Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

voorbereiding en

9.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54652

⸱

23 november 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we de bereiding en toepassing van een op activiteit gebaseerde probe (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat) waarmee voor de detectie en kwantificering van de actieve vorm van het enzym N proinflammatoire -acylethanolamine acid amidase (NAAA), zowel in vitro en ex vivo.

Samenvatting

Activiteitsgestuurde eiwitprofilering (ABPP) is een methode voor de identificatie van een enzym van belang in een complex proteoom door het gebruik van een probe die chemisch actieve plaatsen van het enzym gericht. Een reporter tag ingebracht in de probe maakt de detectie van de gemerkte enzym in de gel fluorescentie scanning, eiwitblot, fluorescentiemicroscopie of vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Hier beschrijven we de bereiding en het gebruik van de verbinding ARN14686, een click chemie activiteit-gebaseerde probe (CC-ABP) die selectief herkent het enzym N -acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is een cysteïne hydrolase die de ontsteking bevordert door het uitschakelen van endogene peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor (PPAR) -alfa agonisten zoals palmitoylethanolamide (PEA) en oleoylethanolamide (OEA). NAAA wordt gesynthetiseerd als een inactieve pro-enzym met volledige lengte, die wordt geactiveerd door autoproteolyse in de zure pH van het lysosoom. Lokalisatiestudies have aangetoond dat NAAA voornamelijk tot expressie wordt gebracht in macrofagen en andere van monocyt afgeleide cellen, en in B-lymfocyten. Wij geven voorbeelden van hoe ARN14686 kan worden gebruikt voor het detecteren en kwantificeren actieve NAAA ex vivo knaagdieren weefsel met eiwitblot en fluorescentie microscopie.

Inleiding

Veel gebruikte methodes om de expressiepatronen interacties en functies van eiwitten, waaronder vloeistofchromatografie-massaspectrometrie platforms voor jachtgeweer analyse 1,2, gist two-hybrid onderzoeken methoden 3,4 en in vitro assays, zijn beperkt doordat ze in staat om de activiteit van eiwitten bepalen in hun natieve toestand. Activity-based eiwit profiling (ABPP) kan worden gebruikt om deze leemte op te vullen. In deze benadering, kleine-molecule probes covalent binden aan de actieve plaats van een enzym van belang geconjugeerd aan een reporter groep die zorgt voor doeldetectie. Met behulp van click chemie (CC), kan de verslaggever worden geïntegreerd in de probe of kan worden ingevoerd na doelwit betrokkenheid heeft plaatsgevonden 5,6. De laatste procedure vereist het gebruik van probes die geschikte chemische groepen, zoals een terminale alkyn of azide, die met een aantal reporter reagens kan worden gewijzigd via bio-orthogonale reacties such als Cu (I) -gekatalyseerde Huisgen [3 + 2] cycloadditie 7-9 of Staudinger ligation 10,11.

Onlangs beschreven wij de verbinding ARN14686 als eerste ABP voor de in vitro en in vivo detectie van de cysteïne hydrolase, NAAA 12. NAAA katalyseert de hydrolytische inactivering van verzadigde en enkelvoudig onverzadigde FAES, waaronder oleoylethanolamide (OEA) en palmitoylethanolamide (PEA), die endogene agonisten van de anti-inflammatoire nucleaire receptor PPAR-alpha 13-15 zijn. NAAA wordt voornamelijk tot expressie gebracht in macrofagen en andere van monocyt afgeleide cellen, en in B-lymfocyten 14,16, suggereert een rol in de regulatie van de aangeboren immuunrespons. Het enzym wordt gesynthetiseerd in het ruw ER in een inactieve vorm en zure compartimenten van de cel wordt geactiveerd door een autoproteolytische mechanisme 17. De autoprotolytische splitsing genereert een nieuw N-terminale cysteïne (C131 bij muizen en ratten, C126 bij de mens), die het nucleofiel belast FAE hydrolyse 18,19. Farmacologische remming van NAAA activiteit verandert de FAE synthese / afbraak balans in het voordeel van verhoogde cellulaire niveaus van Faes 16,20,21. Verschillende β-lacton en β-lactam derivaten aangetoond dat NAAA activiteit te remmen met hoge potentie en selectiviteit 16,22-26. Deze remmers werken via S-acylering van het katalytische cysteïne 16,27,28.

