Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

Samenvatting

Deze studie beschrijft biofysische, biochemische en moleculaire technieken om de chaperone activiteit van Escherichia coli HdeB karakteriseren onder zure pH-omstandigheden. Deze werkwijzen zijn met succes toegepast voor andere zuur-beschermende chaperones zoals HdeA en kan worden aangepast om te werken voor andere chaperones en stresscondities.

Samenvatting

De bacteriën worden vaak blootgesteld aan veranderingen in de omgeving, zoals veranderingen in pH, temperatuur, redox status belichting of mechanische kracht. Veel van deze aandoeningen veroorzaken eiwitontvouwende in de cel en hebben nadelige invloed op de overleving van het organisme. Een groep van onafhankelijke, stress-specifieke moleculaire chaperones is aangetoond dat essentiële rol spelen bij de overleving van deze stresscondities. Terwijl volledig gevouwen en chaperonne-inactief voor stress, deze eiwitten snel ontvouwen en worden chaperone-actief onder specifieke stress-condities. Eenmaal geactiveerd, deze conditioneel wanordelijke chaperones binden aan een groot aantal verschillende aggregerende eiwitten voorkomen dat hun aggregatie en proteïne hervouwing bij terugkeer naar niet-stressomstandigheden direct of indirect vergemakkelijken. De primaire benadering voor het verkrijgen van een meer gedetailleerd begrip van het mechanisme van de activatie en client erkenning omvat de zuivering en subsequent karakterisering van deze eiwitten toepassing van in vitro assays chaperon. Follow-up in vivo stress-tests zijn absoluut essentieel om zelfstandig te bevestigen de in vitro resultaten.

Dit protocol beschrijft in vitro en in vivo methoden om de chaperone activiteit van E. karakteriseren coli HdeB een zuur geactiveerde chaperonne. Lichtverstrooiingsmetingen werden gebruikt als geschikte uitlezing capaciteit HdeB om zuur-geïnduceerde aggregatie van een gevestigd model client eiwit, MDH voorkomen in vitro. Analytische ultracentrifugatie-experimenten werden toegepast op complexvorming tussen HdeB en haar opdrachtgever eiwit LDH onthullen, om licht te werpen op het lot van de cliënt eiwitten op hun terugkeer naar non-stress-condities. Enzymatische activiteit assays van de cliënt eiwitten werden uitgevoerd om de effecten van HdeB op pH geïnduceerde client inactivatie en reactivering controleren. Ten slotte werden de overleving studies gebruikt om Monitor de invloed van HdeB's chaperone functie in vivo.

