G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Samenvatting

Eenvoudige methoden om de selectieve activering van G-eiwitten door G-eiwit-gekoppelde receptoren te detecteren, blijven een grote uitdaging in celsignalering. Hiervoor zijn Fӧrster resonantie-energieoverdracht (FRET) biosensoren ontwikkeld door een GPCR paarsgewijs vast te maken aan G-eiwitpeptiden om conformationele veranderingen te onderzoeken bij gecontroleerde concentraties in levende cellen.

Samenvatting

Fӧrster resonantie energie-overdracht (FRET) -gebaseerde studies hebben in het onderzoek van GPCR signalering steeds vaker voor. Onze onderzoeksgroep ontwikkelde een intramoleculaire FRET sensor om de interactie tussen Ga subeenheden en GPCRs in levende cellen na agonist stimulatie detecteren. Hier hebben we gedetailleerd protocol voor het detecteren van veranderingen in FRET tussen de β ₂ adrenerge receptor en Gαs C-terminus peptide na behandeling met 100 uM isoproterenol hydrochloride zoals eerder gekarakteriseerde ^1. Onze FRET sensor is een polypeptide bestaande serie van een full-length GPCR, een FRET acceptor fluorofoor (mCitrine), een ER / K SPASM (systematische eiwitaffiniteit sterkte modulatie) linker, een FRET donor fluorofoor (mCerulean) en een Ga-C terminale peptide. Dit protocol zal detail celpreparaat, transfectie voorwaarden, installeren van apparatuur, uitvoering assay, en data-analyse. Deze experimentele ontwerp detecteert kleine langes FRET indicatief voor eiwit-eiwit interacties, en kan ook worden gebruikt om de sterkte van de interactie tussen de liganden en GPCR-G-eiwit paringen vergelijken. Om de signaal-ruis in onze metingen verbeteren, dit protocol vereist verhoogde precisie in alle stappen, en wordt hier gepresenteerd om reproduceerbare uitvoering mogelijk.

Inleiding

G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn zeven-transmembraan receptoren. Het menselijk genoom alleen bevat ongeveer 800 genen die coderen voor GPCR's, die worden geactiveerd door een verscheidenheid aan liganden, waaronder licht, geurstoffen, hormonen, peptiden, geneesmiddelen en andere kleine moleculen. Bijna 30% van alle geneesmiddelen die momenteel op de doelmarkt GPCR's, omdat ze spelen een grote rol in vele ziekten ^2. Ondanks tientallen jaren van uitgebreid werk aan deze receptor familie, blijven er belangrijke onopgeloste vraagstukken in het veld, in het bijzonder met betrekking tot de moleculaire mechanismen die GPCR-effector interacties rijden. Tot op heden heeft slechts één hoge-resolutie kristalstructuur gepubliceerd, die inzicht geven in de wisselwerking tussen de β _2-adrenerge receptor (β _2-AR) en de Gs eiwit ^3. Samen met een uitgebreid onderzoek in de afgelopen drie decennia, herhaalt hij een specifieke structurele component die is van cruciaal belang in dezeinteractie: de Ga subeenheid C-terminus. Deze structuur is zowel voor G-eiwit activatie van de GPCR ⁴ en G-eiwit selectie ^5-6. Vandaar dat de Ga-C-uiteinde heeft een cruciale schakel tussen ligand stimulatie van GPCR en selectieve G-eiwit activatie.

