Methodenartikel

Rapid Overname van 3D-beelden met behulp van hoge-resolutie episcopische Microscopie

DOI:

10.3791/54625

⸱

21 november 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, The Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital, Wenzhou Medical University, 2Departments of Urology, Boston Children's Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een gedetailleerd protocol met behulp van hoog-resolutie episcopische microscopie om driedimensionale (3D) beelden van muis-embryo's te verkrijgen. Dit verbeterde protocol maakt gebruik van een gemodificeerde weefselvoorbereidingsmethode om de penetratie van de fluorescente kleurstof te verbeteren, waardoor morfometrische analyse van zowel kleine als grote specimen mogelijk wordt gemaakt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High-resolution episcopische microscopische (HREM) technologie maakt een snelle verwerving van hoogwaardige digitale volumetrische en driedimensionale (3D) morfometrische gegevens mogelijk. Hier beschrijven we het gedetailleerde protocol om de volledige muisembryo te beeldhouwen. Het protocol bestaat uit vier hoofdgedeelten: monstervoorbereiding, inbedding, beeldverwerving en ten slotte 3D-visualisatie. De technologie vereist dat monsters worden gekleurd met een fluorescerende kleurstof, wat problematisch kan zijn voor grote of dichte monsters. Om deze beperking te overwinnen, hebben we het bestaande protocol verbeterd om de penetratie van de kleurstof in het weefsel te verbeteren door het monster voor te behandelen met een oplossing die ureum en natriumdodecylsulfaat bevat. Het protocol gebruikt alleen routinelaboratoriumapparatuur en reagentia voor eenvoudige aanpassing in standaardlaboratoriumomgevingen. We laten zien dat de resulterende hoogwaardige 3D-beelden de gedetailleerde morfologische kenmerken van de inwendige organen van muisembryo's getrouw nabootsen, waardoor morfometrische analyses mogelijk worden. Samen presenteren we een gedetailleerd en verbeterd protocol dat standaard laboratoriumapparatuur gebruikt om hoogwaardige 3D-beelden van kleine en grote monsters te verkrijgen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ontstaan van 3D-beeldvormingstechnologieën heeft de mogelijkheid geopend voor systemische analyse van gedetailleerde morfologische kenmerken tijdens de ontwikkeling van de foetus. Er is nu een verscheidenheid aan 3D-beeldvormingsmodaliteiten beschikbaar, waaronder micro-magnetische resonantiebeeldvorming (micro-MRI), micro-computertomografie, hoogfrequente echografie, optische coherentietomografie, optische projectietomografie en episcopische microscopie1-4. Elke modaliteit heeft zijn eigen unieke kenmerken in resolutie, contrast, snelheid, kosten, in utero mogelijkheid en beschikbaarheid.

Episcopische fluorescentiebeeldopname (EFIC) en hoog-resolutie episcopische microscopie (HREM) zijn episcopische microscopie beeldvormingsmethoden4. Hier worden hoog-resolutie seriële beelden continu vastgelegd vanaf het blokoppervlak in plaats van weefselsecties. De resulterende beelden weerspiegelen getrouw gedetailleerde morfologische kenmerken met minimale of geen weefselvervorming. De verkregen volumetrische gegevens worden gemakkelijk omgezet in hoog-resolutie 3D-beelden die geschikt zijn voor nauwkeurige morfometrische analyse. Vanwege de relatief lage kosten en hoge resolutie, zijn HREM en EPIC de superieure alternatieven geworden voor systemische beoordeling van muismodellen van menselijke geboorteafwijkingen2,4-8.

Zowel EFIC- als HREM-methoden vereisen dat monsters worden ingebed in het geschikte medium. EFIC detecteert autofluorescentie die wordt uitgezonden door het ingebedde weefsel. Hierdoor is het beperkt tot monsters die hoge niveaus van autofluorescentie uitstoten, maar niet tot die met relatief zwakke autofluorescentie zoals embryo's in een vroeg stadium9. Om de afhankelijkheid van autofluorescentie te overwinnen, worden monsters gekleurd met een fluorescerende kleurstof zoals eosine voor HREM-beeldvorming. De keuze van kleurstoffen en kleurmethoden maakt HREM ook geschikter om moleculaire signalen te detecteren in de context van weefselarchitectuur en morfologie4,10.

