Methodenartikel

Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

13.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54603

⸱

6 oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van multifotonmicroscopie om longtermijn, hoog-resolutie, enkelcellimago van de intacte long in real time uit te voeren met behulp van een vacuüm gestabiliseerd beeldvormingsvenster.

Samenvatting

Metastase naar secundaire plaatsen, zoals de longen, lever en botten is een traumatische gebeurtenis met een sterftecijfer van ongeveer 90% 1. Van deze sites, de longen is het moeilijkst te bepalen middels intravitale optische beeldvorming door zijn afgesloten plaats binnen het lichaam, delicate aard en belangrijke rol bij het instandhouden juiste fysiologie. Hoewel klinische modaliteiten (positron emissie tomografie (PET), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en computertomografie (CT)) staat om invasieve afbeeldingen van dit weefsel zijn, missen zij de resolutie nodig zijn om de eerste zaaien te visualiseren met een enkele pixel bestaande uit bijna duizend cellen. Huidige modellen van uitgezaaide longkanker zaaien postulaat dat de gebeurtenissen vlak na aankomst een tumorcel zijn deterministische om te overleven en de verdere groei. Dit betekent dat real-time imaging intravitale gereedschappen met enkele cel resolutie 2 nodig om de fenotypen van het zaaien cel definiërenls en test deze modellen. Terwijl hoge resolutie optische beeldvorming van de longen werd uitgevoerd met behulp van verschillende ex vivo preparaten, deze experimenten zijn typisch één tijdpunt assays en zijn gevoelig voor artefacten en eventuele verkeerde conclusies vanwege de drastisch veranderde omgeving (temperatuur, overvloed, cytokines, etc. ) als gevolg van verwijdering uit de borstholte en de bloedsomloop 3. Recent onderzoek heeft aangetoond dat de time-lapse intravitale optische beeldvorming van het intacte long is mogelijk met een gestabiliseerde onderdruk beeldvormende venster 2,4,5 hebben echter typische belichtingstijden beperkt tot ongeveer 6 uur. Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van langdurige intravitale time-lapse beeldvorming van de long gebruikmaking dergelijk venster over een periode van 12 uur. De time-lapse beeldreeksen zo verkregen inschakelen visualisatie en kwantificering van cel-cel interacties, membraan dynamiek en vasculaire perfusie in de longen. Verder hebben we dEscribe een beeld verwerkingstechniek waarbij een ongekend duidelijk beeld van de long microvasculatuur geeft.

Inleiding

Hoge resolutie intravitale optische beeldvorming heeft bewezen cruciaal voor het begrijpen van vele biologische processen, waardoor eencellige en sub-cellulaire parameters worden gemeten en gekwantificeerd worden. In kankeronderzoek is intravitale beeldvorming van tumor en stromale cellen leidde tot de identificatie van verschillende micro-omgeving interacties 6-11 die alleen aanwezig in het intacte dier.

Ontdekkingen over micro-omgevingen in verband met intravasation en de verspreiding van tumorcellen bij borstkanker met behulp van één enkele resolutie cell optische beeldvorming in vivo heeft zelfs geleid tot nieuwe markers voor prognose en respons op de behandeling bij borstkankerpatiënten 12-16. De beste imaging technologieën die beschikbaar zijn voor het bekijken van diep van binnen intact interne vitale organen zijn de klinische modaliteiten (MRI, PET, CT), die een prachtig uitzicht op het gehele orgaan te bieden en kunnen pathologieën openbaren nog voordat ze de klinische symptomen te produceren. Ze zijn niet in staat, hHof toevoegde, de vroegste stadia van metastase en de cellulaire mechanismen die progressie van de tumor te onthullen te wijten aan hun gebrek aan enkele resolutie cel. Tegen de tijd longmetastasen zichtbaar in deze modaliteiten, zijn ze goed ingeburgerd en prolifererende. Aangezien de schatting dat 90% van uitgezaaide tumorcellen die aankomen aan de long ofwel niet overleven 17 of aanvankelijk slapend blijven 18, en de waarneming dat ze veel eerder dan verwacht 19, het afbeelden van de eerste stappen van aankomst en overleving komen wordt cruciaal inzicht in het proces van gemetastaseerd zaaien en herhaling van tumorgroei op afgelegen plaatsen.