Inleiding

Een gemeenschappelijke natuurlijke omgeving waarin microbiële ziekteverwekkers ervaren zuur-geïnduceerde eiwit ontvouwen omstandigheden is het zoogdier maag (pH 1-4), waarvan de zure pH fungeert als een effectieve barrière tegen voedsel overgedragen pathogenen ^1. Eiwitontvouwende en aggregatie, die wordt veroorzaakt door aminozuurzijketen protonering, beïnvloedt biologische processen, schade celstructuren en uiteindelijk leidt tot celdood ^1,2. Aangezien de pH van het bacteriële periplasma in evenwicht vrijwel onmiddellijk de pH van het milieu door de vrije diffusie van protonen door de poreuze buitenste membraan periplasmische en binnenste membraan eiwitten van Gram-negatieve bacteriën zijn de meest kwetsbare cellulaire componenten onder zure-stressomstandigheden ^3. Om hun periplasmische proteoom tegen snelle-zuur bemiddelde schade te beschermen, Gram-negatieve bacteriën maken gebruik van de zuur geactiveerde periplasmatische chaperones HdeA en HdeB. HdeA is een voorwaardelijk ontregeld chaperonne ^{4,5: Bij neutrale pH, HdeA aanwezig als een gevouwen, chaperone-actief dimeer. Bij een pH-verschuiving onder pH 3, wordt HdeA's chaperone functie snel geactiveerd 6,7. Activering van HdeA vereist ingrijpende structurele veranderingen, inclusief de dissociatie in monomeren en de gedeeltelijke ontvouwing van de monomeren 6-8. Eenmaal geactiveerd HdeA bindt aan eiwitten die zich ontvouwen onder zure omstandigheden. Het voorkomt effectief hun aggregatie, zowel tijdens de incubatie bij lage pH alsmede op pH neutralisatie. Bij terugkeer naar pH 7,0, HdeA vergemakkelijkt het opnieuw vouwen van zijn cliënt eiwitten in een ATP-onafhankelijke wijze en zet terug in zijn dimeer, chaperonne-inactieve conformatie 9. Ook de homologe chaperon HdeB ook chaperone-inactief bij pH 7,0. In tegenstelling tot HdeA echter HdeB's chaperone activiteit bereikt haar ogenschijnlijke maximum bij pH 4,0, onder welke voorwaarden HdeB is nog grotendeels gevouwen en dimeer 10. Bovendien verdere verlaging van de pH causes de inactivatie van HdeB. Deze resultaten suggereren dat ondanks hun uitgebreide homologie, HdeA en HdeB verschillen in hun wijze van functionele activatie waarbij zij een breed pH-traject met hun beschermende chaperone functie dekken. Een andere chaperone die is betrokken bij de zuurbestendigheid van E. coli is de cytoplasmatische Hsp31, die lijkt te ongevouwen client eiwitten te stabiliseren tot neutrale omstandigheden worden hersteld. De precieze werkingsmechanisme Hsp31's, echter, is raadselachtig 12 gebleven. Aangezien andere enteropathogene bacteriën zoals Salmonella niet de hdeAB operon, is het zeer waarschijnlijk dat andere ongeïdentificeerde periplasmatische chaperons kunnen bestaan die betrokken zijn bij zuurbestendigheid van deze bacteriën 11 zijn.}

De protocollen die hier laat de pH-afhankelijke chaperone activiteit van HdeB controleren in vitro en in vivo ¹⁰ en kunnen worden toegepast op andere chaperons onderzoekenzoals Hsp31. Als alternatief, het complex netwerk van transcriptiefactoren die de expressie van hdeAB controle kan mogelijk worden onderzocht door de spanning in vivo assay. Om de chaperone functie van eiwitten in vivo te karakteriseren, kan verschillende experimentele opstellingen worden toegepast. Een route naar eiwitontvouwende stressomstandigheden toepassing en fenotypische karakterisatie van mutante stammen die hetzij overexpressie het gen van belang of een bij deletie van het gen. Proteomics studies kunnen worden uitgevoerd om eiwitten te identificeren die niet langer aggregaat stressomstandigheden als de chaperonne aanwezig is, of de invloed van een chaperonne op een specifiek enzym kan tijdens stressomstandigheden middels enzymatische assays ^14-16 bepaald. In deze studie hebben we ervoor gekozen om HdeB overexpressie in een rpoH deletie stam, die de warmte shock sigma factor 32. rpoH de expressie van alle belangrijke E. controleert ontbeert coli chaperones en de deletie bekend sens vergrotenItivity ecologische stress omstandigheden die eiwitontvouwende ¹⁵ veroorzaken. De in vivo activiteit van chaperone HdeB werd bepaald door het volgen zijn vermogen om de pH gevoeligheid van de Δ rpoH stam onderdrukken. In totaal protocollen die hier zorgen voor een snelle en eenvoudige benadering om de activiteit van een zuur geactiveerde chaperone karakteriseren in vitro als in in vivo context.

Protocol

1. Expressie en zuivering van Periplasmatische HdeB

OPMERKING: HdeB werd tot expressie gebracht in E. coli-cellen die het plasmide pTrc- HdeB ¹⁰ en gezuiverd uit het periplasma van polymyxine lysis.

