Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

6.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54598

⸱

28 februari 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie genereren we geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis-vruchtwatercellen, met behulp van een niet-viraal transposonsysteem.

Samenvatting

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) worden gegenereerd uit muis- en menselijke somatische cellen door geforceerde expressie van gedefinieerde transcriptiefactoren met behulp van verschillende methoden. Hier hebben we iPS-cellen geproduceerd uit muis-amniotische vloeistofcellen, met behulp van een niet-viraal gebaseerd transposonsysteem. Alle verkregen iPS-cellijnen vertoonden kenmerken van pluripotente cellen, inclusief het vermogen om zich te differentiëren naar derivaten van alle drie de kiembladen in vitro en in vivo. Deze strategie opent de mogelijkheid om cellen van zieke foetussen te gebruiken om nieuwe therapieën voor geboorteafwijkingen te ontwikkelen.

Inleiding

Prenatale diagnostiek is een belangrijk klinisch hulpmiddel om genetische ziekten (dwz chromosomale afwijkingen, monogenetische of polygenetische / multifactoriële aandoeningen) en aangeboren afwijkingen (dwz hernia diafragmatica, cystic long laesies, exomphalos, gastroschisis) te evalueren. Vruchtwater (AF) cellen zijn eenvoudig te verkrijgen van routinematig geplande procedures tijdens het tweede trimester van de zwangerschap (dwz vruchtwaterpunctie en amnioreduction) of keizersneden 1, 2. De beschikbaarheid van AF cellen van prenatale en neonatale patiënten geeft de mogelijkheid om deze bron regeneratieve medicijnen en verscheidene onderzoekers onderzochten de mogelijkheid om verschillende weefselbeschadigingen of ziekten met een stamcelpopulatie geïsoleerd uit AF 3, 4, 5, 6 behandel, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Zich gemakkelijk verkrijgen AF cellen van zieke patiënten in een tijdvenster waarin de ziekte is vaak stilstaat, opent de weg naar het idee van deze cel bron voor herprogrammering doeleinden. Inderdaad zou geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen afkomstig van AF cellen worden gedifferentieerd in de cellen van belang in vitro drug tests of weefselengineering, teneinde een adequate patiënt-specifieke therapie bereiden voor de bevalling. Vele studies hebben reeds werd aangetoond dat AF cellen te herprogrammeren en onderverdeeld in een groot aantal celtypes 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Sinds de ontdekking van Takahashi en Yamanaka 28 van reprogrammed somatische cellen door de geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, cMYC en Klf4), is er vooruitgang geboekt op het gebied van de herprogrammering. Gezien de verschillende werkwijzen kunnen onderscheiden tussen virale en niet-virale benaderingen. De eerste verwacht dat het gebruik van virale vectoren (retrovirussen en lentivirussen), die een hoge efficiëntie, maar meestal onvolledige onderdrukking van de retrovirale transgen met zowel het gevolg van een gedeeltelijk geherprogrammeerd cellijn en het risico van zijninsertiemutagenese 29, 30, 31. De niet-virale werkwijze gebruikt verschillende strategieën: bijvoorbeeld plasmiden, vectoren, mRNA, eiwit, transposons. De afleiding van iPS-cellen vrij van transgene sequenties heeft tot doel de mogelijke schadelijke effecten van lekkende transgenexpressie en insertiemutagenese omzeilen. Van alle hierboven vermelde niet-virale strategie, de piggyBac (PB) transposon / transposase vereist alleen de omgekeerde terminale herhalingen flankeren een transgen en tijdelijke expressie van het transposase enzym katalyseren invoeging of excisie gebeurtenissen 32. Het voordeel bij het gebruik van transposons boven andere werkwijzen voor iPS celgeneratie is de mogelijkheid om vectorvrije iPS cellen met een niet-virale vector benadering dezelfde efficiëntie van retrovirale vectoren toont. Dit kan door trace-less excisie van het transposon geïntegreerde codering voor de reprogramming factoren naar aanleiding van een nieuwe tijdelijke expressie van de transposase in de iPS-cellen 33. Aangezien PB efficiënt in verschillende celtypes 34, 35, 36, 37, is meer geschikt voor een klinische benadering met betrekking tot virale vectoren, en maakt de productie van xeno-vrije iPS cellen strijd met de huidige virusproductie protocollen die xenobiotische gebruiken voorwaarden, wordt dit systeem gebruikt om iPS cellen te verkrijgen uit muizen AF.