De verbinding ARN14686 werd ontworpen op basis van de chemische structuur van de systemisch actieve serine-afgeleide β-lactam NAAA inhibitor, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat) 16. De 4-butyl- cyclohexyl groep ARN726 werd vervangen door een C9 verzadigde alifatische keten die van een terminal alkyn tag CC daaropvolgende conjugatie met een azide-dragende reporter tag. Wij kozen voor een tweestaps ABP ontwerpen om minimally veranderen de structuur van de oorspronkelijke steiger, waardoor het behoud van de affiniteit van de sonde voor NAAA. Bovendien vermijden van de introductie van omvangrijke markeringen dergelijke sonde kan meer geschikt zijn voor in vivo behandeling van een directe ABP zijn. ARN14686 remt NAAA met hoge potentie (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM) door vorming van een covalente adduct met de katalytische cysteïne van het enzym 12. Experimenten in levende ratten toonde aan dat de sonde selectief vastleggen NAAA uitgedrukt in longen. Zuur ceramidase, een cysteïne amidase dat 33-34% identiteit deelt met NAAA, werd ook geïdentificeerd als een lage-affiniteit doelwit Als hoge probe concentraties (10 uM in vitro, 10 mg / ml intraveneus, iv) 12. We hebben ook ARN14686 de aanwezigheid van actieve NAAA in ontstoken weefsels ratten na toediening van adjuvans (CFA) 29 volledig Freund bestuderen.

Hier schetsen we een protocol voor de preparatiop van ARN14686 (figuur 1) en de toepassing ervan op het onderzoek naar NAAA activering ex vivo. Als voorbeeld beschrijven we een experimentele procedure NAAA visualiseren rat poten na CFA toediening. In dit experiment worden eiwitten geëxtraheerd uit weefsel poot na intraveneuze injectie van de sonde en het ABP-gemerkte proteoom wordt onderworpen aan CC biotine-azide. Gebiotinyleerde monsters worden verrijkt via streptavidine parels en eiwitblots worden uitgevoerd. In een andere toepassing, beschrijven we de lokalisatie van actieve NAAA van fluorescentiemicroscopie in muizenlongen van probe-behandelde muizen. In dit geval wordt het weefsel doorgesneden en secties worden onderworpen aan CC rhodamine toevoeging. Een werkstroom schema is weergegeven in figuur 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Let op: Alle chemische reacties moeten in een geventileerde zuurkast en met het gebruik van een lab jas, handschoenen en een veiligheidsbril worden uitgevoerd. De reacties moeten ook in een stikstofatmosfeer uitgevoerd.

Ethische verklaring: Onze procedures waarbij dieren worden uitgevoerd in overeenstemming met de Italiaanse regelgeving inzake de bescherming van dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (DM 116.192), en de Europese Economische Gemeenschap voorschriften (PB van de EG L 358/1 1986/12/18 ).

OPMERKING: Synthese van [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetaat wordt beschreven voor grootschalige opbrengst (50 g N-Cbz-L-Serine), maar het kan gemakkelijk worden verkleind.

1. Synthese

OPMERKING: Zie figuur 1 voor de synthese reactieschema.