Het uitvoeren van deze waarnemingen in de longen is echter zeer moeilijk gebleken; de meerderheid van beeldvormende studies ex vivo of explantaat preparaten 20-23, die op het oog in de longen op enkele tijdstippen te benut. Terwijl deze voorbereidingen te doen geven nuttige informatie, ze niet over een volledig begrip van de interacties, oorzaak en gevolg relaties en dynamiek die plaatsvinden tussen de verschillende onderdelen van de micro-omgeving te geven. Het ontbreken van een goede bloedsomloop (en de daarmee gepaard gaande verstoring van de homeostase) en de ontkoppeling van de rest van het immuunsysteem van het lichaam maakt het wensen de conclusies die deze voorbereidingen te genereren in intacte weefsel in vivo te valideren.

Veel groepen hebben intravitale beeldvorming van de intacte long 2,4,5,24-33 met Wearn en Duits als eerste te chirurgisch bloot de pleura laag 24 en Terry als eerste een implanteerbare imaging venster 25 te gebruiken uitgevoerd.

Hoge resolutie beeldvorming in de longen sterk belemmerd door voortdurende beweging van de long en verschillende technieken ontwikkeld om deze beperking te overwinnen. Wagner en Filley 27 bestudeerde de natuurlijke beweging van de hond longen ontwierpen hun chirurgische protocol om hun geïmplanteerde venster vinden over een relatief stilstaande regio, terwijl Wagner gebruikt vacuüm in zijn raam chirurgische voorbereiding op het weefsel 28 te immobiliseren. Sinds die tijd hebben een verscheidenheid aan technieken zijn gebruikt om het beeld van de long waaronder: bronchus vastklemmen, sequentiële apneu en gated imaging, overbemonsterde overname, lijmen van de long kwab en vacuüm 34. Elk van deze heeft zijn voordelen en nadelen en niemand techniek is superieur gebleken een andere 34. Bijvoorbeeld, bronchus klem- en apneu sequentieel af aan het normale gasuitwisseling in de longen en kunnen atelectase veroorzaken. Gated beeldvorming en oversampled overname hebben geen last van deze nadelen, maar vereisen high-speed of gespecialiseerde grafische apparatuur niet breed toegankelijk. Slot worden lijmen van de long en de vacuümtechniek voorkomen beide bovengenoemde nadelen, maar kan afschuifkracht geïnduceerd letsel vertonen als zorg niet taknl. De laatste jaren heeft het vacuümvenster geminiaturiseerd en aangepast voor gebruik in muizen met behulp van confocale microscopie en multi-4,5,33 en uitstekende hoge-resolutie afbeelding is bereikt 2. Tabel 1 vat deze rijke geschiedenis en toont welke papieren die nieuwe beschrijven ontwikkelingen in het gebruik van intravitale longbeeldvorming ramen.

Dit protocol beschrijft het gebruik van verlengde time-lapse multiphoton intravitale microscopie om de afbeelding metastase in de live, intact long met de hoogst mogelijke resolutie subcellulaire. Beelden werden tot 12 uur met een multifoton microscoop met een hoge numerieke apertuur objectieflens en meerdere fotomultiplicatorbuis (PMT) detectoren. Transgene muismodellen worden gebruikt om fluorescent label inheemse macrofagen, samen met fluorescerende hoge gewicht dextran moleculaire en fluorescerend eiwit getransfecteerde tumorcellen (labelen het vaatstelsel en tumorcellen respectively). Hoewel de keuze van fluorescent gelabelde cellen maakt visualisatie van tumorcel-endotheelcel-macrofaag interacties en dynamiek dit protocol werken voor een stam van fluorescerende of niet-fluorescerende muis. Na de overname, wordt de resterende drift beweging (indien van toepassing) geëlimineerd met behulp van een Fiji plugin 35,36 en aangepaste macro's tijd het gemiddelde van de vasculaire kanaal te elimineren knipperen als gevolg van niet-gelabelde circulerende bloedcellen.

Hoewel dit protocol is gericht op beeldvorming metastase, de technieken zijn toepasbaar op vele andere biologische processen waarneembaar met hoge resolutie eencellige beeldvorming in de long.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle in dit protocol beschreven procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften voor het gebruik van gewervelde dieren, met inbegrip van de voorafgaande goedkeuring van het Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Het genereren van fluorescent gelabelde Mouse Model en tumorcellen