Hier stellen we een gedetailleerd protocol volgende reeds gepubliceerde werk om de productie van pluripotente iPS klonen van muizen AF-cellen (iPS-AF-cellen) 38 te tonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waren in overeenstemming met de Italiaanse wetgeving. Murine AF monsters werden geoogst van zwangere muizen op 13,5 dagen na coïtum (DPC) van C57BL / 6-Tg (UBC-GFP) 30Scha / J muizen geroepen GFP.

1. Transposon Production

OPMERKING: Transposon expressievectoren werden gegenereerd onder toepassing van standaard kloneringswerkwijzen. Het plasmide DNA voor transfectie muis AF-cellen werd bereid onder toepassing van commerciële kits.

  1. Meng 10 ng plasmide DNA met 50 pl DH5a bacteriën in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Incubeer de microcentrifugebuis op ijs gedurende 20 min.
  2. Hitteschok bij 42 ° C gedurende 40 sec.
  3. Plaats microcentrifugebuis op ijs gedurende 2 minuten.
  4. Voeg 250 pl voorverwarmde (37 ° C) lysogenie bouillon (LB) bouillon. Schudden (300 rpm) bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  5. Verspreid 30 pi van elke transformatie op LB-platen met 0,1 mg / ml ampicilline. Platen laten drogen en incuberen omgekeerd bij 37 ° C overnight.
  6. De volgende dag, in de middag, kies 3 kolonies, met behulp van steriele 200 pl tips, uit elke transformatie en overzetten naar 0,1 mg / ml LB amp.
  7. Schudden (300 rpm) bacteriën overnacht bij 37 ° C.
  8. Voor plasmidezuivering gebruiken commerciële kits. De plasmiden bij -20 ° C.

2. muis embryonale fibroblast (MEF) Cultuur

  1. Coating van de 6-well platen met 0,1% gelatine
    1. Coat platen onder de motorkap toevoegen van 1 ml steriel 0,1% gelatine aan alle zes putjes. Laat de gelatine polymeriseren de incubator (37 ° C) gedurende 1 uur.
    2. Gooi het overtollige, en droog de platen gedurende 1 uur.
    3. Met parafilm te verzegelen en opslag platen bij kamertemperatuur.
  2. Inactivatie van MEF met mitomycine C
    1. Dooi een flacon van 4 x 10 6 MEF cellen met een 37 ° C bad.
    2. Zaad MEF in de kap op een petrischaaltje (150 mm) met MEF medium.
    3. Cultiveren cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
    4. (LET) Voeg mitomycine C (5 mg / ml) wanneer de cellen confluent.
    5. Plaats cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2) gedurende 3 uur.
    6. Verwijder medium met mitomycine C. Was de cellen drie keer met 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
    7. Voeg 2 ml van de commerciële trypsine en plaats cellen in de 37 ° C incubator gedurende 5 min. Daarna voeg 18 ml medium blokkeren de trypsine reactie te stoppen.
    8. Tel de cellen met een Burker kamer volgens het protocol van de fabrikant.
    9. Centrifugeer cellen bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
    10. Seed 60.000 cellen / cm2 geïnactiveerde MEF op 0,1% gelatine beklede platen.
    11. Cultiveren cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2, voor het zaaien AF en / of iPS-AF cellen.