  1. Bereiding van 2-pyridyl undec-10-ynyl carbonaat en undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-carboxylaat
    1. In een 50 ml rondbodemkolf, los 350 mg undec-10-yn-1-ol in 3,5 ml droge dichloormethaan.
    2. Aan de oplossing in 1.1.1, voeg 25 mg 4-dimethylaminopyridine (DMAP) en 530 mg 2-dipyridylcarbonate (DPC). Roer het mengsel bij kamertemperatuur (KT) gedurende 16 uur.
    3. Voeg 20 ml dichloormethaan.
    4. Breng het mengsel in een scheitrechter. Voeg 15 ml water, schud het, en laat de twee fasen te scheiden.
    5. Open de kraan, het verzamelen van de organische fase (onder), en sluit het kraantje. Voeg 15 ml van een verzadigde NaHCO3 oplossing. Schud de scheitrechter en laat de twee fasen te scheiden. Herhaal deze stap nog twee keer.
    6. Droog de organische laag met Na 2 SO 4, filtreer door katoen in een rondbodemkolf (tarra eerst) en damp tot droog onder verlaagde druk (roterende verdamper).
    7. Weeg de kolf en het verkrijgen van 600 mg olie die een mengsel van 2-pyridyl undec-10-ynyl carbonaat en undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-carboxylaat in een verhouding van 1,7: 1.
      1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) hoofdcomponent δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1H), 7,98 (td, J = 7,9, 2,0, 1H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4,9, 0,9, 1H), 7,30 (d, J = 8,2, 1H), 4,22 (t, J = 6,6, 2H), 2,73 (t, J = 2,4, 1H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,76 - 1,62 (m, 2H), 1,50 - 1,23 (m, 12H).
      1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) gering aandeel δ = 7,74 (dd, J = 7,2, 1,9, 1H), 7,47 (dd, J = 6,7, 2,3, 1H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6,30-6,25 (m, 1H), 4,35 (t, J = 6,5, 2H), 2,72 (t, J = 2,4, 1H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,77-1,60 (m, 2H ), 1,52-1,20 (m, 12H).
    8. Gebruik de olie zonder verdere scheiding of zuivering.
  2. Bereiding van [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetaat
    1. Bereiding van benzyl-N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyfenyl) amino] -2-oxoethyl] carbamaat.
      1. In een 4-L rondbodemkolf, los 141,5 g p-anisidine in 1,5 L tetrahydrofuran en 0,5 liter dichloormethaan.
      2. Koel de oplossing tot 0 ° C in een ijsbad.
      3. Voeg 50,0 g N-Cbz-L-serine en 43,9 g N - (3-dimethylaminopropyl) - N-ethylcarbodiimide hydrochloride.
      4. Roer het mengsel met een magneetstaaf bij 0 ° C gedurende 30 minuten.
      5. Verwijder de oplossing uit het ijsbad en roer met een magneetstaaf bij kamertemperatuur gedurende 16 uur.
      6. Verdamp het oplosmiddel onder verlaagde druk (roterende verdamper).
      7. Voeg 400 ml 1: 1 cyclohexaan / ethylacetaat, geroerd met een spatel en decanteren.
      8. Herhaal stap 1.2.1.7 twee keer.
      9. Los het gomachtige residu in 500 ml ethylacetaat en wassen met 400 ml 0,1 M HCl-oplossing (10 maal), met 400 ml verzadigde NaHCO3-oplossing (2 maal) en met 400 ml pekel.
      10. Droog de organische laag metNa 2 SO 4 Filtreer de oplossing door katoen in een rondbodemkolf (tarra eerst) en damp aan droog onder verlaagde druk (roterende verdamper).
      11. Weeg de kolf en het verkrijgen van 61,4 g van een witte vaste stof.
        1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42-7,25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4,24-4,15 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,70-3,57 (m, 2H).
    2. Bereiding van benzyl-N - [(S) -1- (4-methoxyfenyl) -2-oxo-azetidine-3-yl] carbamaat.
      1. Ontbinden 58,6 g N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyfenyl) amino] -2-oxo-ethyl] carbamaat in 1,6 liter N, N-dimethylformamide.
      2. Koel de oplossing tot 0 ° C met een ijsbad.
      3. Voeg 50,6 g 1,1-sulfonyldiimidazole en roer met een magnetische bar voor 30 min.
      4. Koel de oplossingtot -20 ° C met een ijs / NaCl-bad en voeg 10,2 g natriumhydride (60% in minerale olie) in porties.
      5. Roer het mengsel bij -20 ° C gedurende 1 uur, en onder afkoelen met 2 ml methanol en 1 liter water.
      6. Vacuümfiltreer het neerslag, wassen met 200 ml water, en droog onder vacuüm.
      7. Het verkrijgen van 42,2 g van een witte vaste stof.
        1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d , 2H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 ​​(ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H) , 3,55 (dd, 1H, J = 5,6, 2,6 Hz).
    3. Bereiding van benzyl-N - [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat.
      1. Suspendeer 9,0 g benzyl-N - [(S) -1- (4-methoxyfenyl) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat in 500 ml acetonitril en 400 ml water.
      2. Koel de oplossing tot 0 ° C in een ijsbad.
      3. Voeg 45,4 g Ceric ammoniumnitraat portiegewijs in 45 minuten en roeren met een magneetstaaf bij 0 ° C gedurende 15 minuten.
      4. Voeg 500 ml van een verzadigde NaHCO3-oplossing voorzichtig, en voeg vervolgens 500 ml ethylacetaat.
      5. Filtreer het precipitaat en wassen met 200 ml ethylacetaat.
      6. Scheid de bifasische oplossing en was de waterlaag met 200 ml ethylacetaat (3 maal).
      7. Droog de organische laag met Na 2 SO 4, voeg 5 g actieve kool, filter door een laag diatomeeënsilica en damp tot droog onder verlaagde druk (roterende verdamper).
      8. Voeg diethylether en roeren met een spatel.
      9. Filtreer de vaste stof en het verkrijgen van 4,85 g van een gebroken-witte vaste stof.
        1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5,4, 2,7 Hz).
    4. Bereiding van [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] -ammonium acetaat.
      1. Ontbinden 0,93 ml azijnzuur in 245 ml ethylacetaat. Markeer dit als "trapping oplossing."
      2. Ontbinden 3,28 g benzyl-N - [(R) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat in 298 ml ethanol.
      3. Voeg 14,1 ml cyclohexadieen en 3,27 g 10% palladium op koolstof.
      4. Roer de suspensie bij kamertemperatuur gedurende 12 uur en vervolgens gefiltreerd door een kort kussen van diatomeeënaarde. Giet de eluerende vloeistof direct in de trapping oplossing.
      5. Verdamp het oplosmiddel onder verlaagde druk (roterende verdamper), waarbij de temperatuur onder 35 ° C.
      6. Vermaal de verkregen vaste stof met tetrahydrofuran en het verkrijgen van 1,72 g van een witte vaste stof.
        1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,68 (bs, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5,2, 2,4, 1,2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 5,2, 2,4 Hz), 1,90 (s, 3H).
  3. Bereiding van undec-10-ynyl- N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat
    1. In een 10 ml rondbodemkolf, los 60 mg [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetaat in 2 ml droge dichloormethaan.
    2. Koel de oplossing tot 0 ° C in een ijsbad en voeg 81 pl N, N- diisopropylethylamine druppelsgewijs.
    3. Oplossen 350 mg van het ruwe mengsel dat undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-carboxylaat in 2 ml droog dichloormethaan, toevoegen aan de oplossing en geroerd bij kamertemperatuur gedurende 15 uur. Damp het oplosmiddel tot droog onder verlaagde druk (roterende verdamper).
    4. Zuiver door middel van kolomchromatografie (silicagel) met behulp van een geautomatiseerde kolomchromatografie inrichting:
      1. Absorbeert het monster op silicagel, equilibreren van de kolom met cyclohexaan en plaats het monster in de patroon.
      2. Elueren met cyclohexaan / ethylacetaat 100: 0 tot 0: 100 en laat pieken op reageerbuizen.
      3. Verdamp het oplosmiddel van de fracties overeenkomend met de verbinding tot droog onder verlaagde druk (roterende verdamper) en het verkrijgen van 40 mg van een witte vaste stof.