  1. Bereid 100 ml 0,1% (w / v) runderserumalbumine / fosfaat gebufferde zoutoplossing (BSA / PBS) buffer door het mengen van 0,1 g BSA met 100 ml PBS.
  2. Bereid fluorescent gelabelde tumorcellen door stabiele transfectie.
    LET OP: Hier gebruiken we E0771-LG-cellen, een zeer metastatische derivaat van E0771 muis adenocarcinoom cellen 37 die werden geïsoleerd uit uitgezaaide tumoren ontwikkeld in de longen van C57BL / 6 muizen intraveneus geïnjecteerd met ouderlijke E0771 cellen 38.
    1. 24 uur voor transfectie, plaat 1 x 10 5 EO771-LG cellen op een 60 mm weefselkweek schotel op 2 ml antibiotic gratis 10% FBS (foetaal runderserum) DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
    2. Op het moment van transfectie incubeer 2 ug van het fluorescerende proteïne vector met 10 ul van transfectie reagens voor 30 minuten voor het toevoegen van 190 pl verminderde serum media.
    3. Wash EO771 LG-cellen met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) eenmaal en voeg de transfectie mix zachtjes.
    4. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 6 uur.
    5. Was de getransfecteerde cellen en kweek in 2 ml compleet DMEM (10% FBS, 1 mM pyruvaat, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine) gedurende 2 dagen.
    6. Was de cellen met 2 ml steriele PBS, voeg 500 pl 0,25% trypsine-EDTA en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C.
    7. Verzamel celsuspensie en mengen met ten minste 1 volume volledig DMEM en spin neer bij 280 x g.
    8. Resuspendeer de cellen in 1 ml volledig DMEM en vergroten de celkweek ineen 10 cm weefselkweek schotel.
    9. Begin selectie van getransfecteerde cellen door toevoeging van 700 ug / ml G418 selectieve antibioticum 8 ml compleet DMEM en cultuur voor een week, het veranderen medium elke drie dagen.
  3. Verrijken de fluorescerende populatie getransfecteerde cellen die onder selectiedruk in G418 door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 39,40 zijn.
    1. Was de cellen met 5 ml PBS en voeg 1,5 ml van 0,25% trypsine.
    2. Incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C en meng met ten minste één volume volledig DMEM.
    3. Verzamel celsuspensie en spin neer op 280 xg en resuspendeer cellen in 1 ml steriel 0,1% (w / v) BSA / PBS buffer.
    4. Filter de celsuspensie door een 40 um mesh en pas het volume tot 1 ml met 0,1% BSA / PBS-buffer voor het sorteren.
    5. FACS-sorteren 10% helderste de bevolking op basis van fluorescentie spectrum met behulp van de FACS sorter 41.
    6. Cultuur van de gesorteerde cellen voor nog een week under selectie (700 ug / ml G418 in compleet DMEM).
    7. Opnieuw selecteren fluorescent gelabelde cellen door flowcytometrie door het herhalen van stappen 1.3.1 tot 1.3.6 nogmaals.
    8. Na een tweede selectieronde, trypsinize, filter en resuspendeer cellen in 0,1% BSA / PBS zoals beschreven (stappen 1.3.1-1.3.4). Passen concentratie 2 x 10 6 cellen / ml voor eenmalig celsortering in 96 putjesplaten met de FACS sorter.
    9. Bereid 3-5 96 putjesplaten met 100 ui volledig DMEM worden opgehaald. Verbetering van de overleving na sortering, voeg 100 ul van gefilterd kweekmedium van gerechten waar de EO771-LG-cellen werden gegroeid 42.
    10. Na het sorteren van de cellen in de 96-well platen terug cellen kweek gedurende 2 dagen (37 ° C, 5% CO2).
    11. Identificeer putten met levensvatbare enkele klonen door onderzoek onder een omgekeerde microscoop bij 5x vergroting.
    12. Trypsinize en levensvatbare klonen uit te breiden en vries cellen voor back-up.
      1. Was de putjes met grvanwege klonen met 100 pl steriel PBS. Voeg 50 ul van 0,25% w / v trypsine en incubeer 2 minuten bij 37 ° C. Voeg 50 ul volledig DMEM en overbrengen naar steriele V-bodem of ronde bodem 96-well plaat af te draaien bij 280 xg gedurende 5 minuten.
      2. Resuspendeer cellen in 100 pi 700 pg / ml G418 compleet DMEM en plaat elke kloon in 12-well platen. Voeg 400 ul van compleet DMEM met G418 en cultuur tot confluent.
      3. Was putjes met 500 pl PBS, voeg 100 ul van 0,25% trypsine en incubeer 2 minuten bij 37 ° C. Voeg 100 ul volledig DMEM en spin down gedurende 5 min bij 280 x g. Resuspendeer cellen in 100 ul van complete DMEM met G418 en plaat cellen in 6 well platen tot samenvloeiing.
      4. Eenmaal confluent, trypsinize cellen, spin down en resuspendeer in 10% DMSO in FBS naar cel voorraden te bevriezen.
      5. Houd 1/10 van de celsuspensies in kweek door ze uitplaten in 100 mm weefselkweekplaten voor de beoordeling van de metastatisch vermogen.
  4. Test metastatisch potentieel van geselecteerde klonen.
    1. Trypsinize en hersuspenderen cellen in zoutoplossing tot een concentratie van 2,5 x 10 6 cellen / ml en injecteer 200 ul in C57BL / 6-muizen intraveneus via de staartader.
    2. Na 2 weken, verzamelen longweefsel zoals eerder beschreven 23 en kwantificeren tumorlast door oppervlakte graaf of stereologische methode 43. Selecteer klonen met een hoog metastatisch vermogen voor intravitale beeldvorming.
  5. Raise MacBlue (een myeloïde specifieke promotor rijden cyaan fluorescente eiwit (GVB) expressie (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) reporter muizen 44.
    OPMERKING: Gewoonlijk muizen tussen 8 en 12 weken worden gebruikt, maar muizen al 7 en zo laat als 20 weken getest naar het werk.

