalisatiesequentie en een korte meervoudige kloneringsplaats stroomopwaarts van de SC gensequentie bevat. Insertie van het PTE-gen tussen de leider en SC-sequentie toegestaan ​​voor de oprichting van een genetische schakelaar die de PTE-SC fusie-eiwit richt naar de periplasmatische ruimte voor OMV verpakking. Hoewel de hier beschreven inspannen PTE, het enzym gen uitwisselbaar en kan gemakkelijk worden vervangen door een ander gensequentie FACilitate verpakking van een alternatieve enzym of eiwit.

Het tweede deel van de synthetische verbinding, is een overvloedig buitenmembraan eiwit (OmpA) gekozen om de ST peptidesequentie presenteren. Terwijl de keuze van anker-eiwit kan variëren, is het essentieel dat het eiwit een permissieve domein dat weer in de periplasmatische ruimte, tolereert de fusieconstruct zonder induceren cytotoxiciteit, bekend aanwezig OMV te zijn, en niet aggregeert als het recombinant geproduceerd. OmpA- is een 37,2 kDa transmembraan porine-eiwit dat bekend is in hoge mate tot expressie gebracht in de bacteriële buitenmembraan en daaropvolgende OMV ^17. Het is betrokken bij het transport van kleine moleculen, <2 nm in grootte, in het bacteriële membraan ^18. Inheemse OmpA- twee structureel unieke domeinen, een transmembraan motief beta vat en een periplasmically oplosbare C-terminale deel gekende bindingspartners met peptidoglycan ^19. In de mutant OmpA-ST fusie designed hier het C-terminale gedeelte van OmpA werd verwijderd en de ST werd gefuseerd met de periplasmically gerichte N- of C-termini. De periplasmatische gedeelte van OmpA verwijderen vermindert het aantal interacties tussen het buitenste membraan en peptidoglycan waardoor membraan destabilisatie leiden tot hyper-blaasjes ^7. Genomisch OmpA- werd gehandhaafd evenals de recombinant tot expressie gebrachte OmpA-ST construct grove membraan destabilisatie beperken.

Protocol

1. Bereiding van plasmiden

1. Bereid een plasmide (bijvoorbeeld pET22) met het anker eiwit (OmpA) gefuseerd aan een biorthogonale koppeling domein (in dit protocol aangeduid als anchor-ST), epitooplabel (zoals 6xHis, myc of FLAG-tags voor zuivering en identificatie), periplasmatische localisatie tag, antibioticaresistentie en geschikte replicatieoorsprong basis van de geselecteerde bacteriestam ^7.
   1. Extract plasmide-DNA uit overnachtkweken een los verkrijgbare DNA isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant.
2. Bereid een plasmide (bijvoorbeeld pACYC184) die het enzym / eiwit (PTE) te verpakken in de OMV gefuseerd met de complementaire bioorthogonal koppeling domein dat van het anker-eiwit (in dit protocol enzym-SC genoemd), epitooplabel, periplasmatische localisatie tag, antibiotische weerstand die verschilt van de ankereiwit plasmide en geschikte origin replicatie basis van de geselecteerde bacteriestam ^7.
   1. Extract plasmide-DNA uit overnachtkweken een los verkrijgbare DNA isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant ^7.

2. Genereren van een OMV Packaging E. coli Cultuur

1. Plasmid Isolation
   1. Zuiver plasmiden dat codeert voor het enzym-SC bouwen en anchor-ST construeert uit afzonderlijke onderhoud cellijnen met behulp van een commercieel plasmide isolatie kit volgens protocol van de fabrikant ^7. Bepaal DNA concentratie en zuiverheid meten van de absorptie bij 260 nm en 280 nm.
2. Cotransformatie
   1. Selecteer een E. coli stam die commercieel beschikbaar is voor eiwitexpressie te vergemakkelijken.
      NOTE: BL21 (DE3) cellen werden hier gebruikt. De T7 lysogeen is vereist voor expressie van het anker-ST construct, dat berust op de T7 promoter en T7 RNA polymerase voor protein expressie. Het gebruik van andere bacteriestammen vereist hetzij de aanwezigheid van de T7 lysogeen gen of het gebruik van een andere dan pET22 ⁷ plasmide.
   2. Verdun gezuiverd plasmide-DNA bij gelijkwaardige molaire concentraties dan transformeren ze in competente bacteriecellen via ofwel heat shock transformatie of elektroporatie volgens het protocol van de fabrikant voor de bevoegde cellen gekozen.
   3. Plaat getransformeerde cellen op antibioticum-bevattende Luria-Bertani (LB) agarplaten met zowel ampicilline (pET22) en chlooramfenicol (pACYC184); zowel in eindconcentraties van 25 ug / ml.
   4. Plaats de kweekschaal bij 37 ° C gedurende de nacht alleen klonen die beide plasmiden te isoleren.
      OPMERKING: Kolonies die antibiotische selectie overleven worden gebruikt voor alle toekomstige OMV preparaten. Antibiotica (ampicilline en chlooramfenicol) wordt toegevoegd aan alle vloeibare culturen selectieve druk te handhaven en om de aanwezigheid van beide plasmiden.