Onderzoek in de afgelopen tien jaar blijkt dat GPCRs bevolken een brede conformatie landschap, met een ligand-bindend stabiliserende subsets van GPCR conformaties. Hoewel verschillende technieken, waaronder kristallografie, NMR en fluorescentiespectroscopie en massaspectrometrie zijn beschikbaar om de GPCR conformationele landschap besproken, is er een gebrek aan benaderingen hun functionele betekenis effector selectie ⁷ helderen. Hier schetsen we een Fӧrster resonantie energie-overdracht (FRET) -gebaseerde aanpak van de G-eiwit-selectieve GPCR conformaties te detecteren. FRET steunt op de afstand en de parallelle oriëntatie van de twee fluoroforen met overlappende emissie (donor) eennd excitatie (acceptor) spectra ^8. Als de donor en acceptor fluoroforen dichter bij elkaar als gevolg van hetzij conformationele verandering in het eiwit of eiwit-eiwit interactie komen, de FRET hiertussen oplopen en kan worden gemeten met behulp van diverse methoden ^8. FRET gebaseerde biosensoren zijn uitgebreid tewerkgesteld GPCR ^9. Ze werden gebruikt om veranderingen in de conformatie GPCR sonde door het invoegen van donor en acceptor in de derde intracellulaire lus en C-terminus GPCR; sensoren zijn ontworpen sonderen GPCR en effector interacties door het afzonderlijk labelen van de GPCR en effector (G-eiwit subeenheden / arrestins) met een FRET paar ^10; aantal sensoren ook detecteren conformatieveranderingen in het G-eiwit ^11. Deze biosensoren hebben het veld nodig om een veelheid aan onopgeloste kwesties, waaronder conformationele veranderingen in de GPCR en effector, GPCR-effector interactie kinetiek en allosterische liganden ¹² vragen. Onze groepwas vooral geïnteresseerd in het creëren van een biosensor die G-eiwit-specifieke GPCR conformaties onder-agonist gedreven omstandigheden kon ontdekken. Deze biosensor gebaseerd op een recent ontwikkelde techniek genaamd SPASM (systematische eiwitaffiniteit sterkte modulatie) ^13. SPASM omvat tethering interactie eiwitdomeinen met een ER / K linker, die de effectieve concentratie regelt. Weerszijden van de linker met een FRET paar fluoroforen wordt een instrument waarin de stand van de interactie tussen eiwitten ¹² kunnen melden. Eerder ¹ de SPASM module werd gebruikt om de Ga-C-terminus tether een GPCR en bewaken hun interacties met FRET fluoroforen, mCitrine (in dit protocol ingeleid door de algemeen bekende variant, geel fluorescent eiwit (YFP), excitatie- / emissie piek 490/525 nm) en mCerulean, excitatie / emissie piek 430/475 nm) (als bedoeld in dit protocol door zijn algemeen bekend variant Cyaan Fluorescent Protein (GVB genoemd). Van N- naar C-terminus, tzijn genetisch gecodeerde enkele polypeptide bevat: een volledige lengte GPCR, FRET acceptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker FRET donor (mCerulean / CFP), en de Ga-C-terminus peptide. In deze studie worden sensoren afgekort als GPCR-linkerlengte-Ga-peptide. Alle componenten worden gescheiden door een niet gestructureerde (Gly-Ser-Gly) ₄ verbindingsstuk dat vrije rotatie van elk gebied stelt. De gedetailleerde karakterisering van dergelijke sensoren is eerder uitgevoerd met behulp van twee prototypische GPCRs: β ₂ AR en opsin ^1.

Deze sensor wordt transiënt getransfecteerd in HEK-293T-cellen en fluorometer gebaseerde live cell experimenten meten fluorescentie spectra van het FRET paar op willekeurige eenheden van counts per seconde (CPS) in aanwezigheid of afwezigheid van ligand. Deze metingen worden gebruikt om een FRET verhouding tussen de fluoroforen (YFP _max / CFP _max) te berekenen. Een verandering in FRET (ΔFRET) wordt dan berekend door de gemiddelde verhouding FRETonbehandelde monsters van de FRET verhouding van ligand behandelde monsters. ΔFRET vergelijkbaar in constructen (β ₂ AR-10 nm-Gαs peptide versus _ß2-AR-10 nm-geen peptide). Hier hebben we detail het protocol bij deze sensoren in levende HEK-293T-cellen te uiten, hun expressie te controleren, en de opzet, uitvoering en analyse van de fluorometer gebaseerde levende cellen FRET-meting voor onbehandeld versus geneesmiddel behandelde omstandigheden. Hoewel dit protocol is specifiek voor het β ₂ AR-10 nm-Gαs peptide sensor behandeld met 100 uM isoproterenol bitartraat, kan worden geoptimaliseerd voor verschillende GPCR-Ga-paren en liganden.