2. Multiphoton Microscoop Set up en Imaging Voorbereiding

LET OP: Hoewel dit protocol kan worden uitgevoerd op elke multiphoton microscoop, het systeem om de in dit protocol te verwerven is eerder in detail beschreven 45.

  1. Zet alle microscoop en laser componenten waaronder twee-foton lasers en de detectoren ten minste één uur voor de gewenste beeldvorming tijd.
  2. Vlak voor de operatie, meet de kracht van het licht toegevoerd aan de microscoop door het plaatsen van de kop van de optische vermogensmeter in de stralengang net voor de microscoop en stel de laser einde holle spiegel knoppen totdat de maximale lichtintensiteit bij 880 nm wordt gelezen de optische power meter.

3. zuiging Stel

  1. Lijm de dekglaasje in de imaging-venster (Aanvullende Figuur 1) met cyanoacrylaat. Laat minstens 4 uur voor de lijm volledig droog.
    LET OP: Deze stap kan ook van tevoren worden gedaan.
  2. Snijd de 100 pi pipet tip in de eerste lijn van de kleine opening en sluit de ongesneden einde aan de dunne vacuum slang.
  3. Sluit het vacuümsysteem volgens figuur 1 en figuur 2 brief.
  4. Met het vacuüm op en het open einde geblokkeerd, passen het vacuüm regulator voor <3 inHg.
    OPMERKING: Afmontage het vacuümniveau wordt uitgevoerd door waarneming van de bloedvaten in vivo.
  5. Een dunne film van aardolie vet aan de onderzijde van de beeldplaat te voorkomen dat de objectieflens dompelmedium van wordt verwijderd door de beeldplaat goddelozen.
  6. Plaats de imaging plaat op de microscoop podium.
    OPMERKING: De aangepaste beeldplaat (Supplemental figuur 3) is een vel van 1/8 "dik aluminium gefreesd zowel passen in het stadium inbouwruimte en met een doorgaand gat in het midden voor het vasthouden van de beeldvormende venster.
  7. Steek het vacuüm raam in de beeldvormende plaat met het dekglaasje naar beneden.
  8. Steriliseren alle oppervlakken en instrumenten, waaronder imaging podium plaat, en imaging window met 70% ethanol.
  9. Sluit het afgesneden uiteinde van de pipetpunt het vacuümvenster en plak de slang naar de beeldplaat.
  10. Breng het doel dicht bij de beeldvorming raam en plaats een grote daling van water tussen het doel en het dekglaasje.
  11. Zorg ervoor dat er geen lekken zijn van het dekglaasje door het blokkeren van de centrale opening van het vacuüm raam en verifiëren dat de waterdruppel tussen de objectieve en dekglaasje niet wordt opgezogen.
    LET OP: Een oude stijl computermuis bal geplaatst over het venster is handig voor het blokkeren van de centrale opening.