1. Bereid een overnachting cultuur van E. coli-cellen die het plasmide pTrc- HdeB ¹⁰ in 30 ml LB met 200 ug / ml ampicilline (LB _Amp). Inoculeer vier cultures 1 L LB _Amp en ze groeien bij 37 ° C en 200 rpm, tot OD _{600 nm} van 0,7 wordt bereikt. Voeg vervolgens 300 pM IPTG om de expressie van HdeB induceren en de kweektemperatuur tot 30 ° C te verlagen.
2. Na 5 h eiwitexpressie bij 30 ° C, verzamel de cellen door centrifugeren bij 8000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
3. Was de celpellet met 100 ml de cellen opnieuw buffer A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) en gecentrifugeerd bij 8000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
4. Vervolgens resuspendeerde celpellet in 80 ml buffer A, bevattende 1 mg / ml polymyxine sulfaat. Voor een efficiënte verstoring van het buitenmembraan, Roer de suspensie gedurende 1 uur bij 4 ° C.
5. De cytoplasmatische fractie en celresten te verwijderen, centrifuge de suspensie gedurende 20 min bij 15.000 xg bij 4 ° C. Dit leidt tot ~ 60 ml supernatant die de oplosbare HdeB.
6. Dialyseer het supernatant overnacht met de periplasmatische extract tegen 150x volume buffer B (20 mM Tris / HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) onder toepassing van een dialysemembraan met 6 kDa MW cut-off. Concentreer de eiwitten 15 ml middels centrifugale filtereenheden met een molecuulgewicht cut-off van 3 kDa. Filtreer de eiwitoplossing met een 0,2 um porie filter.
7. Breng het eiwit op een anion uitwisseling chromatografie kolom (kolomvolume 5 ml) die is geëquilibreerd met 5 kolomvolumes buffer B met een stroomsnelheid van 2,5 ml / min. Zodra het eiwit op de kolom geladen, wassen van de kolom met buffer B gedurende 10 min bijeen stroomsnelheid van 2,5 ml / min. Elueer HdeB met een lineaire gradiënt 0-0,5 M NaCl in buffer B gedurende een periode van 50 min met een stroomsnelheid van 2,5 ml / min ^6.
8. Identificeer fracties die HdeB met een 15% SDS-PAGE. Meng 20 pl monster met 5 pi 5x gereduceerd SDS laadbuffer. Belasting 10 pl op de gel en uitgevoerd in Tris-glycinebuffer (14,4 g / l glycine, 2,9 g / l Tris, 1 g / l natriumdodecylsulfaat, pH 8,3). Voer de elektroforese bij 150 V totdat de broomfenolblauw band dicht is gemigreerd naar de onderkant van de gel (~ 45 minuten).
9. Pool alle HdeB-bevattende fracties, dialyseren bij 4 ° C overnacht tegen 4 L HdeB opslagbuffer (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0) en concentreer het eiwit tot ongeveer 300 uM middels centrifugale filtereenheden met een molecuulgewicht cut-off van 3 kDa. Bepaal de concentratie van HdeB bij 280 nm met behulp van de extinctiecoëfficiënt ε _{280 nm} = 15.595 M ^-1 cm ^-1. Bereid 100 ul aliquots en flash-vrijZé de monsters in vloeibare stikstof.
   OPMERKING: HdeB kan ten minste 6 maanden worden bewaard bij -70 ° C.

2. Chaperone Activity Assay Met behulp Thermisch Unfolding malaatdehydrogenase (MDH)

OPMERKING: De invloed gezuiverd HdeB op de aggregatie van thermisch ontvouwen varkens mitochondriaal malaatdehydrogenase (MDH) bij verschillende pH-waarden werd gevolgd zoals hierna beschreven. Alle vermelde eiwitconcentraties verwijzen naar de monomeerconcentratie.