2. Bereiding van CC reagentia

  1. Voorbereiding van 5 mM Stock oplossing van Tag-azide Molecules
    1. Los op 1,5 mg azide-PEG3-Fluor 545 in 0,5 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Voeg aliquots in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C.
    2. Los op 1,1 mg azide-PEG3-biotine in 0,5 ml DMSO. Voeg aliquots in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C.
  2. Bereiding van 50 mM voorraadoplossing van Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP)
    1. Los op 14,3 mg TCEP in 1 ml water, en maakt het fris elke keer.
  3. Bereiding van 50 mM oplossing van CuSO4 · 5H 2 O
    1. In een glazen flesje, oplossen 120,48 mg CuSO4 · 5H 2 O in 1 ml water. Bewaren bij kamertemperatuur gedurende maximaal één maand.
  4. Bereiding van 83,5 mM voorraadoplossing Tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazool-4-yl) methyl] amine (TBTA)
    1. In een glazen flesje, los 8,85 mg TBTA in 200 ul DMSO. Bewaren bij kamertemperatuur gedurende maximaal één maand.
  5. Bereiding van 1,7 mm Working Solution van TBTA (direct voor gebruik)
    1. Voeg 20 ul van 83,5 mM TBTA een glazen flesje en verdun met 180 ml van DMSO.
    2. Voeg 800 ul van tert-Butanol en vortex.

3. NAAA expressie analyse in Paw Tissue van CFA-behandelde ratten

LET OP: Gebruik mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 175-200 g, en het uitvoeren van alle procedures in overeenstemming met de richtlijnen voor ethisch gebruik van dieren. Huis ratten in geventileerde kooien op een 12-uur licht / donker-cyclus en geef ze vrije toegang tot voedsel en water. Voor het protocol van CFEen behandeling verwezen naar de gepubliceerd door Bonezzi et al. 29 Gebruik dieren 7 dagen na toediening CFA artikel.