4. Chirurgie

  1. Bereid de steriele chirurgische gebied.
    1. Plaats alle instrumenten binnen handbereik. Steriliseren alle oppervlakken en instrumenten, waaronder chirurgische gebied en chirurgische instrumenten met 70% ethanol.
  2. Bind een 3 inch lengte van 2-0 hechtdraad de katheter, ¼ inch boven de bus met een dubbele knoop.
  3. Bereid staartader katheter folgende het gepubliceerde protocol van Harney et al. 46.
  4. Via een infrarood (IR) warmtelamp, warm het dier in zijn kooi ~ 5 min om de bloedstroom in de staartader te vergroten en om te helpen bij inbrengen van de katheter. Aanbevolen wordt het dier opgewarmd fysiologische temperaturen gedurende de chirurgische procedure met behulp van een warmtelamp of een verwarmingskussen te houden.
  5. Verdoven het dier met 5% isofluraan en controleer of er geen reactie op een teen knijpen.
  6. Toepassen oogzalf voor de ogen van het dier.
  7. Solliciteer ontharingscrème lotion voor 10-30 sec om haar vanaf de linkerkant van het dier te verwijderen; van de middellijn van de borst tot ¼ van de rug en van de oksel tot net onder de ribbenkast.
  8. Reinig overtollige lotion en steriliseer blootgestelde huid met 70% alcohol.
  9. Bevestig een steriele injectiespuit gevuld met PBS aan de staart ader katheter en invoegen en tape op zijn plaats naar aanleiding van de gepubliceerde protocol van Harney et al. 46. Controleer of de band stevig gehecht aan de naald zelf en niet vrij in de ruimte tussen de staart en de tape.
  10. Intuberen de muis volgende ofwel het gepubliceerde protocol door Das et al. 47 of door DuPage et al. 48
  11. Schakel de ventilator en zet deze op 135 ademhalingen per minuut en 200 pl van isofluraan-zuurstof mengsel te leveren.
  12. Sluit de tracheale katheter naar de ventilator.
  13. Beweeg de muis om de chirurgische gebied. Wees uiterst voorzichtig de katheter niet te verjagen.
  14. Bind de 2-0 hechtdraad rond de snuit van de muis onder de voortanden.
  15. Tape de katheter naar de snuit.
  16. Tape de linker voorpoot aan de katheter om het uit van het chirurgische veld te houden.
  17. Laat de isofluraananesthesie een onderhoud niveau van 2,5% en controleer of er geen reactie op een teen knijpen.
  18. Met behulp van de scherpe schaar, verwijder dan 1 cm2 van de huid boven de linker borstwand.
  19. lift tHij uiervet pad en cauterize blootgestelde bloedvaten met de cauterisatie pen.
  20. Resect het vet pad door te snijden met de scherpe schaar.
  21. Verwijder de spierlaag omlaag naar de ribbenkast door te snijden met de scherpe schaar. Zorg ervoor dat u de oksel ader running afgesneden aan de basis van de voorpoot.
  22. Gebruik een tang te grijpen en til de 6e rib. Met behulp van de scherpe schaar gehouden op een ondiepe hoek (~ 5 °) snijd de rib in de buurt van de rand van de opening in de huid. Wees uiterst voorzichtig niet om de blootgestelde longweefsel raken.
  23. Verbreden van de opening in de borstwand om het gehele long kwab bloot door de vier opeenvolgende ribben.
    Opmerking: Bewaar de opening van ten minste 5 mm afstand van het borstbeen tot het hart te voorkomen.
  24. Til de muis door het grijpen van de staart en tracheale katheter en beweeg de muis om de microscoop imaging podium.
  25. Met het vacuüm af, vult de kamer van het vacuüm venster met PBS.
  26. Keer de muis en de positie van de blootgesteldelong over de vacuüm imaging-venster.
  27. Draai langzaam aan het vacuüm tot ongeveer 5/3 inch kwik met behulp van de kogelkraan.
  28. Plaats een beperkende harnas van tissuepapier gevouwen twee keer in de borst van de muis en de tape objectplaat zie Supplemental figuur 2.
  29. Clip de dij sensor van de pulsoximeter met het bovenbeen van het dier en start de software.
  30. Plaats de klimaatkamer op het podium en zet het vuur de muis handhaven op een fysiologische temperatuur.
  31. Verlaag het niveau van isofluraan tot 1-1,5% tot anesthesie te behouden en de doorbloeding te behouden.