3. Mouse AF Cell Isolation

  1. Opzetten getimede paringen en check vaginale plugs na 24 uur co-housing.
  2. Observeer tot 13,5 dpc en offeren zwangere dam door middel van cervicale dislocatie.
  3. Reinig de buikwand van het dier met behulp 70% ethanol.
  4. Met een schaar, voeren een middellijn laparotomie incisie de lengte van de buikwand om toegang tot de buikholte krijgen.
  5. Expose de baarmoeder met behulp van een tang. Verwijder de baarmoeder met een schaar en overbrengen in een 100 mm petrischaal gevuld met steriele 1x PBS op ijs geplaatst.
  6. Gebruik een stereomicroscoop om de AF te halen bij 10x vergroting.
  7. Houd de baarmoeder met een tang en verwijder de baarmoederwand met een schaar. Wees voorzichtig om schade aan de vruchtvliezen en de daaruit voortvloeiende vruchtwater lekkage te voorkomen.
  8. Verzamel foetussen in een 100 mm petrischaal gevuld met steriele 1x PBS en plaats op ijs.
  9. Pak de placenta van een foetus met een fijne punt pincet en plaats in een schone 100 mm petrischaal.
  10. Verwijder de dooierzak met behulp van fijne punt pincet.
  11. Breek de amnion met behulp van fijne punt pincet en het verzamelen van 30 ul van AF voor elke foetus met behulp van een insulinespuit in een 15 ml conische flacon.
  12. Na AF verzamelen, was elke foetus met steriele 1x PBS aangevuld met 1% foetaal runderserum (FBS) en verzamelen in de 15 ml conische buis met de AF.
  13. Centrifugeer AF bij 145 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof onder de motorkap en het zaad van de gepelleteerde AF cellen.

4. Mouse AF Cell Culture

  1. Het zaaien van de muis AF Cells
    1. Eén dag voor het zaaien Bereid een 0,1% gelatine bedekte 6-well plaat met mitomycine C behandelde MEF.
    2. Na AF collectie, zaad van de cellen verkregen uit een vruchtwaterpunctie (ongeveer 1 x 10 7 cellen verkregen uit 6 foetussen) op de mitotisch geïnactiveerde MEF met behulp van AF kweekmedium.
    3. Cultiveren cellen bij 37 ° C en 5% CO 2, waarbij het medium elke andere dag.
    4. Na 7 dagen cultuur, transfect AF cellen na de hieronder beschreven procedure.

5. Transfectie, iPS-AF Cell Generation en Cultuur

OPMERKING: Mouse AF-cellen werden getransfecteerd met de PB-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmide, tezamen met een transposase expressieplasmide (mPBase) en met de omgekeerde tetracycline transactivator (PB-CAG-rtTA) transposon plasmide. Alle plasmiden werden verstrekt door professor Andras Nagy 33.

  1. Meng 1 ug PB-tetO2-IRES-OKMS met 0,5 ug mPBase en 0,5 ug PB-CAG-rtTA (Totaal DNA: 2 ug) in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  2. Verdun het DNA 100 ul serumvrij medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM).
  3. Voeg 8 pi van het transfectiereagens (bijvoorbeeld FUGENE) (in een verhouding van plasmide-DNA: transfectiemiddel van 2 ug (DNA) aan 8 pl transfectiemiddel) in de 1,5 ml microcentrifugebuis met DNA.
  4. Incubeer transfectiereagens / DNA mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Druppelsgewijs 100 ul van het transfectiereagens / DNA mengsel per putje van een 6-well plaat met muis AF cellen en distribueren door voorzichtig zwenken, met een eindvolume van 2 ml / putje. Laat gedurende 24 uur.
  6. De dag na, induceren de expressie van de factoren Yamanaka's (Oct4, Klf4, cMYC, Sox2) van het voeden van de cellen met vers iPS-AF medium gesupplementeerd met 1,5 ug / ml doxycycline (2 ml medium per putje).
  7. Voeden cellen elke dag, zonder passage, met verse-DOX bevattend medium (handhaven cellen in media, aangevuld met doxycycline tot punt 5.13).
  8. Acht cellen binnen 24 uur voor mCherry expressie en dagelijks voor kolonievorming (kolonies verschijnen meestal tussen 20 en 30 dagen na transfectie).
  9. Een dag voor kolonie plukken, bereiden een 96-well weefselkweek plaat met mitomycine C behandelde MEF.
  10. Pick enkele kolonies in 50 ul volume usinga 200 pi pipet, en zet ze achter elkaar in een 96-wells plaat in afzonderlijke putjes.
  11. De dag erna dissociëren elke kolonie in enkele cellen door toevoeging van 50 ul van de commerciële trypsine en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
  12. Pipet op en neer om de kolonie te splitsen.
  13. Overdracht 50 pi van trypsine met de gedissocieerde kolonie in een nieuwe put met geïnactiveerde MEF op een 0,1% gelatine beklede 96 well-plaat gevuld met 100 pl vers iPS-AF medium aangevuld met doxycycline.
  14. Wanneer cellen 60-70% confluentie bereikt, gesplitst in een putje van een 24-wells plaat.
  15. Wanneer cellen 60-70% confluentie bereikt, gesplitst 1: 2 tot twee putten, een met doxycycline en andere zonder doxycycline, om te controleren of kolonies ook in de toestand zonder doxycycline.
  16. Doorgaan met iPS-AF-klonen, doxycycline onafhankelijk te handhaven, op geïnactiveerd MEF in de iPS-AF medium.
  17. Cultiveren cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 DVDsanging medium dagelijks.