Protocol

1. DNA Voorbereiding

1. Ontwerp sensor bouwt met behulp van een modulaire klonen regeling. Gelieve te verwijzen naar de β ₂ AR sensor ontwerp eerder ¹ gedetailleerd.
2. Bereid DNA volgens commerciële miniprep kit protocol en elueren in 2 mM Tris-HCl, pH 8, in een concentratie ≥ 750 ng / ul, _A260 / _A280 van 1,7-1,9, A ₂₆₀ / A ₂₃₀ van 2,0-2,29.

2. Cell Culture Voorbereiding

1. Cultuur HEK-293T-Flp-n-cellen in DMEM bevattende 4,5 g / l D-glucose, aangevuld met 10% FBS (warmte geïnactiveerd) (v / v), 1% L-glutamine supplement, 20 mM HEPES, pH 7,5 bij 37 ° C in bevochtigde atmosfeer van _5% CO2. Behandel cellen in biologische veiligheid kap voor vervolgstappen.
2. Sta cellen groeien tot een confluente monolaag voordat passage in zes putjes. Tijd om confluentie te bereiken, hangt af van de eerste plating dichtheid. Gebruik platen diekomen tot samenvloeiing binnen 1-2 dagen in de platen zes-well platen. Een confluente 10 cm weefselkweek-behandeld schotel heeft celdichtheid van ongeveer 4 x 10 ⁶ cellen / ml. Zie figuur 1 voor het van celkweek groei.
3. Was de cellen met 10 ml PBS, en trypsinize met 0,25% trypsine (zie Discussie, paragraaf 2). Plaat 8 x 10 ⁵ cellen / putje in 2 ml medium in weefselkweek behandelde zes putjes en laat zich voor 16 - 20 uur.

3. Transfectie Voorwaarden

1. Wankelen transfecties voor constructies die verschillende bedragen van de tijd nodig om optimale expressie te bereiken (tussen 20-36 uur). Synchroniseer voorwaarden voor een uniforme experiment tijd. ook een ongetransfecteerde controlewell onder gelijkwaardige celdichtheid te worden gebruikt voor achtergrondruis en verstrooiing aftrekken tijdens de analyse.
2. Breng transfectie reagentia op kamertemperatuur: verminderde serum media, DNA, transfectie reagens.
3. In eenbiologische beschermkap combineren reagentia in een steriele microcentrifugebuis in deze volgorde: meng 2 ug DNA met 100 ul gereduceerd serum medium. Spike 6 ul van transfectiereagens in media / DNA mix zonder het aanraken van het oppervlak van het mengsel of de zijkant van de buis. Opzetten van een reactie transfectie per putje. Transfectie omstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd (1-4 ug DNA, 3-6 pl transfectiereagens) vaste expressieniveaus te bereiken. Zie tabel 1 voor meer optimale verhoudingen.
4. Incubeer mengsel bij KT in biologische veiligheid kap voor 15-30 min. Gebruik geen reactie als links incuberen meer dan 30 min.
5. reactie op cellen in een druppelsgewijze manier toe te voegen heel goed en schud zes goed om grondig mengen te garanderen. Voeg één reactie per well.
6. Na 20 uur van meningsuiting, de monitor fluorescentie met behulp van weefselkweek fluorescentiemicroscoop. Beoordelen van de bevolking expressie met 10x objectief en eiwit lokalisatie in een cel op 40x. Observe voor eiwitexpressie bij plasmamembraan (PM). Als er geen wezenlijke internalisatie wordt opgemerkt, bewaken transfectie tot een significante expressie wordt gedetecteerd bij PM.