  1. Intraveneuze toediening van ARN14686
    1. ARN14686 oplossen in het voertuig (15% PEG en 15% Tween-zoutoplossing). Bereken de oplossing concentratie overeenkomstig rat gewicht (dosis 3 mg / kg, injectievolume 5 ml / kg).
    2. Ga verder met iv injecties in drie naïeve en drie CFA-behandelde ratten. Plaats elke rat in een geschikte plastic terughoudendheid apparaat. Plaats vervolgens de staart rat in warm water voor 2-4 minuten tot vaatverwijding mogelijk te maken, en injecteer de verbinding iv via de staartader.
    3. Injecteren drie ratten (naïef en CFA-behandelde) iv met enige voertuig.
  2. Paw Collection en Dissection
    1. Offer de ratten door CO 2 inhalatie 4 uur na toediening probe of voertuig en het verzamelen van hun poten door te snijden 0,5 cm boven het kniegewricht met behulp van een scalpel.
    2. Verwijder voorzichtig de huid door-schaar bijgestaan ​​dissectie en ontleden zachte weefsels door ze te schrapen van het bot. Gooi de botten en het verzamelen van de zachte weefsels van de poten. Snap freeze monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.
  3. Paw homogenisering en lysosomale Eiwit Voorbereiding
    LET OP: Vermijd het gebruik van detergenten en amine bevattende buffers, zoals ze de CC reactie kan remmen.
    1. Combineer poot weefsel van 3 ratten (verkregen zoals beschreven in paragraaf 3.2.1) en homogeniseer ze in 4 ml van 320 mM sucrose in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) en een cocktail van proteaseremmers (zie / reagens tabel); gebruik maken van een high-performance verspreidende instrument (zie Materiaal / reagens Table).
    2. Centrifugeer de weefselhomogenaat gedurende 20 minuten bij 1000 xg bij 4 ° C; sla het supernatant.
    3. Voeg 2 ml van 320 mM sucrose in PBS en de proteaseremmer cocktail aan het weefsel pelletmeng opnieuw.
    4. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1000 xg bij 4 ° C en voeg het supernatant aan die uit stap 3.3.2.
    5. Centrifugeer de supernatanten verzameld gedurende 30 min bij 12.000 xg bij 4 ° C.
    6. Weeg de pellet en resuspendeer in twee volumina PBS (dwz 200 pi per 100 mg tablet). Verwijzing naar een 1,5 ml verzamelbuis en invriezen bij -80 ° C gedurende 1 uur.
    7. Ontdooi de monsters en opnieuw bevriezen 1 uur bij -80 ° C.
    8. Herhaal het bevriezen / ontdooien cyclus twee keer.
      LET OP: Deze stap is bedoeld om het eiwit oplosbaar. Bevriezen 's nachts indien nodig.
    9. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 xg bij 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof, die oplosbaar zijn lysosomale eiwitten bevat, en gooi de pellet. Bewaar bij -80 ° C of onmiddellijk doorgaan met eiwit kwantificering.
    10. Kwantificeren het eiwitgehalte met behulp van een BCA proteïne test 30 commerciële kit (zie Materiaal / reagens Table ), volgens de instructies van de fabrikant.
    11. Bewaar de monsters bij -80 ° C tot gebruik.
  4. CC met azide-PEG3-biotine
    LET OP: Het protocol van CC en streptavidine kraal verrijking (stappen 3,4-3,6) zijn enigszins gewijzigd ten opzichte van de uitgave van Speers en Cravatt 31 protocol.
    1. Bereid 500 pl (1 mg / ml in PBS) van lysosomale eiwitten van probe- en met hulpmiddel behandelde ratten (naïef en CFA-behandelde ratten).
    2. Preclear monsters met 40 pi van een 50% suspensie van streptavidine agarose (Was driemaal met 1 ml PBS vóór gebruik) gedurende 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer 4 min bij 1000 xg bij 4 ° C en neem de supernatant.
    3. Voeg 11,3 ul van een 5 mM voorraad van azide-PEG3-biotine en vortex.
    4. Voeg 11,3 ul van een 50 mM voorraad van vers bereide TCEP en vortex.
    5. Premix 34 ul van een vers bereide werkoplossing van 1,7 mM TBTA met 11,3 ui van een 50 mM CuSO4 · 5H 2 O voorraad.