6. alkalische fosfatase Staining

  1. Voeren alkalische fosfatase kleuring volgens het protocol van de fabrikant wanneer er de verschijning van doxycycline onafhankelijke iPS-AF cellen.

7. Immunofluorescentie

  1. Wanneer er het verschijnen van doxycycline onafhankelijke iPS-AF cellen, zaad 150.000 cellen / cm2 op een putje van een 24-wells plaat met geïnactiveerde MEF en kweken cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. (NB) Bevestig de cellen door toevoeging van 300 pl per putje van 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 300 ul van 0,1% NP-40 te permeabilize cellen.
  4. Spoel de cellen met 300 ul 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Voeg 300 ul van de blokkerende buffer (10% paardenserum in 1x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  6. Gebruik de volgende primaire antilichamen: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) en SSEA1 (1:80). Verdun SSEA1 met 1% runderserumalbumine (BSA), 10% normaal geit serum, 0,3 M glycine in 0,1% PBS-Tween-20. Verdun alle andere antilichamen met 10% paardenserum in 1x PBS.
  7. Incubeer antilichamen overnacht bij 4 ° C.
  8. Spoelen met 300 pi 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Gebruik de secundaire antilichamen verdund in 10% paardenserum in 1x PBS: alexa594-geconjugeerd geit anti-muis IgG (1: 200), alexa594 geconjugeerd kip anti-geit IgG (1: 200), alexa594 geconjugeerd kip anti-konijn IgG (1: 200), Alexa568-geconjugeerd geiten anti-muis IgM (1: 200). Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  10. Spoel met 1x PBS.
  11. Vlek kernen met Hoechst-oplossing (1: 10.000) in 1x PBS.

8. In vitro celdifferentiatie

  1. Om opknoping druppel embryo lichamen (EB's) vormen, kweken enkele druppels (2000 cellen / 20 ul) op het deksel van de petrischalen, met het differentiatiemedium.
  2. Incubeer de gerechten bij 37 ° Cen 5% CO2 gedurende 4 dagen.
  3. Transfer EBS in 100 mm bacteriële-grade gerechten in de suspensie cultuur gedurende 3 dagen in differentiatie medium.
  4. Plate EBS in 24 goed platen bekleed met basaal membraan matrix (1:10 verdund in DMEM) voor nog eens 14 dagen.
  5. Voor immunofluorescentie analyses gebruikt primaire antilichamen: T (1: 100), αfp (1: 200) en Tubb3 (1: 500) 37.