1. Om MDH bereiden dialyseren MDH bij 4 ° C overnacht tegen 4 liter buffer C (50 mM kaliumfosfaat, 50 mM NaCl, pH 7,5) en concentreer het eiwit ongeveer 100 uM middels centrifugale filtereenheden met een molecuulgewicht cut-off van 30 kDa.
   OPMERKING: Zorgvuldige dialyse van MDH is vereist als MDH wordt geleverd ammoniumsulfaatoplossing.
2. Om aggregaten te verwijderen, centrifugeer het eiwit gedurende 20 min bij 20.000 xg bij 4 ° C. Bepaal MDH concentratie door absorptie bij 280 nm (ε _{280 nm = 7950 ^{M-1 cm-1).} Bereid 50 pi fracties van MDH en flash-bevriezing van de monsters voor opslag.}
3. Plaats 1 ml kwartscuvette in een fluorescentie spectrofotometer uitgerust met temperatuurgestuurde monster houders en roerder. Stel λ _{ex / em} tot 350 nm.
4. Voeg juiste volumes voorverwarmde (43 ° C) buffer D (150 mM kaliumfosfaat, 150 mM NaCl) en het gewenste pH-waarden (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 en pH 5,0) aan de cuvet en set de temperatuur van de cuvettehouder tot 43 ° C. Het totale volume 1.000 III.
5. Voeg 12,5 pM HdeB (of als alternatief hetzelfde volume HdeB opslagbuffer voor de buffer) om de buffer, gevolgd door toevoeging van 0,5 uM MDH. Begin bewaken lichtverstrooiing. Incubeer het reactiemengsel gedurende 360 ​​seconden voldoende om ontvouwen van MDH.
6. Breng de pH op 7 door toevoeging van 0,16-0,34 volume van 2 M gebufferd K ₂ HPO ₄ en blijven regens lichtverstrooiing voor nog eens 440 sec.
7. Stel de mate van aggregatie MDH welke is genoteerd in afwezigheid van de chaperonne op een bepaalde tijdstip na neutralisatie (hier na 500 sec, bij maximale lichtverstrooiing van MDH waargenomen) tot 100%. Normaliseren activiteit HdeB om de lichtverstrooiing signaal MDH in afwezigheid van HdeB op elk aangegeven pH.

3. Detectie van HdeB-LDH Complex Vorming door Analytical Ultracentrifugatie (AUC)

OPMERKING: sedimentatiesnelheid experimenten HdeB alleen of in complex met thermisch ontvouwen lactaat dehydrogenase (LDH) werden uitgevoerd met een analytische ultracentrifuge.

1. LDH bereiden dialyseren LDH bij 4 ° C overnacht tegen 4 liter buffer C (50 mM kaliumfosfaat, 50 mM NaCl, pH 7,5) en concentreer het eiwit tot ongeveer 200 uM middels centrifugale filtereenheden met een molecuulgewicht cut-off van 30 kDa.
   OPMERKING: Zorgvuldige dialyse van LDH vereist LDH wordt geleverd als ammoniumsulfaatoplossing.
2. Aggregaten, centrifuge LDH verwijderen gedurende 20 min bij 20.000 xg bij 4 ° C. Bepaal LDH concentratie door absorptie bij 280 nm (ε _{280 nm} = 43.680 ^{M-1 cm-1).} Bereid 50 pi fracties van LDH en flash-bevriezing van de monsters voor opslag.
3. Incubeer 3 uM LDH in de aanwezigheid en afwezigheid van 30 uM HdeB in buffer D (pH 4 en 7, respectievelijk) gedurende 15 minuten bij 41 ° C.
   OPMERKING: Incubatie van LDH bij hogere temperaturen resulteert in de volledige aggregatie en geen chaperonne effect HdeB kan worden waargenomen.
4. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur. Vervolgens load monsters in cellen met standaard sector gevormde 2-kanaals centerpieces met een lengte van 1,2 cm pad. Laad de cellen in de ultracentrifuge en equilibreren tot 22 ° C gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan sedimentatie.
5. Spin monsters bij 22 ° C en 167.000 x g in de respectieve rotor gedurende 12 uur, en controleren sedimentation van het eiwit continu bij 280 nm. Zoals eerder aangetoond, wordt de signaal-ruisverhouding verbeterd wanneer de doorgestraalde lichtintensiteit van elk kanaal wordt gemeten in plaats van absorptie. Dit verbetert ook de kwaliteit van de volgende gegevensveld fitting.
6. Voeren data-analyse met SEDFIT (versie 15.01b, december 2015), met behulp van de continue c (s) distributiemodel ^17. Een tutorial die beschrijven hoe SEDFIT gebruik kan worden gevonden in referentie ^18.
   1. Stel het betrouwbaarheidsniveau van de ME (Maximum Entropy) regularisatie tot 0,7.
7. Bereken buffer dichtheid en viscositeit met behulp SEDNTERP ^19. Om de hoeveelheid geaggregeerd eiwit te schatten client vergelijken integralen gesedimenteerde LDH in pH 4 tot pH 7 als referentie.
   LET OP: Integratie van de sedimentatie distributie plots kunnen direct worden gedaan in SEDFIT. Alternatieve software om sedimentatie snelheid data te analyseren kan worden gevonden in een recente beoordeling ^20.