4. reagentia en apparatuur voorbereiding

1. Bereid 100 mM drug voorraden en bewaar bij -80 ° C: isoproterenol bitartraat (100 mM in dH ₂ O bevattende 300 mM ascorbinezuur). Maak op ijs / in koude kamer, en flash-vries onmiddellijk. Monsters kunnen worden gemaakt en gebruikt worden tot één jaar.
2. Bereid Cell Buffer (~ 2 ml / conditie) en op te slaan in een 37 ° C waterbad. Maak fris elke dag. Referentie tabel 2 voor Cell Buffer bestanddelen.
3. Bereid Drug buffer (10 ml) en bij kamertemperatuur geroerd. Referentie tabel 2 voor Drug Buffer bestanddelen.
4. Zuur wassen cuvetten met geconcentreerd HCl. Neutraliseren met een zwakke basis (1 M KOH), en grondig cuvettes met dH ₂ O.
5. Bereid werkplek rond fluorometer met een aantaldozen van 10, 200 en 1000 ui pipet tips, een timer in te stellen met een 10 min countdown, een toegankelijke vacuüm lijn met tips voor cuvette reinigen, delicate taak doekjes, en spuit fles met ultrapuur H ₂ O.
6. Verhit externe waterbad fluorometer en warmte blok naar 37 ° C.
7. Schakel fluorometer; set fluorescentie collectie programma voor het GVB-collectie tot 430 nm, bandpass 8 nm excitatie; emissie van 450 nm - 600 nm, bandpass 4 nm. Voor YFP collectie als sensorregeling (zie Discussie) set excitatie tot 490 nm, bandpass 8 nm, emissie range 500-600 nm, bandpass 4 nm. CFP verzameling instellingen worden gebruikt om een ​​FRET spectrum in dit experiment krijgen.
8. Plaats twaalf 1,5 ml microcentrifugebuizen in verwarmingsblok zoals weergegeven in figuur 2 hieronder. Deze buizen zijn houders voor cel hoeveelheid tubes (500 pl microcentrifugebuizen.) Plaats een klein stukje weefsel in de houders 1 en 7 van de cuvettes hier geplaatst vangen.
   Opmerking: Gebruik aparte cuvetten voor onbehandelde aandoening en geneesmiddel voorwaarde om kruisbesmetting te voorkomen.

Figuur 2. microcentrifugebuis Set Up en Position Reference in Heat Block Cuvette voor onbehandelde monsters in de stand. 1; cel aliquot buizen zijn op posities 2 - 6. cuvette geneesmiddel behandelde monsters in positie 7; cel hoeveelheid buizen zijn in de posities 8 - 12. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

9. Vul houders 2-6 en 8-12 met ~ 750 ul water om een ​​mini 37 ° C waterbad maken.
10. Plaats tien 500 pl microcentrifugebuizen voor mobiele fracties in mini-waterbaden (houders 2-6, 8-12). Elke buis wordt een individuele herhaling van de aandoening (5 untreated, 5 geneesmiddel behandelde).
11. Monitor cellen voor expressie (zie stap 3.6).