9. In Vivo Teratoma Formation

  1. Injecteer 100 ui van 1 x PBS bevattende 1 x 10 6 cellen iPS-AF in de spier van de achterpoot van RAG2 - / - γc - / - muizen.
  2. Offer muizen door middel van cervicale dislocatie 6 weken na cel injectie.
  3. Verwijder de tumormassa's, verschillen in grootte, het achterbeen van de muizen voor de volgende analyses.
  4. Snijd 7-10 pm dikke dwarsdoorsneden van de isopentaan bevroren tumor met behulp van een cryostaat.
  5. Voor Haematoxyline eend Eosine (HE) Stain:
    1. Kleuren met HE het tumorweefsel preparaat zij na protocol van de fabrikant.
  6. Voor immunoperoxidase Stain:
    1. Fix teratoma secties met 4% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Permeabilize met 0,1% Triton X-100.
  7. Incubeer met de volgende antilichamen: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) en αSMA (1: 100) verdund in 1% BSA in 1x PBS. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C (voor Tubb3) of overnacht bij 4 ° C (voor andere antilichamen).
  8. Blok peroxidase gebruik 100% methanol gedurende 20 min.
  9. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C met secundair antilichaam anti-muis HRP-geconjugeerd (1: 150).
  10. Spoel met 1x PBS.
  11. Incubeer met peroxidase (HRP) substraat (zie Materialen tabel) gedurende 5 min.
  12. Spoel met leidingwater gedurende 5 minuten.
  13. Vlek met Haematoxyline QS 9 sec.
  14. Spoelen met kraanwater.

10. RNA-extractie uit cellen

  1. Gebruik commerciële RNA extractie kit volgens de aanbevolen protocol van de fabrikant.

11. RNA-extractie uit Teratoma

  1. Homogeniseer de teratoma met behulp van een vijzel en vloeibare stikstof om te voorkomen dat het ontdooien van het monster.
  2. Weeg 25 mg van het weefsel.
  3. Voeg 1 ml commercieel reagens voor RNA extractie en 200 ui chloroform.
  4. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  5. Centrifugeer bij 13.000 xg en 4 ° C gedurende 15 minuten.
  6. Breng de heldere supernatant naar een nieuwe buis.
  7. Te zuiveren het RNA gebruiken commerciële RNA extractie kit volgens het protocol van de fabrikant.