3. OMV Production

1. Colony Expansion
   1. Inoculeer 5 ml van de cultuur media (meestal Terrific Broth (TB) of LB) met antibiotica bij de hiervoor genoemde concentraties (stap 2.2.3) met een enkele kolonie uit de in 2.2.4 beschreven selectie platen.
   2. Voer een 1: 100-voudige verdunning van de nachtelijke starter cultuur in de war gebracht cultuur kolven.
      LET OP: Gebruik een volume van media tussen de 250-500 ml.
   3. Handhaaf de kweek bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm opdat voldoende beluchting van de kweek wordt verkregen.
2. Inductie van elk plasmide
   1. Laat de bacteriële kweek te groeien tot een _OD600 van 0,6-0,8, ongeveer 3 uur na inoculatie van de groei van de primaire groei kolf.
   2. Om de uiteindelijke opbrengst van PTE-SC geladen blaasjes te verbeteren, centrifuge de hele cultuur bij 7.000 g gedurende 15 min. Resuspendeer de cel pellet in voorverwarmde, verse kweekmedium.
      LET OP: Deze optional stap helpt om eventuele lege OMV, dat aanwezig is in het kweekmedium voorafgaand aan PTE-SC inductie zijn te verwijderen.
   3. Maak een 20% voorraad oplossing van L-arabinose in water en steriel filter met behulp van een 0,22 pm filter. WINKEL L-arabinose oplossing bij 4 ° C gedurende 2-4 weken.
   4. Voeg de L-arabinose oplossing voor de kweekfles tot een uiteindelijke concentratie 0,2% tot inleiding PTE-SC productie.
      LET OP: Dit helpt om de periplasmatische ruimte met PTE-SC preload voorafgaand aan de bevordering van meer blaasjes door middel van inductie van de mutant OmpA-ST.
   5. Voeg een oplossing van 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in water en steriel filter met een 0,22 urn filter.
      LET OP: IPTG moet onmiddellijk één keer gebruikt worden gehydrateerd. Hoeveelheden van IPTG kan ingevroren worden opgeslagen voor 3-6 maanden en kan onmiddellijk worden ontdooid voorafgaand aan gebruik.
   6. Voeg IPTG na nog eens 3 uur incubatieperiode tot een eindconcentratie van 0,5 mM tot productie van het OmpA-ST initiëren.
   7. Laat de cultuur groeien gedurende nog 8-14 uur bij 37 ° C onder schudden.