5. Experiment & Data Collection

Figuur 3. Experimentele Schematische. Een gedetailleerde stapsgewijze handleiding voor experimentele opstelling en uitvoering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Referentie Figuur 3 voor experimentele schema. Wanneer cellen zijn klaar om geoogst te worden, op basis van eiwit expressie gedetecteerd met fluorescentie microscoop (zie Discussie, paragraaf 4): in biologische veiligheid kap, verwijder voorzichtig ~ 1 ml media, resuspendeer cellen in hun cultuur met een P1,000 en overdragen resuspensie in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
   Opmerking: Gebruik trypsine zoals de N-terminus kunnen verteren en /of binding zak van de GPCR sensor.
2. Aantal cellen de juiste celdichtheid in resuspensie waarborgen. Optimaliseren resuspensie volume 4 x 10 ⁶ cellen / ml.
3. Spin cellen in swinging bucket centrifuge bij kamertemperatuur 290 g gedurende 3 min. Verwijder supernatant na centrifugeren.
4. ZACHT resuspendeer cellen in 1 ml celbuffer (bewaard bij 37 ° C) en herhaal stap 5,3. Tijdens de tweede rotatie, het verzamelen van 100 mM drug voorraad hoeveelheid van -80 ° C. Maak 1: 100 verdunning in Drug buffer voor 1mM werkvoorraad en houden bij RT.
5. Na de tweede centrifugering verwijderd supernatant en voorzichtig resuspendeer cellen in 1 ml celbuffer (4 x 10 ⁶ cellen / ml). Maat OD ₆₀₀ van het monster in de spectrofotometer 1 ml cellen en 1 ml celbuffer als blanco. Verdeel cellen in een wegwerp plastic cuvet en transfer terug naar een microcentrifugebuis onmiddellijk na spectrofotometrie.
6. Voor een controle ongetransfecteerde cell voorwaarde spectrum, zacht resuspendeer ongetransfecteerde cellen in 1 ml Cell Buffer met P1,000 pipet, voeg 90 ul van cellen aan de cuvet en het verwerven van FRET spectrum bij excitatie 430 nm, bandpass 8 nm, emissie 450-600 nm, bandpass 4 nm. Verzamel 3-5 repeat spectra met verse 90 ul van cellen. Houd voorraad van de cellen bij 37 ° C tussen de specs, mengen voorzichtig met P1,000 tussen elk monster portie, en spoel cuvette met ultrapuur H ₂ O tussen de monsters.
7. Voor experimentele omstandigheden aliquot 90 ul van getransfecteerde cellen voor elk van de 500 pi buizen in houders 2-6, 8-12 in het verwarmingsblok. Voorzichtig resuspendeer voorraad van cellen met P1,000 pipet tussen elke portie.
8. Na de cellen zijn in porties verdeeld, voeg 10 ul van Drug Buffer buizen 2-6 voor onbehandelde aandoening monsters.
9. Begin experiment door het toevoegen van 10 pi van 1 mM oplossing van geneesmiddel in de buis 8, start de timer aftellen van 10 min en meng buis met P200 pipet. Sluit de buis en terug te keren naar 37° C warmte-blok.
10. Onmiddellijk pick-up buis 2, meng voorzichtig met P200 (gebruik een nieuwe tip), voeg 90 ul van celsuspensie onbehandelde toestand cuvette, en plaats in de fluorometer.
11. Acquire FRET spectrum bij excitatie 430 nm, bandpass 8 nm, emissie 450-600 nm, bandpass 4 nm.
12. Op 9 min - 10 sec, spike buis 9 met 10 ui 1 mM drug oplossing, meng met een P200 (gebruik nieuwe tip), en terug te keren naar de buis blok te verwarmen.
13. Herhaal stap 5,10-5,11 met buis 3 en 5.12 met buis 10.
14. Herhaal stap 5,10-5,13 op 1 min intervallen (08:10, 07:10, etc.) totdat spectra worden verzameld voor alle onbehandelde conditie samples, en drug is toegevoegd aan alle drug conditie monsters. Gebruik een nieuwe tip voor elke pipet stap om kruisbesmetting te voorkomen.
15. Op 5 min - 10 sec, beginnen mengpijp 8 (drug conditie) voorzichtig met P200 pipet, voeg 90 ul van celsuspensie afzonderlijke cuvette voor drug behandelde monster en plaats in de fluorometer.
16. verwerven FRET spectrum (zie stap 5.11 voor instellingen).
17. Herhaal stap 5,15-5,16 op 1 min intervallen (04:10, 03:10, etc.) voor de resterende drug voorwaarde monsters (tubes 9-12).
18. Na het experiment is beëindigd, sparen projectdossiers, grondig wassen cuvettes met ultrapuur H ₂ O, en re-voorraad buizen voor de volgende conditie. Zorg ervoor dat kruisbesmetting in de wasstap te voorkomen. Wijzig de tip over het _H2O fles als de vacuümleiding tussen wasbeurten.