4. Monitoring MDH inactivatie en Reactivering in de tegenwoordigheid van HdeB

OPMERKING: De invloed gezuiverd HdeB op de hervouwing van pH-ongevouwen MDH werd bepaald door het volgen MDH activiteit voor neutralisatie.

1. Incubeer 1 uM MDH in buffer D op de gewenste pH-waarden (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 en pH 5,0) gedurende 1 uur bij 37 ° C in afwezigheid of aanwezigheid van 25 uM HdeB. Vervolgens verschuift de temperatuur tot 20 ° C gedurende 10 minuten.
   OPMERKING: Geen MDH opnieuw vouwen werd zelfs in aanwezigheid van HdeB waargenomen wanneer MDH werd geïncubeerd bij temperaturen boven 37 ° C.
2. Om hervouwing zuur gedenatureerd MDH inleiding monsters neutraliseren tot pH 7 door toevoeging van 0,13-0,42 volume 0,5 M natriumfosfaat, pH 8,0.
3. Na incubatie gedurende 2 uur bij 20 ° C, bepaalt MDH activiteit door het volgen van de afname van NADH bij 340 nm ^9.
   LET OP: MDH katalyseert de NADH-afhankelijke reductie van oxaalacetaat in de L-malaat.
   1. Meng 50 pl van de incubatie reactie met 950 pl testbuffer (50 mM natriumfosfaat, pH 8,0, 1 mM oxaalacetaat en 150 uM NADH).
      OPMERKING: De eindconcentratie van MDH in de testbuffer moet 44 nM.
   2. Registreren de absorptie met een spectrofotometer, uitgerust met een Peltier blok voor de temperatuurregeling ingesteld op 20 ° C.
   3. Rapporteren de MDH activiteit ten opzichte van 44 nM inheemse MDH die bij een pH van 7,0 heeft gehouden.

5. Effect van HdeB overexpressie op E. coli Survival onder Acid Stress

LET OP: E. coli MG1655 genomisch DNA werd geïsoleerd met behulp van een gepubliceerd protocol ^21.