    6. Voeg 45,3 ml van een gerede TBTA / CuSO4 · 5H 2 O-oplossing en vortex.
    7. Incubeer de reactie bij 25 ° C gedurende 2 uur (een langere incubatietijd laat de reactie). Observeer eiwit neerslag bij deze stap. Meng na het eerste uur van de incubatie.
  5. Verwijdering van Excess CC reagentia
    1. Centrifugeer de monsters gedurende 4 minuten bij 6500 xg bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
    2. Voeg 750 ul van koude methanol en resuspendeer door sonicatie (5 sec met een sonde ultrasoonapparaat).
    3. Centrifugeer de monsters gedurende 4 minuten bij 6500 xg bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof met een injectiespuit en naald.
    4. Herhaal stap 3.5.2 tweemaal (sonicatie is niet nodig).
    5. Na de laatste wasbeurt, voeg 325 ul van natriumdodecylsulfaat (SDS) 2,5% in PBS om het eiwit pellet ultrasone trillingen 3x gedurende 5 sec.
    6. Verwarm de monsters gedurende 5 minuten bij 65 ° C en een ultrasone trillingenkrijgen.
    7. Centrifugeer 5 min bij 6500 xg bij kamertemperatuur en bewaar het supernatant.
    8. Voeg 1,4 ml PBS aan de SDS te verdunnen tot 0,5%. Bewaren bij -20 ° C of doorgaan met streptavidine verrijking.
  6. streptavidine Enrichment
    1. Met PBS, breng het volume van het product verkregen in stap 3.5.8 tot 4,2 ml monsters. Voeg 40 ul van een 50% suspensie van streptavidine agarose met een cut-end tip (Was driemaal met 1 ml PBS vóór gebruik).
    2. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder rotatie en centrifugeer gedurende 2 min bij 1400 x g.
    3. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder het drogen van de korrels pelleteren en gebruik overblijvende supernatant aan de korrels dragen aan een 1 ml Spin Column (zie / reagens tabel).
    4. Wassen zwaartekracht met 3x 1 ml 1% SDS (in PBS), 3 x 1 ml 6 M ureum (in PBS), en 4x 1 ml PBS.
    5. Gebruik 2x 500 pl PBS om de kralen overdracht naar een 1,5 ml buis en centrifugeer gedurende 2 min bij 1400 xg bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant met een spuit en naald.
    6. Elueer de hars gebonden eiwitten door toevoeging van 25 ui elutiebuffer (6 M ureum, 2 M thioureum, 2% SDS, en 6 mM biotine, alle in PBS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door 15 min bij 95 ° C 32.
  7. eiwit Blot
    1. Voeg 5 ul van 6x Laemmli buffer (9 ml: 0,5 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 5 ml 20% SDS, 5 mg broomfenolblauw, 3 ml glycerol en H 2 O tot 9 ml) en voeg 5% β-mercaptoethanol onmiddellijk voor gebruik. Kort Centrifugeer de monsters bij 2000 xg om het hars en de belasting 25 ul van de supernatant verkregen pellet in een 4-12% polyacrylamide gel.
    2. Voeren gelelektroforese en eiwit overdracht op een blotting membraan volgens de instructies van de fabrikant 33.
    3. Verzadigen blotting membraan gedurende 1 uur met 10 ml van een blokkerende buffer (zie / reagens tabel) dat 0,1% Tween-20.Gebruik geen melk, omdat de achtergrond kan verhogen.
    4. Was het membraan met 10 ml 0,05% Tween-20 in PBS en voeg 10 ul van fluorescent streptavidine (zie / reagens Table) opgelost in 10 ml blokkerende buffer plus 0,1% Tween-20 gedurende 1 uur bij KT.
    5. Was 4 keer met 0,05% Tween-20 in PBS en eenmaal met PBS alleen (10 min elk).
    6. Gebruik een afbeelding scanner (zie Materiaal / reagens Table). Schakel het instrument en de aangesloten computer. Wacht tot er klaar voor.
    7. Start de acquisitie programma en selecteer de fluorescentie-modus. Selecteer het membraanoppervlak en kies de doelmap voor opgeslagen bestanden.
    8. Stel de volgende verwervingsparameters: 680 nm excitatie lengte BPFR700 filter, 1000 V fotomultiplicatorbuis (PMT) waarde (kanaal 2), en 25 urn pixelgrootte. Het verwerven van de afbeelding.