5. intravitale Imaging

  1. Breng de 25 x 0.95 numerieke opening (NA) objectief in de buurt van het dekglaasje en voeg een grote daling van water tussen hen.
  2. Met behulp van epifluorescentie-modus, bekijk het FITC kanaal en breng het longweefsel in beeld.
  3. Indien niet eerder gedaan om de operatie, inject tumorcellen door middel van de staartader katheter.
    1. Koppel de PBS spuit uit de staartader katheter.
    2. Plaats een steriele spuit met 100 pl tumor celsuspensie (2 x 10 7 cellen / ml in PBS maximum).
      OPMERKING: Deze stap kan worden gedaan op voorhand te kankercel aankomst aan de long op verschillende tijdstippen te bestuderen.
    3. Sluit de spuit met tumorcellen op de staartader katheter.
    4. Injecteer langzaam de tumorcellen in de staartader.
    5. Koppel de spuit met de tumorcellen uit de staartader katheter.
    6. Sluit de PBS spuit om de staartader katheter.
      OPMERKING: Bepaal de locaties van alle tumorcellen vóór het injecteren van de dextran als het moeilijk wordt om de tumorcellen uit het dextran signaal onderscheiden oculair na injectie.
  4. Zoek tumorcellen afbeelding
    1. Voor het afbeelden van individuele tumorcellen, vinden alle tumorcellen en hun locaties met th opnemene multipoint panel van de software.
      1. Toon alle gezichtsveld op afbeelding door het observeren van de tumorcellen in de microscoop oculair.
      2. In de software over te schakelen naar de multipoint panel door te klikken op de knop Multi-Point en opslaan van de locatie van de cel door te klikken op de Position knop Add.
    2. Voor mozaïek beeldvorming, zoekt de oorsprong van het mozaïek en stel de imaging coördinaten
      1. Zoek een positie in de linker bovenhoek van de structuur vast te leggen.
      2. Nul de x, y en z coördinaten van het podium door op de "nul" op het podium controller.
      3. Laad de juiste lijst met mozaïek coördinaten door te klikken op de "Laden" knop en het selecteren van de lijst.
        Opmerking: Een voorbeeldlijst voor een 2 x 2 mozaïek met een 20% overlap van 500 urn gezichtsveld zou zijn: pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0400), Pos. 4 = (400.400).
  5. Verwijder de spuit wet PBS in de staart ader katheter en te vervangen door de spuit met de dextran.
  6. Injecteer langzaam tot 100 gl 20 mg / ml 155 kDa rhodamine-dextran opgelost in PBS in de muis via de staartader katheter, gevolgd door het injecteren van 50 pi steriel PBS tot de te spoelen. Gebruik geen bubbels niet te introduceren in de lijn. Indien nodig, injecteren dextran ten minste één uur na injectie kankercel zodat het totale volume toegediend aan de muizen niet meer dan 4 ml / kg / h.
  7. Opgezet imaging parameters.
    1. Schakel de microscoop om multiphoton mode.
    2. Stel de zoom in een factor 2X door te klikken op de knop Timing Signalen en actualisering van het veld Zoom Factor.
    3. Pas het laservermogen tot ~ 10% (~ 10-15 mW bij de steekproef) door te klikken op de detectoren en Laser-knop en vervolgens het aanpassen van de schuifregelaar Tsunami Power to 10.
  8. Afbeelding elke locatie op de aanwezigheid van tumorcellen te controleren en breng de stroom en de integriteit van de Vasculature.
    LET OP: Schepen moeten verschijnen volledig geperfuseerd met vloeiende erytrocyten en fluorescerende dextran moet worden opgenomen in de vaten zonder lekkage naar de extravasculaire ruimtes. Ongeveer 10-20 tumorcellen wordt verwacht dat in de vrije opening van het vacuümvenster.
  9. Stel de startdiepte van elke locatie af te beelden.
    1. Voor elke locatie, stel de Z-positie door het draaien van de focus knop op het podium controller het imago van de top slice van de tumorcel.
    2. Plaats de cel in het midden van het gezichtsveld.
    3. Klik op de Multipoint-knop, klik op de positie van het gezichtsveld om het te markeren en klik op de Add gevolgd door de knop Verwijderen om de cel opgeslagen positie in de multipoint lijst te vervangen.
    4. Visueel waarnemen van de relatieve helderheid van de tumorcel in elke positie.
  10. Sla de nieuwe locaties van elk van de cellen door te klikken op de knop Opslaan in de Multipoint panel eend een bestandsnaam opgeven.
  11. Voor de beeldvorming van individuele tumorcellen, kies drie cellen van ongeveer gelijkwaardige helderheid en alle andere locaties uit de multipoint lijst verwijderen door te klikken op hun locatie in de lijst en vervolgens te klikken op de knop Verwijderen.
  12. Klik op de detectoren en Laser-knop en pas de schuifregelaars voor de PMT winst van de groene en rode kanalen 45 zodat de signalen zijn hieronder verzadiging.
  13. Pas de schuifknop voor het blauwe kanaal 45, zodat macrofagen verschijnen cyaan.
    LET OP: Elke tweede harmonische signaal zal verschijnen alleen in het blauwe kanaal en kan uit de cyaan macrofagen worden gescheiden door het volgen van het kanaal aftrekken eerder beschreven procedure 45.
  14. Stel de z-stack start diepte 0 pm en het einde diepte 24 urn respectievelijk bewegen van de Z platform naar de locatie en op de begin en einde knoppen.
    OPMERKING: Cellen binnen deze diepte zal worden gevisualiseerd met de beste signaalruis en resolutie.
  15. Stel de z stapgrootte 3 urn.
  16. Stel de imaging parameters volgende parameters eerder beschreven 45,49.
    1. Voor de beeldvorming van individuele tumorcellen, klikt u op de knop Timing Signalen en voer vervolgens 4 V in het veld zoomfactor (equivalent aan een zoomfactor van 1,5x), voer 3 in het frame gebied gemiddelden en klik op Time-Lapse-knop en voer 10 in het veld Time-lapse.
      LET OP: Deze instellingen 1 beeld elke 3 seconden te verwerven.
    2. Voor mozaïek beeldvorming, klikt u op de knop Timing Signalen en geef een zoomfactor van 1,5 V (gelijk aan een zoomfactor van 4x), voer 3 in het nummer van het frame gemiddelden en klik op de Time-Lapse-knop en voer 10 in de tijd- vervalt tijdvertraging veld.
      LET OP: Deze instellingen 1 beeld elke 3 seconden te verwerven.
  17. Schakel de multipoint, z-stack en t-lapse imaging modi door te klikken op de knoppen.
  18. Druk op de opnameknop om beelden te verwerven.
    NIETE: longweefsel zeer delicaat en gevoelig voor foto-schade. Indien na time lapse imaging bloedstroom stopt in de afgebeelde veld, de laser is het meest waarschijnlijk te hoog en de daaropvolgende beeldvorming van andere velden moeten worden gedaan op een lager vermogen.
  19. Elke 30-45 min, injecteer langzaam 50 pl PBS of zoutoplossing hydratatie van het dier te handhaven.