4. OMV Zuivering

1. Verwijdering van Intact Bacteriën
   1. Centrifugeer de bacteriële kweekmedia gedurende 15 minuten bij 7000 xg bij 4 ° C intacte bacteriën pelleteren.
   2. Decanteer en opslaan, de media van de bovenkant van de celpellet na centrifugatie daarbij goed op de celpellet niet storen.
   3. Herhaal stap 4.1.1 en 4.1.2 voor een extra centrifugeren cyclus te zorgen dat alle intact bacteriën uit het kweekmedium en zorg ervoor dat decanteren en opslaan van de media verwijderd.
2. Verwijdering van Proteïneaggregaten
   1. Verder te zuiveren de bacteriële kweekmedia onder toepassing van een 0,45 urn membraanfilter om resterende bacteriën en ongewenst grote celmateriaal te verwijderen.
      OPMERKING: Gebruik een biologisch compatibel membraanmateriaal hogere terugwinning en lagere eiwitadsorptie zoals celluloseacetaat (CA) en polyvinylideendifluoride (PVDF). Spuitfilter volumes minder dan 100 ml en vacuüm filter volumes groter dan 100 ml.
      1. Om spuitfilter, trekken kweekmedium in steriele 10-50 ml spuit. Bevestig 0,45 pm filter om Luer einde van de spuit. Druk de zuiger en het verzamelen van doorstroming in een nieuw schip.
      2. Om filter stofzuigen, transfer kweekmedium een ​​steriele filtratie apparaat. Bevestig de unit om de pomp te stofzuigen of de gootsteen aspirator om zuigkracht te genereren. Transfer gefilterd medium om nieuwe vaartuig.
3. Isolatie van OMV via Ultracentrifugatie
   1. Voeg de gefilterde cultuur media in centrifugeren buisjes voorzichtig om tegengestelde buizen in evenwicht te brengen in de centrifuge.
   2. Pellet op ~ 150.000 xg gedurende 3 uur bij 4 ° C in een ultracentrifuge met de bijbehorende rotor overeenkomende zowel het instrument en pijpen worden gebruikt.
   3. Schenk de OMV uitgeputte cultuur media uit de OMV pellet, zorg dat u de OMV pellet niet te verstoren, meteen bij de voltooiing of centrifugering zoals OMV waardoor de pellet in de media blijven de pellet verminderen OMV herstel verweken.
      LET OP: Deze pellet zal iets bruin en afhankelijk van het basisbedrag van de bacteriecultuur kan wel of niet zichtbaar zijn met het blote oog. Aanzuigen van de direct vanaf de bovenkant van de centrifugebuis is ook een optie in het achterhoofd dat de meer media uit de OMV pellet hoe zuiverder de uiteindelijke OMV monster zijn.
   4. Sla de supernatant gecentrifugeerd voor later dynamische lichtverstrooiing (DLS) testen om te controleren of de OMV deeltjes waren volledig uitgeput van de media.
   5. Voeg 0,5-1 ml steriel gefiltreerd fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 of 100 mM N-cyclohexyl-2-aminoethaansulfonzuur (CHES) buffer bij pH 8,0 om de OMV pellet waardoor het incuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de pellet niet uitdroogt.
      OPMERKING: Extreme oplossing ionsterkte, pH en temperatuur kan tot verminderde OMV oplosbaarheid en bevorderen aggreking.
   6. pipet voorzichtig de gezuiverde OMV oplossing uit de centrifugebuis, mengen langzaam aan de gehele pellet werd opgelost waarborgen.

5. OMV karakterisering

1. Gebruik een in de handel verkrijgbare DLS of nanodeeltjes tracking software volgende protocollen de verstrekte fabrikant uniek voor elk instrument te bepalen OMV grootteverdeling en deeltjesconcentratie.
   LET OP: Hier, OMV grootteverdeling en concentratie werd bepaald met behulp van NanoSight LM10 nanodeeltjes Tracking en NTA 2.3 Analysis-software.
   1. Open de software.
   2. Schakel de microscoop en reinig alle oppervlakken op de microscoop en nanodeeltjes tracking unit.
   3. Voeg ~ 0,5 ml van OMV monster rechtstreeks aan het kijkvenster van het deeltje tracking device via de Luer fitting met een 1 ml steriele spuit en zorg ervoor dat het hele kijkvenster dekken zonder het injecteren van enige luchtbellen in het systeem.
   4. plaats tHij nanodeeltjes volgen eenheid op de microscoop podium en zet de laser.
   5. Klik op "Capture" in de software.
   6. Pas de microscoop focus en het podium om de deeltjes te visualiseren op het preview-scherm aanwezig is in de software-venster.
   7. Pas de "Camera Shutter" en "Camera Gain" tot lichte deeltjes duidelijk worden gevisualiseerd op een donkere achtergrond.
   8. Pas duur capture tot 60 sec.
   9. Klik op "Record".
   10. Wanneer u wordt gevraagd, het invoeren van de temperatuur van het monster / het apparaat, het etiket van de steekproef, en de video-gegevens op te slaan bij de voltooiing van de elke lopen in een gebruiker aangewezen map.
   11. Houd alle analyse parameters (Detection Threshold, Blur, Min Track lengte, Min Verwacht Particle Size) op automatisch detecteren mode en klik op "Proces Sequence."
       OPMERKING: Raadpleeg de handleiding van hoe elke parameter afzonderlijk te fine-tunen analyseresultaten kan worden aangepast.
   12. Neem deeltjesgrootteverdeling en deeltjes / ml concentratie zoals bepaald door de software.
       LET OP: Een typische OMV hydrodynamische grootte ligt tussen 30-200 nm met een deeltjes / ml concentratie van ~ 10 x 10 ^8.
2. Het bepalen van OMV eiwitgehalte
   1. Gebruik standaard SDS-PAGE en Western blot protocollen OMV zuiverheid, de productie van enzymen, en de SC-ST verknoping efficiency ⁷ te beoordelen.
      LET OP: Het verknopen efficiëntie zal niet 100% ^7.