4. Lokalisatie van katalytisch actieve NAAA in Muis Lungs door Fluorescentie Microskopiëren

LET OP: Gebruik male 8 tot 10 weken oude muizen en voer alle procedures in overeenstemming met de richtlijnen voor de ethische gebruik van dieren. Huis muizen in geventileerde kooien op een 12 uur licht / donker-cyclus en geef ze vrije toegang tot voedsel en water.

  1. Intraveneuze toediening van ARN14686 in Muizen
    1. Ontbinden ARN14686 in het voertuig: 15% PEG en 15% Tween-20 zoutoplossing. Bereken de oplossing concentratie overeenkomstig muisgewicht (dosis 3 mg / kg, injectievolume 5 ml / kg).
    2. Ga verder met de iv injectie van 3 muizen. Plaats elke muis in een geschikte plastic terughoudendheid apparaat. Plaats vervolgens de staart muis in warm water voor 2-4 minuten tot vaatverwijding mogelijk te maken en te injecteren de verbinding iv via de staartader.
    3. Injecteren 3 muizen iv met enige voertuig.
  2. Lung Collection en Slice Voorbereiding
    Waarschuwing: Behandel paraformaldehyde met zorg in een zuurkast, en draag handschoenen!
    1. Verdoven muizen met chloral hydraat (400 mg / kg). Bevestig anesthesie met een teen knijpen. Voer een transcardial perfusie als volgt:
      1. Oppervlakkig snijd de ventrale huid met een schaar en bloot de borstkas en peritoneale membraanoppervlakken.
      2. Oppervlakkig stuurde de peritoneale membraan met een schaar, net onder de xyphoid proces en bloot het middenrif en viscerale organen. Wees voorzichtig geen significante vaatstelsel niet te verscheuren.
      3. Open de borstholte door het snijden van het membraan van de ene laterale zijde naar de andere.
      4. Steek de 25 G naald verbonden met het geautomatiseerde spuitpomp en trekken 20 ml 0,9% zoutoplossing, gevolgd door 60 ml van 4% PFA in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,4).
    2. Zodra de perfusie is voltooid, trekt het hart met behulp van een tang en zorgvuldig ontleden het uit. Pak de trachea met een tang en snijd volledig door gebruik van een schaar. Trek voorzichtig de luchtpijp naar boven en verwijder de longen van de ribbenkast. Ontleden het weefselscheiden de rechterlong van links.
    3. Postfix het weefsel in 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur, bevriezen monsters koude 2-methylbutaan, en bewaar ze bij -80 ° C.
    4. Verzamel 40 urn secties met een cryostaat, zet onmiddellijk op objectglaasjes (één per vijfde) en verwerken voor immunohistochemie zoals hieronder beschreven.
  3. Tissue Slices Permeabilisatie en blokkeren
    1. Was met PBS (2 x 5 min) en doorlaatbaar met 0,1% Triton X-100 PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Was met PBS (2 x 5 min) en geblokkeerd met 3% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Was met PBS (2x 5 min) en ga verder met CC.
  4. CC met azide-PEG3-Fluor 545 op Tissue Slices
    1. Bereid een oplossing door het mengen van de CC reagentia bereid zoals beschreven in hoofdstuk 2. 1 ml oplossing toe: 2 pl azide-PEG3-Fluor 545 (5 mM stock), 20 gl TCEP (vers bereide 50 mM stock), 58,8 pl TBTA (vers bereide 1,7 mM werkoplossing), 20 gl CuSO4 · 5H 2 O (50 mM voorraadoplossing), en 900 pl PBS.
    2. Voeg ongeveer 400 pi CC mix de weefselcoupes, die werden bereid volgens paragraaf 4.2. Let erop dat de gewenste hoeveelheid CC mengsel voldoende is om de plakken te dekken. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
    3. Was met PBS (1x gedurende 5 min), koude methanol (1 x gedurende 5 min) werd een oplossing van 1% Tween-20 en 0,5 mM EDTA in PBS (3 x 2 min), en PBS (1x gedurende 5 min).
    4. Air droog is, voeg een druppel antifade inbedmiddel met DAPI (zie Materiaal / Reagent Table), in de buurt met dekglaasjes (het vermijden van belvorming), en afdichting met polish. Bewaren bij 4 ° C tot analyse.
  5. Afbeeldingen verwerving
    1. Gebruik een confocale microscoop uitgerust met een 546 nm en 450 nm excitatie lasers (zie Materiaal / reagens Table) volgendede handleiding.
    2. Selecteer een 60X objectief met NA = 1,40, en zorg ervoor dat de dia een voorbeeld door de oculairs en te focussen op een gebied van belang.
    3. Bepaal de verwervingsparameters volgens het monster en materiaal eigenschappen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