In dit artikel presenteren we een verbeterd HREM-protocol dat geschikt is voor volledige beoordeling van muis-embryo's in een later stadium. Om de kleuring te vergemakkelijken, voegen we een voorbehandelingsstap toe om de weefselpenetratie te verhogen, waardoor HREM-beeldvorming van oudere muis-embryo's mogelijk wordt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dieren gebruik worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Boston Children's Hospital.

1. Monstervoorbereiding

  1. Timed paring
    1. Plaats een C57Bl6 wild type man en een vrouw samen in dezelfde kooi.
    2. Controleer voor de vorming van een paring stekker begin volgende ochtend. De paring stekker (aka, vaginaal of copulatie stekker) is een geharde gelatine-achtige afzetting dat blokkeert de vagina.
    3. Stel de stekker datum als embryonale dag 0,5 (e0.5).
  2. Isolatie van muizenembryo's
    1. Euthanaseren zwangere vrouwtjes door CO 2 stikken.
    2. Zet muizen liggende op een absorberend kussen en spuit buikstreek met 70% ethanol.
    3. Til de huid en maakt een eerste 5 mm incisie in het caudale buikstreek met behulp van chirurgische schaar. Snijd en verwijder de buikhuid om de interne organen volledig bloot
    4. Snijd de buurt vagina om de gehele baarmoeder verwijderen.
    5. Knip tussen implantatie bezienswaardigheden langs de baarmoeder hoorn. Elk segment of conceptus zou slechts één embryo binnen te hebben.
    6. Houd de baarmoeder segmenten 1x ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. embryo dissectie
    1. Plaats elke conceptie in een aparte schaal met ijskoud PBS onder een stereoscoop.
    2. Verwijder de baarmoeder weefsels, placenta en vruchtvliezen sequentieel met behulp van fijne ontleden tang.
    3. Breng de ontleed embryo naar een 50 ml buis met 1x ijskoud PBS met een grote overdracht pipet. Vermijd het oppakken van embryo rechtstreeks met een tang om weefselschade te minimaliseren.
  4. bevestiging
    1. Bevestig de embryo ontleed in 10% neutraal gebufferde formaline oplossing bij 4 ° C gedurende meer dan 24 uur met ten minste 10 monstervolumes fixatief.
  5. voorbehandeling
    1. Bereid de Clearing Oplossing: 4M ureum, 10% glycerol, 4% natriumdodecylsulfaat (SDS) in dubbel gedestilleerd water.
    2. Vervang het fixeermiddel met de Clearing Solution.
    3. Voorzichtig zwenken het monster op een rocker bij kamertemperatuur gedurende 1-2 weken. Ruil de Clearing Solution eenmaal op de tweede en de derde dag. Het monster wordt langzaam helder en doorzichtig.
    4. Vervang de Clearing Solution met 10% formaline en laat op een rocker voor 2 dagen.
  6. uitdroging
    1. Was de voorbehandelde monsters met 1x PBS 3 maal gedurende 5 minuten elk.
    2. Dehydrateren monsters in een oplopende reeks ethanol bij kamertemperatuur op een zachte rocker. Voor E15.5 embryo Gebruik een oplopende ethanolreeks zoals 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% en 100% ethanol, 2 uur elke stap. Voor oudere embryo's, de incubatietijd te worden verhoogd.
  7. kleuring
    1. Bereid kleuring Oplossing: voeg 0,1375 gram Eosine Y Disodium Salt en 0,0275 gram Acridineoranje hemi (zinkchloride) zout aan 50 ml 100% ethanol. Roer gedurende 2 uur. Filter met een papieren filter. Bewaar bij kamertemperatuur en licht te vermijden door het bedekken met aluminiumfolie.
    2. Transfer monster tot het kleuroplossing gedurende 1 uur.
    3. Vervang met verse kleuroplossing en vlek 's nachts.
  8. infiltratie
    1. Bereid Infiltratie Oplossing: combineer 100 ml van oplossing A van JB-4 inbedding kit, 1,25 g katalysator C, 0,275 g eosine Y dinatriumzout en 0,055 g Acridineoranje hemi (zinkchloride) zout. Roer te mengen (200 rpm) in een ijsemmer gedurende 2 uur, en vervolgens filteren met de filter papier.
    2. Bewaar de Infiltration oplossing bij 4 ° C en licht te vermijden door het bedekken met aluminiumfolie.
    3. Breng de embryo infiltratie oplossing: kleuroplossing (1: 1), en incuberen gedurende ten minste 3 uur op een rocker bij 4 ° C.
    4. Breng de embryo's infiltratie oplossing en incubeer gedurende 3 uurr op een rocker in een koude kamer.
    5. Vervang Infiltratie oplossing eenmaal per dag, en laat in een koude kamer op een zachte rocker nog drie dagen.