1. Amplify HdeB van E. coli MG1655 door PCR met behulp van primers HdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT en HdeB - EcoRI-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C.
2. Stel de PCR reactie in 50 gl als volgt: 10 pl 5x polymerase buffer, 200 uM dNTPs, 0,5 uM primer JUD2, 0,5 pM primer JUD5, 150 ng genomisch DNA MG1655, 0,5 pl DNA polymerase, voeg DDH ₂ O tot 50 pl.
3. Voer amplificatie van HdeB als volgt: Stap 1: 5 min bij 95 ° C, 1 cyclus; stap 2: 30 s bij 95 ° C, 30 sec bij 55 ° C, 30 sec bij 72 ° C, 40 cycli; Stap 3: 10 min bij 72 ° C.
4. Kloon resulterende PCR fragment in de EcoRI en BamHI plaatsen van plasmide pBAD18 toepassing van standaardmethoden voor restrictieplaats klonen. Zuiver het plasmide met een plasmide zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Controleer het verkregen plasmide door sequentiebepaling ^10.
5. Transformeer de plasmide dat HdeB of de lege vector controle pBAD18 in stam BB7224 (Δ rpoH) (genotype: F ^-, λ ^-, E14 ^- [araD139] _{B / r} [6; (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm ^R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: Tn 10 (Tc ^S) suhX401 deoC1 Arad ⁺ rpoH :: Kan ^{+; 16)} met behulp van chemisch competente cellen.
   LET OP: Deze soort is temperatuurgevoelig.
6. Na 45 sec warmteschok bij 42 ° C en voorafgaand aan het plateren, incubeer cellen bij 30 ° C en 200 rpm. Voer enkele kolonie streak-outs van de positieve klonen en incubeer overnacht bij 30 ° C. Bereid een kweek gedurende de nacht in 50 ml LB _Amp en cultiveren van de cellen bij 200 rpm en 30 ° C.
7. Verdun overnachtkweken 40-voudig in 25 ml LB _Amp en groeien de bacteriën in aanwezigheid van 0,5% arabinose (Ara) bij 30 ° C en 200 rpm tot een OD _{600 nm} = 1,0 tot HdeB eiwitexpressie induceren.
8. Voor de pH-shift experimenten, gebruik LBAmp + Ara aan de cellen verdund tot OD _{600 nm} van 0,5 en aan te passen aan de respectievelijke pH-waarden (hier: pH 2,0, pH 3,0 en pH 4,0) door toevoeging van voldoende hoeveelheden van 5 M HCl.
9. Na de aangegeven tijdspunten (pH 2, 1 minuut, pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), neutraliseren de kweken door toevoegen van de geschikte volumes 5 M NaOH.
10. Bewaken van de groei van de geneutraliseerde cultures in vloeibare kweek gedurende 12 uur bij 30 ° C middels OD metingen.

Resultaten

HdeA en HdeB homoloog E. coli eiwitten bekend periplasmatische eiwitten te beschermen tegen zure stressomstandigheden ^10. Ons werk blijkt dat vergelijkbaar HdeA, HdeB functioneert ook als een zure moleculaire chaperon geactiveerd. In tegenstelling tot HdeA, HdeB functies op een pH die potentieel nog bactericide, maar aanzienlijk hoger dan het pH optimum van HdeA ^6,9,10,22. Om het pH optimum van HdeB's chaperone activiteit in vitro te onderzoeke...

Discussie

Om het mechanisme van activering en chaperone functie van HdeB bestuderen, grote hoeveelheden HdeB moet expressie gebracht en gezuiverd. Verschillende expressie vectorsystemen zijn beschikbaar voor de productie van hoge niveaus van een doelwiteiwit, waaronder pTrc of pBAD vectoren, die beide werden gebruikt in deze studie. De promotors zijn gemakkelijk toegankelijk zijn voor E. coli RNA polymerase en laten dan sterk opgereguleerd expressie van HdeB in een E. coli stam. Dit aspect is bijzonder rel...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NEB10-beta E. coli cellen	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Natriumchloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfaat	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 µm pore steriele spuitfilter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malaatdehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Kaliumfosfaat (monobasisch)	Fisher Scientific	BP362-500
Kaliumfosfaat (dibasisch)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescencspectrofotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetaat	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Natriumfosfaat monobasisch	Sigma	S9390-2.5KG
Natriumfosfaat dibasisch	Sigma	S397-500
Lactaatdehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytische Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764
Centerpiece, 12 mm, Epon met houtskool gevuld	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, analytisch, 8-plaats	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	gebruikt voor plasmide-zuivering (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescentie Cel cuvet	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotiden	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP-set	Invitrogen	10297018
Zoutzuur	Fisher Scientific	A144-212
Natriumhydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrofotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialyse membraan MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugaal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786