6. Keuring van Enzyme Packaging

1. PTE Activity Assay
   1. Voer alle enzymatische assays in een geschikte buffer zoals 100 mM CHES-buffer (pH 8) bij 25 ° C in hetzij een cuvette of gemultiplext in een 96/384 putjes.
   2. Voeg 5 ul van een 1: 1000 verdunning van paraoxon in CHES buffer 90 pl CHES en 5 pl van gezuiverde OMV (~ 36-voudig geconcentreerd in vergelijking met de concentratie OMV aanwezig in het kweekmedium).
      Let op: Paraoxon is een giftig bestrijdingsmiddelen moet per fabrikant en institutionele richtlijnen worden behandeld.
   3. Neem absorptieaflezingen met regelmatige tussenpozen (elke 20 seconden voor ~ 2 uur totale reactietijd) en 405 nm (ε = 18,1 mM ^-1 cm ^-1) en 348 nm (isosbestic punt ε = 5,4 mM ^-1 cm ^-1) aan toezien op de reactie verloop van de chromogene paraoxon afbraakproduct, p-nitrofenol.
      LET OP: Bij pH-waarden boven 8 de dominante gedeprotoneerde vorm van p-nitrofenol is aanwezig waardoor voor nauwkeurige monitoring bij 405 nm. In alle andere complexe of lagere pH oplossingen moet de isosbestic punt van 348 nm te gebruiken als meerdere vormen van de p-nitrofenol aanwezig zijn.
   4. Bereken initiële reactiesnelheden door bepaling van de helling van het lineaire gedeelte van de progressiekrommen uit stap 6.1.3 om de relatieve hoeveelheid PTE vergelijken elk monster, verpakkingsefficiëntie en PTE totale productie.
   5. Voer standaard enzymatischeassay protocollen om te bepalen K _M, V _max en k _kat voor de OMV ingekapselde PTE.
      OPMERKING: Lineweaver-Burk analyse kan worden gebruikt voor het bepalen van deze kinetische parameters waarbij de y-as = 1 / _Vmax met helling = _KM / _Vmax ^20.
2. Transmembraan Substrate / Product Diffusion.
   1. Voer dezelfde kinetische assay als beschreven in stap 6.1 met gebruikmaking van toenemende concentraties van Triton X-100 in buffer CHES 0-3% vol.
      OPMERKING: De toevoeging van Triton X-100 aan het opgeloste OMV functioneert om de lipide bilaag waardoor de inhoud van de OMV vrij toegankelijk zijn voor de reactieoplossing te verstoren.
   2. Bereken en vergelijk de initiële snelheid bij elke Triton X-100 niveau transmembraan passage van het substraat / product aangeduid met minimale veranderingen van de enzymactiviteit (aanvangssnelheden) verifiëren vergelijking enzymactiviteit ianneer Triton X-100. Als een aanzienlijke toename van enzymactiviteit waargenomen in aanwezigheid van Triton X-100 is het waarschijnlijk dat het substraat niet vrij diffunderen in de OMV.
   3. Assay vrije enzymactiviteit (zoals hierboven beschreven in paragraaf 6.1) in aanwezigheid van Triton X-100 die enzymactiviteit verifiëren wordt niet geremd door de oppervlakteactieve stof zelf.
      OPMERKING: Indien de activiteit sterk wordt beïnvloed door Triton X-100, andere toevoegsels, zoals saponinen of diverse polysorbaat / kunnen tween oppervlakteactieve geschikter zijn om de OMV membraan scheuren.