2. Embedding

  1. Houd Oplossing B en Infiltration Solution op ijs.
  2. Maak Embedding Solution (1:25 van de oplossing B en Infiltration Solution) onmiddellijk voor het inbedden.
  3. Orient het model in een inbedding mal en giet koud Embedding Oplossing in de inbedding mal voorzichtig. Re-oriënteren met een pin als dat nodig is.
  4. Gebruik een pen om te onderzoeken of de Embedding Solution is gestold. Duw het monster blok, en trim deze indien nodig.
  5. Heroriënteren het monster blok met de aparte vorm van een kruis oriëntatie te verkrijgen.
  6. Liep blokhouder bovenop de matrijs insluiten. Giet Embedding Oplossing in de mal totdat de schimmel en het blok houder worden overspoeld door insluiten Solution.
  7. Houd het monster in een secundaire container en laat hetop ijs gedurende 3-4 uur in een zuurkast.
  8. Bewaar de gestolde monsters in een 4 ° C.
  9. Afpellen de inbedding mal. Zet het blok onder de stereomicroscoop met schuine verlichting om de positie van het model in het blok te inspecteren. Op het blok gezicht, mark rasterlijnen rond het monster.
  10. Trim het blok om de toegang hoeveelheid te verwijderen van het inbedden van materiaal met behulp van de gemarkeerde rasterlijnen als gevonden.

3. Image Acquisition

  1. Klem het monster blok aan het microtoom en het verkrijgen van een vers gesneden oppervlak. Stel coupedikte (bv e9.5-10.5, 1,5 micrometer, e11.5-12.5, 2,0 micrometer, e13.5-15.5, 2,5 micrometer, E16.5-ouder, 3 pm). Houd het monster / blok aan de uitgangspositie van de microtoom.
  2. Monteer de stereo zoom microscoop horizontaal tegenover het blok oppervlak van het monster.
  3. Zet de computer en de microscoop, en beginnen met het beeld acquisitie software.
  4. Visualiseren en de focus van de optiek om het blok-faceonder de "live view" -modus van imaging software.
  5. Lijn microscoop en microtoom indien nodig opdat het blok-face is in het centrum van zoeker.
  6. Stel de zoom in zodat het hele blok-gezicht is in de zoeker.
  7. Kies groen fluorescerend eiwit (GFP) filter (excitatie 470 ± 20 nm, dichroic 495 nm, emissie 525 ± 25 nm) en te heroriënteren indien nodig.
  8. Meet en stel de belichtingstijd handmatig (bijvoorbeeld, 80-400 mini sec).
  9. Acquire beelden van het blok-face na elke vers gesneden en afbeeldingen automatisch op te slaan, indien mogelijk.
  10. Record belangrijke parameters zoals resolutie, coupedikte en zoom.
  11. Na het afronden van het gehele monster, export en converteren van alle beeldbestanden naar JPEG-formaat indien nodig.
  12. Omkeren alle originele beelden met behulp van een imaging processing software, en de helderheid en het contrast aan te passen.
  13. Bewaar alle bewerkte beelden in een aparte map.