6. Data Analysis

1. Opslaan en exporteren van gegevens in bestanden SPC te formatteren om te worden gebruikt voor analyse. Analyse programma's zijn beschikbaar om te downloaden uit de Sivaramakrishnan Lab publicatie website.
2. Maak pad bestanden voor analyse software die de analyse programma's (v9, v15), ongetransfecteerde monsters bestanden (zie stap 5.6 voor ongetransfecteerde cel spectrum collectie), OUTPUT databestand en komma's gescheiden waarden (CSV) bestanden voor het invoeren van gegevens op te nemen.
3. Voer volgende informatienaar CSV-bestand (zie voorbeeld in tabel 3) en wijzen respectieve voorwaarden voor elk monster, waaronder:
   bestandsnaam - individuele SPC grafiek bestanden
   Receptor - aanwijzen die GPCR construct werd getest (bijv Β2)
   Binder - aanwijzen welk peptide variant van het construct werd getest (bijvoorbeeld, S)
   Agonist - aanwijzen onbehandeld (N) of geneesmiddel behandelde (D) voorwaarden
   Directory - het pad van de map waarin de SPC-bestanden worden opgeslagen, meestal georganiseerd op datum
   OD - opgenomen optische dichtheid van het monster van de spectrofotometer
4. Voer bestandsnamen voor ongetransfecteerde monsters (stap 5.6) naar buffer en verstrooiing lawaai van monsters af te trekken.
5. Voer voorwaarden in analyseprogramma.
6. Programma's uitvoeren om monsters binnen de individuele omstandigheden (versie 9) en over de omstandigheden (v15) te analyseren.
7. Uitsluiten voorbeeld bestanden die duidelijk uitschieters in de dataset zijn, of aan te passen voor aftrekken door verhoging of verlaging OD-waarde van inddubbele bestanden.
8. Gegevens exporteren naar output-bestand voor toegang tot de berekende FRET-ratio's (525 nm / 475 nm).
9. Bereken ΔFRET door het aftrekken van de gemiddelde FRET-ratio voor onbehandelde toestand van het individu FRET verhoudingen voor behandeld (drugs) omstandigheden.

Resultaten

Een algemeen schema van het experiment opgezet en uitvoering wordt beschreven in Figuur 3.

Om een ​​FRET verandering in de smalle dynamisch bereik van de sensor op te sporen, is het essentieel om zich te houden aan de nuances van het systeem worden nageleefd. Cell kwaliteit is noodzakelijk om eiwitexpressie en consistentie in monstername. Figuur 1 kenmerken afbeeldingen gekweekte cellen groeien in een consistente monolaag (10X) die optimaal is voor zes putje...

Discussie

De strakke dynamische bereik van FRET metingen in dit systeem versterkt de noodzaak gevoelige kwaliteitscontrole bij elke stap van dit protocol. De belangrijkste stappen voor een succesvolle FRET experiment waarborgen 1) celcultuur, 2) transfectie 3) eiwitexpressie en 4) tijdige, nauwkeurige coördinatie bij de test uitvoeren.

Cel gezondheid en onderhoud / plating kwaliteit kan een aanzienlijke invloed op de signaal-ruisverhouding van het experimentele systeem en slechte gezondheid cel kan he...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor	Addgene	47438	https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Fermentas/Fisher Sci	FERK0503	Elute in 2 mM Tris elution buffer
HEK-293T-Flp-n cellen	Life Technologies	R78007
Trypsine (0,25%)	Life Technologies	25200056
DMEM- hoge glucose	Life Technologies	11960-044	Verwarmen in  37 °C waterbad voor gebruik
FBS, gecertificeerd, Hitte geïnactiveerd, VS-oorsprong	Life Technologies	10082147
Glutamax I 100x	Life Technologies	35050061
HEPES	Corning	MT25060CL
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Verminderd serum medium; Breng naar RT voor gebruik
XtremeGene HP transfectiereagens	Roche	6366236001	Zeer aanbevolen vanwege de consistentie. Breng naar RT voor gebruik
FluoroMax 4	Horiba		Gebruik met FluorEssence V3.8 software
3-mm padlengte kwarts cuvet	Starna	NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)	Mogelijk een cuvethouder/adapter vereist voor gebruik in Fluorometer, verkrijgbaar bij Starna
Sc100-S3 Verwarmde Circulerende waterbadpomp	Fisher Scientific	13-874-826	Verwarmen tot 37 °C voor gebruik
Thermomixer Heat Block	Eppendorf	22670000	Verwarmen tot 37 °C voor gebruik
Ultrapure DNA/RNAse vrij water	Life Technologies	10977015	Gebruik bij RT
D(+)-glucose, watervrij	Sigma	G5767
aprotinine uit runderlong	Sigma	A1153
leupeptine hemisulfaat	EMD	10-897
L-ascorbinezuur, reagentiakwaliteit	Sigma	A0278
(-)-isoproterenol (+)-bitartraat	Sigma	I2760	Gebruik verse aliquot bij elk experiment