7. OMV Storage

1. Invriezen
   1. Plaats ~ 100 ul fracties van gezuiverde OMV direct in vloeibare stikstof te breken bevriezing van de monsters die zeker niet volledig onderdompelen de flesjes of contact opnemen met een vloeibare stikstof met het monster zelf.
      OPMERKING: Gezuiverde OMV kunnen direct snel ingevroren in de buffer die werd geselecteerd voor oplossen van de pellet in de OMV zuiverinion proces zonder aanvullende cryoprotectants ⁷ nodig.
   2. Bewaar de snap ingevroren monsters bij -80 ° C.
   3. Ontdooi ingevroren aliquots van stap 7.1.1 door ze bij kamertemperatuur wordt dat de monsters niet te verwarmen.
   4. Alvorens met alle monsters voor opslag op deze wijze uit te voeren het enzym assay stap 6,1 onze initiële snelheden voor en na het invriezen te verifiëren dat er geen significant verlies van enzymactiviteit na invriezen-ontdooien beschreven.
      OPMERKING: WINKEL gezuiverde OMV bij 4 ° C indien een verlaging van de enzymactiviteit waargenomen door vorst.
2. vriesdrogen
   1. Lyofiliseren de snap bevroren gezuiverde OMV fracties gebruik te maken van commercieel verkrijgbare vriesdrogen apparatuur ^21.
   2. Opslag gelyofiliseerd fracties bij kamertemperatuur weken bij -80 ° C gedurende enkele maanden.
   3. Voeg dezelfde hoeveelheid gezuiverd water om het gevriesdroogde OMV als vóór lyofilisatie en laat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten tot t rehydraterenhij proeven. Meng voorzichtig wanneer dat nodig is dat zeker niet te vortex of ultrasone trillingen de OMV.
   4. Voeg gevriesdroogd OMV poeder direct naar point-of-care voor toepassingen waarbij voorafgaande verdunning / oplosbaar maken is niet nodig.

Results

Gelijktijdige expressie van twee recombinante eiwitten, zoals is vereist voor de OMV verpakkingsstrategie die in dit protocol, kan worden bereikt door een aantal verschillende wegen. Hier werd een twee vectorsysteem gebruikt met compatibele oorsprongen van replicatie en een aparte induceerbare gencassettes. Voor de expressie van de PTE-SC construct commerciële plasmideskelet (pACY184) werd ontworpen om een ​​arabinose induceerbare gencassette en een twin arginine periplasmatische localis...

Discussion

Dit protocolfuncties een representatieve tonen gerichte verpakkingstechniek waarbij een enzym van interesse wordt geproduceerd en in OMV verpakt door E. coli. Zoals met vele complexe technieken er meerdere gebieden waarop het protocol kan worden aangepast om geschikt voor gebruik in verschillende unieke toepassingen, waarvan sommige hieronder. Hoewel het mechanisme van OMV verpakking en enzym inkapseling kan worden aangepast aan de specifieke behoeften er verschillende stappen in dit protocol dat cruciaal voor ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IPTG	Elk		Maak altijd vers klaar of verdeel in aliquoten en vries in.
L-arabinose	Elk		Kan van tevoren worden bereid en bewaard bij 4 °C.
Ampicilline	Elk		Voeg direct toe voor gebruik nadat het medium voldoende is afgekoeld na het autoclaven.
Chloramfenicol	Elk		Voeg direct toe voor gebruik nadat het medium voldoende is afgekoeld na het autoclaven.
TB/LB-kweekmedia	Elk		Andere groeimedia werken waarschijnlijk op vergelijkbare wijze.
Triton X-100	Elk		Een van de vele potentieel geschikte oppervlakteactieve stoffen.
Baffled kweekkolven	Elk		De baffles bevorderen een hoger niveau van beluchting.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimale buffer gebruikt voor paraoxon degradtie (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Zeer giftige stof die voorzichtig moet worden behandeld en op de juiste manier moet worden gedisposeerd.
Spuitfilter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221 (30 mm)	De filterdiameter hangt af van het volume van het monster. Laag eiwitbindende membraan is cruciaal.
Schudincubator	New Brunswick	Excella E24	Precieze temperatuur en menging zijn essentieel voor reproduceerbare bacteriegroei.
Sorvall kweekcentrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Grote volume (500 ml) kweekcentrifuge met een capaciteit van 7.000 x g.
Sorvall ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capabel voor centrifugale krachten ≥150.000 x g.
Ultracentrifuge rotor	Thermo Scientific	AH-629	Zorg ervoor dat de juiste rotor en buizen worden gebruikt en dat alles goed is uitgebalanceerd.
Ultra-Clear ultracentrifugebuizen (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Zorg ervoor dat er geen spanningsfracturen aanwezig zijn voor gebruik en dat de buizen precies uitgebalanceerd zijn.
Spectrofotometer	Tecan	Infinite M1000	Noodzakelijk voor enzymkinetische assays.
DLS/deeltjestracking	NanoSight	LM10	Noodzakelijk voor OMV grootteverdeling en concentratiebepaling.
BL21(DE3)	NEB		Geschikt bacterieel expressiestrain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Andere plasmiden kunnen in plaats hiervan worden gebruikt.
pACYC184	NEB		Andere plasmiden kunnen in plaats hiervan worden gebruikt.
Gel extractiekit	Qiagen	28704	Voorbeeldkit.