4. 3Dvisualisatie

  1. Upload alle bewerkte beelden naar een 3D-visualisatie software volgens de instructies.
  2. Input-resolutie en coupedikte om alle beelden te volumetrische gegevens (dwz, voxel grootte) converteren en opslaan van de 3D-bestand.
  3. Lijn alle foto's met behulp van de automatische modus. Stel afzonderlijke beelden handmatig indien nodig.
  4. Sla de uitgelijnde afbeelding voor een nieuwe bestandsnaam.
  5. Analyseer morfometrische kenmerken van het model met behulp van de 3D-visualisatie software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben hoge kwaliteit HREM beelden van muizenembryo's tussen E9.5 en E13.5 8 gerapporteerd. Beeldkwaliteit van de late gefaseerde embryo echter aanzienlijk aangetast door de beperkte penetratie van de fluorescente kleurstof eosine. Om de kleuring efficiëntie te verhogen, hebben we verschillende voorbehandeling methoden die compatibel zijn met fluorescerende beeldvorming 11 zijn getest. In het bijzonder werden de E15.5 muis embryo's behandeld met SCA / e A...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gemodificeerd protocol gebruikt routine laboratoriumapparatuur serial HREM op die compatibel zijn voor een snelle 3D visualisatie en morfometrische analyse van complexe structuren te verkrijgen. Omdat de beelden met hoge resolutie direct uit het blok gezicht in plaats van afzonderlijke secties worden genomen, worden de fijne morfologische kenmerken bewaard gebleven en snel digitaal gereconstrueerd in een 3D-visualisatie programma.

3D beeldvorming biedt belangrijke voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Drs. Yichen Huang, Chunming Guo en Zhenfang Zhou voor hun technische ondersteuning. Dit onderzoek werd gefinancierd door NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) en American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MuizenThe Jackson LaboratoryC57BL6
Ethyl AlcoholPharmco-Aaper111000200200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
FormalinSigmaHT501128-4L
UreaSigmaU5128Clearing Solution
GlycerolFisher scientificG33-4Clearing Solution
Sodium Dodecyl SulfateInvitrogen15525-017Clearing Solution
Eosin Y Disodium SaltFisher scientificBP241925Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) saltSigmaA6014Infiltration Solution
Whatman papierGE3030-153
JB-4 Inbedding Kit - Solution APolysciences, Inc.0226A-800Infiltration Solution
JB-4 Inbedding Kit - Solution BPolysciences, Inc.0226B-30Embedding Solution
JB-4 Inbedding Kit - CatalystPolysciences, Inc.02618-12Infiltration Solution
Inbedding MoldsPolysciences, Inc.23185-116 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding MoldsPolysciences, Inc.18986-122 mm x 22 mm vierkant, afgesneden tot 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block HoldersPolysciences, Inc.15899
Disposable Graduated Transfer PipesVWR414004-014
Petrl DishVWR25384-088Embryo dissectie
Forceps Inox Tip ROBOZRS-5015Embryo dissectie
Graefe Tissue Forcep ROBOZRS-5153Embryo dissectie
Delicate Operating Scissor ROBOZRS-6700Embryo dissectie
14 ml Polypropylene Round-Bottom TubesFalcon352059
50 ml Polypropylene Conical TubesFalcon352098
Ice BucketMagic Touch Iceware International Corp.R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh BoatsVWR89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh BoatsVWR89106-770
Sodium ChlorideMP Biomedicals102892PBS Solution
Potassium ChlorideSigmaP0662PBS Solution
Potassium phosphate monobasicSigmaP5405PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrateSigma-AldrichS9390PBS Solution
Digital CameraHamamatsu PhotonicsC11440-10C
MicrotomeLeicaRM2265
IlluminatorCarl ZeissHXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom MicroscopeCarl ZeissAxio Zoom.V16
Stereo MicroscopeOlympusSZX16
Fiber Optic Light SourceLeicaKL 1500 LCD
Disposable Microtome BladeVWR95057-832
Single Edge DispenserPersonna62-0330-0000
ZENCarl Zeisspro 2012
PhotoshopAdobeCS6 v13.0
Amira 3D SoftwareVisage Imaging5.4
ComputerDell T7600, 2x900GB SAS hard drive en 64 GB DDR3 RDIMM geheugen
Rocking Platform ShakersVWR40000-304
Standard Hot Plate StirrerVWR12365-382
Analytical BalanceMettler ToledoAB54-S

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
  2. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
  3. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
  4. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
  6. Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
  7. Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
  8. Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
  9. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
  10. Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  12. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D beeldacquisitiebeeldvorming van muisembryo smonstervoorbereidingweefselverhelderingfluorescente kleuringethanoldehydratieinbeddingsproceduremicrotoomcoupes3D visualisatie

Gerelateerde artikelen