12. Reverse transcriptie-polymerase kettingreactie Analyse

  1. Synthetiseren de eerste streng cDNA met behulp van een reverse transcriptase voor reverse transcriptie (RT) -polymerase kettingreactie (PCR) en oligo (dT) according het protocol van de fabrikant, tot 50 ng / ul cDNA te verkrijgen. Verdun cDNA met RNase-vrij water in een concentratie van 10 ng / ul.
  2. RT-PCR uit te voeren met het DNA polymerase volgens het protocol van de fabrikant, gebruikmakend van 1 ng / ul cDNA.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De capaciteit van herprogrammering evalueren, werden muizen AF cellen verzameld uit foetussen van GFP muizen. Cellen werden getransfecteerd met de cirkelvormige transposon plasmide PB-tetO2-IRES-OKMS, waarbij de Yamanaka factoren (Oct4, Sox2, cMYC en Klf4) gerelateerd aan de mCherry fluorescerend eiwit in een doxycycline-induceerbare wijze tot expressie brengt, en omgekeerde tetracycline transactivator (PB- CAG-rtTA) plasmiden met het transposase expressieplasmide (mPBase). Muis AF-celle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De voor het induceren van pluripotentie verkrijgen werkwijze is relevant voor mobiele klinische veiligheid met betrekking tot langdurige transplantatie. Tegenwoordig zijn er verscheidene werkwijzen geschikt voor de herprogrammering. Onder de niet-integrerende methoden, het Sendai virus (SeV) vector een RNA virus dat grote hoeveelheden eiwitten kan produceren zonder integratie in de kern van de geïnfecteerde cellen 40 en een strategie om iPS cellen te verkrijgen zijn. SeV vectoren zou een aantrekk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door CARIPARO Foundation Grant nummer 13/04 en Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant nummer 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin en Michela Pozzobon worden gefinancierd door Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin wordt gefinancierd door CARIPARO Foundation Grant nummer 13/04. Paolo De Coppi wordt gefinancierd door Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes BD Falcon351029Voor in vitro differentiatie
2-mercaptoethanol SigmaM6250Voor muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM Thermo Fisher ScientificA21043Secundaire antilichaam (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG Thermo Fisher ScientificA21468Secundaire antilichaam (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA21442Secundaire antilichaam (immunofluorescence)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG Thermo Fisher ScientificA11005Secundaire antilichaam (immunofluorescence)
Alkaline Fosfatase kit Sigma85L1Alkaline Fosfatase  kleuring
AmpicillineSigmaA0166Voor bacteriële selectie
Bovine Serum Albumine SigmaA7906BSA, voor blokkeringsoplossing. Verdund in PBS 1x
ChloroformSigmaC2432Voor RNA extractie
DH5α cellenThermo Fisher Scientific18265-017Bacteriën voor klonering procedure
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039Voor MEF, muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium
Doxycycline SigmaD9891Voor exogene factoren expressie
Microcentrifuge buizen (1,5 ml) Sarstedt 72.706Voor PB productie 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024Voor muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium
FBS Thermo Fisher Scientific10270106Voor MEF medium
Fine point forcepsF.S.TDumont #5 AF isolatie
GelatineJ.T.Baker131Gebruikt 0,1%, verdund in PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718Voor blokkeringsoplossing. Verdund in PBS 1x
Haematoxyline QSVector LaboratoriesH3404Nuclei detectie
HE Bio-Optica04-061010Histologisch onderzoek van teratoma
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Nuclei detectie
Paarden Serum Thermo Fisher Scientific16050-122Voor blokkeringsoplossing
HRP-conjugated goat anti-mouse IgGSantaCruzsc2005Secundaire antilichaam (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Peroxidase substraat
Insulin spuit met naald (25 G)TerumoSS+01H25161Amniocentese procedure
Klf4 SantaCruzsc-20691Konijn polyklonaal IgG
L-glutamine Thermo Fisher Scientific25030Voor muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium
LB bouillon (Lennox)SigmaL3022Voor bacteriegroei
LIF SigmaL5158Voor muis AF en iPS-AF cellen medium
Matrigel BD354234Voor in vitro differentiatie. Verdund 1:10 in DMEM
MethanolSigma32213Peroxidase blokkering
MULTIWELL 24 wel plaatBD Falcon353047Voor in vitro differentiatie
MULTIWELL 6 wel plaatBD Falcon353046Voor MEF, muis AF en iPS-AF cellen cultuur
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FKonijn polyklonaal IgG
Niet-essentiële aminozuren SigmaM7145Voor muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000Voor blokkeringsoplossing. Verdund in PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0Voor cel permeabilisatie. Verdund in PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279Muis monoklonaal IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012Voor RT-PCR
Paraformaldehyde (oplossing)Sigma441244PFA, fixatie, verdund in PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, vrij van Ca2+/Mg2+. Verdund met steriel water om PBS 1x te verkrijgen
Penicilline - Streptomycine Thermo Fisher Scientific15070063Voor MEF, muis AF, iPS-AF cellen en differentiatiemedium
Petri Dish (150 mm)BD Falcon353025Voor MEF cultuur, weefsel cultuur
PiggyBac transposase expressie plasmid Verstrekt door professor Andras Nagy laboratorium-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmidVerstrekt door professor Andras Nagy laboratorium-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663Voor plasmiden zuivering
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Voor plasmiden zuivering
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid Verstrekt door professor Andras Nagy laboratorium-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134Voor RNA extractie
Sox2 SantaCruzsc-17320Geit polyklonaal IgG
SSEA1 Abcamab1

Referenties

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147(2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87(2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389(2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855(2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

herprogrammering van iPS cellenkiemblad differentiatieteratoomvormingfluorescentiemicroscopieRTPCR analysedoxycycline inductieMEF feeder cellen
De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.