6. Euthanasie

  1. Verhoog de isofluraan tot 5%.
  2. Houd het dier onder de 5% isofluraan tot 30 seconden nadat het ophoudt te ademen en verwijder het dier van het podium.
  3. Voeren cervicale dislocatie volledige euthanasie waarborgen.

7. Beeldanalyse

  1. Voor single cell imaging experimenten:
    1. Laad afbeeldingen in Fiji en formatteren ze als een HyperStack.
    2. Voor elke z-segment in het HyperStack, speel de time lapse film en kijk voor de resterende xy beweging. Als resterende xy beweging wordt gevonden, gelden de plugin genaamd StackReg 36 naar de stapelelimineren de beweging.
  2. Voor mozaïek imaging experimenten:
  3. Laad afbeeldingen in Fiji en naai ze samen door het openen van de Mozaïsche Stikken macro (Aanvullende codebestand Mosaic Hechten) en het invoeren van informatie over de beelden, zoals de map, het bestand base naam, het aantal x en y velden in het mozaïek en het aantal van de plakjes en tijdstippen.
    LET OP: Als gevolg van de manier waarop Java interpreteert directories, mapnamen moeten twee backslashes als submap afscheiders hebben. Als gevolg van beperkingen in de ingebouwde plugin Paarsgewijze Hechten, moeten basis bestandsnamen geen streepjes bevatten.
  4. Om een ​​duidelijk beeld van de grenzen van het vaatstelsel te verkrijgen, alle van de tijdstippen voor het bloed kanaal gemiddeld samen in één enkel beeld en repliceren dit beeld dan als de achtergrond voor elk frame van de film van de andere kanalen.
    NB: Dit wordt gedaan door simpelweg het uitvoeren van de Perform Blood Middelingstijd macro (Aanvullende codebestand Perform Blood Middelingstijd).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het soort resultaten die kunnen worden bereikt met deze werkwijze tonen, geïnjecteerd E0771-LG tumorcellen gemerkt met de fluorescerende eiwit klaver in de staartader van muizen MacBlue 44 op verschillende tijdstippen voor de operatie. Na de operatie, werd 155 kD rhodamine gemerkt dextran geïnjecteerd IV ter gelegenheid van het vaatstelsel en de time-lapse imaging werd uitgevoerd.