ARN14686 is gemaakt op basis van de steiger van de NAAA inhibitor ARN726. De 4-butyl- cyclohexyl groep ARN726 werd gesubstitueerd met een C9 verzadigde alifatische keten die van een tag terminale alkyn (figuur 1). Het alkyn tag werd ingevoerd om het gebruik van een labelingsprocedure twee stappen laten een fluorofoor of biotine molecuul via CC voegen. Deze functie maakt ARN14686 een zeer veelzijdig instrument om NAAA onderzoeken in vitro en in vivo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Enzymactiviteit fijn gereguleerd op verschillende niveaus, zoals RNA transcriptie, eiwitsynthese, eiwittranslocatie, post-translationele modificatie en eiwit-eiwit interactie. Vaak enzymexpressie alleen houdt geen rekening met de activiteiten. ABPP werd ontwikkeld om de activiteit van eiwitten te bestuderen in hun natieve toestand. Twee functies nodig: een chemische probe die covalent bindt aan de actieve plaats van een enzym van belang en een reporter tag aan de probe gelabeld enzym detecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken het Nikon Imaging Center bij Istituto Italiano di Tecnologia, Genua, Italië (NIC@IIT).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,1’-sulfonyldiimidazole Sigma Aldrich367818Schadelijk
2-dipyridylcarbonateFluorochem11331Schadelijk
2-MethylbutanSigma AldrichM32631Ontvlambaar, giftig, gevaarlijk voor het aquatisch milieu
4-(Dimethylamino)pyridineSigma Aldrich107700Giftig
AzijnzuurSigma Aldrich695092Ontvlambaar, corrosief
Acetonitrile Sigma Aldrich34998Ontvlambaar, giftig
Geactiveerde houtskoolSigma Aldrich161551
AmmoniumchlorideSigma AldrichA9434Schadelijk
Azide-PEG3-BiotinJena BiosciencesCLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545Jena BiosciencesCLK-AZ109
BCA-eiwitassaykitThermo Fisher Scientific23227
Bio-spin kolommenBiorad732-6204
BiotineSigma AldrichB4501
BlokbufferLi-Cor Biosciences927-40000
β-mercaptoethanolSigma AldrichM6250Zeer giftig
Rundserumalbumine (BSA)Sigma AldrichA7030
BroomfenolblauwSigma AldrichB0126
Bruker Avance III 400Bruker
CeliteSigma Aldrich419931Gezondheidsrisico
Ceriumammoniumnitraat Sigma Aldrich22249Oxderend, schadelijk
ChloraalhydraatSigma AldrichC8383Zeer giftig
CuSO4.5H2O Sigma Aldrich209198Giftig
CyclohexadieenSigma Aldrich125415Ontvlambaar, gezondheidsrisico
CyclohexaanSigma Aldrich34855Ontvlambaar, schadelijk, gezondheidsrisico, milieurisico
DichloormethaanSigma Aldrich34856Schadelijk, gezondheidsrisico
Di-ethyletherSigma Aldrich296082Ontvlambaar, schadelijk
Dimethylsulfoxide (DMSO)Acros Organics348441000
Dimethylsulfoxide d6 (DMSO-d6)Sigma Aldrich175943
EthanolSigma Aldrich2860Ontvlambaar, schadelijk
EthylacetaatSigma Aldrich34858Ontvlambaar, schadelijk
GlycerolSigma AldrichG5516
Irdye 680-LT StreptavidineLi-Cor Biosciences925-68031
IRDye680-LT Streptavidine Licor925-68031Kort centrifugeren voor gebruik om eiwitcomplexen te laten bezinken
MethanolSigma Aldrich34966Zeer giftig
MethanolSigma Aldrich34860Ontvlambaar, giftig, gezondheidsrisico
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma AldrichE7750Schadelijk, corrosief
N,N-diisopropylethylamineSigma AldrichD125806Ontvlambaar, corrosief, giftig
N,N-dimethylformamideSigma Aldrich227056Ontvlambaar, schadelijk, gezondheidsrisico
N-Cbz-L-SerineFluorochemM03053Schadelijk
Nikon A1 confocale microscopieNikonLees de gebruiksaanwijzing
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gelThermo Fisher ScientificNP0335BOX
Palladium op koolstofSigma Aldrich330108
p-anisidineSigma AldrichA88255Giftig, gezondheidsrisico, milieurisico
Paraformaldehydesigma Aldrich441244Giftig, schadelijk voor de luchtwegen, corrosief, ontvlambaar
Poly(ethyleenglycol) Sigma AldrichP3265
ProLong Gold antifade-medium met DAPI Thermo Fisher ScientificP36931Voorkom vorming van luchtbellen
Protease-remmercocktailSigma AldrichP8340
NatriumbicarbonaatSigma AldrichS6014
Natriumdodecylsulfaat (SDS) Sigma AldrichL3771Giftig, corrosief, ontvlambaar
Natriumhydride Sigma Aldrich452912Ontvlambaar
NatriumsulfaatSigma Aldrich239313
Starion FLA-9000 beeldscannerFUJIFILMLees  de gebruiksaanwijzing
Streptavidine-agaroseThermo Fisher Scientific20349
SucroseSigma AldrichS7903
Tert-butanolSigma Aldrich360538Giftig, ontvlambaar
TetrahydrofuraanSigma Aldrich186562Ontvlambaar, schadelijk, gezondheidsrisico
ThioureumAcros Organics424542500Giftig, verwarmen op 50 °C om op te lossen
TrisSigma AldrichRDD008
Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP)Sigma AldrichC4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)Sigma Aldrich

Referenties

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Click chemieprotein blotfluorescentiemicroscopiestreptavidine verrijkingweefselsnijjesenzymactivatieknaagdierweefselsprobesynthese
voorbereiding en
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.