Wanneer beeldvorming muizen 24 uur ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoge resolutie in vivo optische beeldvorming in combinatie met fluorescent gelabelde functionele labels zoals eiwitten en antilichamen dramatisch toegenomen ons begrip van de metastatische cascade. Het heeft directe visualisatie en kwantificatie van single-cell en sub-cellulaire parameters in tumorcellen, gastheercellen en hun micro-omgeving ingeschakeld. Deze beeldvorming binnen de primaire tumor leidt bijvoorbeeld tot de ontdekking van discrete micromilieu dat ondersteunen ofwel groei invasie of verspreiding ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute's kankercentrum ondersteuningssubsidie P30CA013330, R01CA172451 aan JWP en het Integrated Imaging Program. Deze technologie werd ontwikkeld in het Gruss-Lipper Biophotonics Center en het Integrated Imaging Program aan het Albert Einstein College of Medicine. We erkennen de ondersteuning van deze centra in dit werk. De auteurs danken Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon en Anthony Leggiadro van de Einstein-machinewinkel voor hun bekwame en tijdige vakmanschap, het laboratorium van Matthew Krummel voor het genereus delen van hun raamontwerptekeningen, Kevin Elicieri en Jeremy Bredfeldt voor hun expertise in microscopie en hun versterkeraanbevelingen en Allison Harney en Bojana Gligorijevic voor informatieve discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg VacuumMcMaster Carr4172K12 Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter voor 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male PipeMcMaster Carr5346K13Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks met Tubulation; Hals gevormd voor rubber stopper No. 4; Capaciteit: 50 mlCorning Life Sciences Glass5360-50Vacuum Flask
Ronde glazen deksels dikte #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm diameter. Ted Pella, Inc.260368Cover slips
Exel International wegwerp Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 inch. Exel International26746Tracheal Catheter
PERMA-HAND zwarte gevlochten zijde hechtingen, ETHICON LIGAPAK Distributieriem Grootte 2-0VWR95056-992String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 ozHendel Corp.LOC1647358Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–DextranSigma-AldrichT1287-500MG155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Buizen, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wanddikte, 25 ft. LengteMcMaster Carr5155T12Thin Tubing & Tubing for Luer
Scheurbestendige Polyethyleen Buizen, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wanddikte, Wit, 50 ft. Lengte. McMaster Carr5181K24 Thick Tubing
Depilatoire LotionNair-
Micro Medical Buizen 95 Durometer LDPEScientific Commodities Inc.BB31695-PE/1Tubing voor staartaderkatheter
30 G x 1 inch BD PrecisionGlide NaaldBD305128Naalden voor staartaderkatheter
Puritan Niet-steriele katoenen tips Fisher Scientific867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight voor 3/32" x 1/16" Tube IDMcMaster Carr5117k51Connectors tussen buizen
One-Hole Rubber StoppersFisher Scientific14-135FStopper voor Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, Voor P-100, 100 µlDenville Scientific Inc.P1125Pipette Tip
Laboratory tapeFisher Scientific159015R
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Oogzalf
Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Gekarteld; Licht gebogen; 0.8 mm Tip Breedte; 4" LengteRoboz SurgicalRS-5135 Forceps
Extra Fijn Micro Dissecting Schaar 4" Recht Snip/Snip 24 mmRoboz SurgicalRS-5912Snip Schaar
Micro Dissecting Schaar 4" Recht Bots/BotsRoboz SurgicalRS-5980Bots Schaar
WipesFisher Scientific06-666-A. Harness
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuiteVitals Monitor
1 ml Spuit, Tuberculin Slip TipBD309659Syringe
Cyano acrylateStaplesLOC1647358Cover Slip Adhesive
Petroleum JellyFisher Scientific19-086291Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mmHarvard Apparatus734118Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeterKent ScientificPulse Oximeter
Isoethesia (isofluraan)Henry Schein Animal Health50033250 ml
OxygenTechAirOX TM
1x PBSLife Technologies10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 InGrainger3CGJ7Vacuum Valve
Small Animal VentilatorHarvard Apparatus683Alternatief verkrijgbaar bij Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum MediumThermoFisher Scientific31985062. 
Lipofectamine 2000 TransfectiereagensThermoFisher Scientific11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J MuizenJackson Laboratory026051. 
Multifoton MicroscoopOlympusFluoview FV1000Alternatief voor op maat gebouwde scope
Environmental EnclosurePrecision PlasticsChamber for FV1000Alternatief voor op maat gebouwde behuizing
Phosphate Buffered SalineThermoFisher Scientific14190136
Laser Power MeterCoherentFieldMaxIITOP
Laser Power Meter HoofdCoherentPM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein VectorAddgene40259
G418 Sulfaat Selectieve AntibioticumThermoFisher Scientific10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter Beckman CoulterXDP
Trypsin EDTA 1xCorning25-052-Cl
40 µm MeshFalcon352235
96 Well PlateCostar3599
60 mm Cultuur DishCorning430196
10 cm Cultuur DishCorning353003
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1xCorning21-031-CV
C57BL/6J MuisJackson Laboratory000664. 
Kim WipesFisher Scientific06-666-A. 

Referenties

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124(2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483(2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112(2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562(2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042(2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318(2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7(2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294(2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Longimagingvacu mgestabiliseerd vensterresolutie op enkelcelniveauzaaien van tumorcellentime lapse imagingvasculaire perfusiez stack reconstructiefluorescent dextran labelinganalyse van metastatische laesies

Gerelateerde artikelen