Methodenartikel

LED Thermo Flow - De combinatie van optogenetics met flowcytometrie

DOI:

10.3791/54707

⸱

30 december 2016

 ,  ,  , 
1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optisch bestuurde stoffen zijn krachtige hulpmiddelen om signaalroutes te bestuderen. Om het spectrum van mogelijke experimenten uit te breiden, hebben we een apparaat ontwikkeld voor het bestuderen van optisch bestuurde stoffen in realtime met behulp van flowcytometrie: de LED Thermo Flow.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetische hulpmiddelen maken geïsoleerde, functionele onderzoeken mogelijk van bijna elke signaalmolecuul binnen complexe signaalroutes. Een groot obstakel is de gecontroleerde aflevering van licht aan de celmonster en daarom zijn de meest populaire hulpmiddelen voor optogenetische studies microscoopgebaseerde celanalyses en in vitro experimenten. De flowcytometer heeft grote voordelen ten opzichte van een microscoop, inclusief de mogelijkheid om snel duizenden cellen met enkele celresolutie te meten. Toch wordt het nog niet veel gebruikt in de optogenetica. Hier presenteren we een apparaat dat de kracht van optogenetica en flowcytometrie combineert: de LED Thermo Flow. Dit apparaat verlicht cellen op specifieke golflengten, lichtintensiteiten en temperaturen tijdens flowcytometrische metingen. Het kan worden gebouwd tegen lage kosten en kan worden gebruikt met de meeste gangbare flowcytometers. Om de bruikbaarheid te demonstreren, hebben we de fotoswitching-kinetica van Dronpa-eiwitten in vivo en in realtime gekenmerkt. Dit protocol kan worden aangepast aan bijna alle optisch gecontroleerde stoffen en breidt de set mogelijke experimenten aanzienlijk uit. Wat nog belangrijker is, het zal de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe optogenetische hulpmiddelen aanzienlijk vereenvoudigen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetische gereedschappen zijn steeds populairder, mede omdat ze kunnen worden gebruikt om de bedrading van signaalwegen 1-4 ontcijferen. Zij zijn gebaseerd op het vermogen van activeerbare eiwitten om hun conformatie en bindingsaffiniteit veranderen wanneer verlicht met licht. Fuseren van deze eiwitten aan signalering elementen zorgt voor de specifieke regeling van een enkele speler binnen complexe intracellulaire signaalroutes 5-12. Bijgevolg kan een signaleringsroute worden bestudeerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

De meeste cellen gebaseerde studies optogenetic gebruik microscopie gebaseerde....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het ontwerpen en bouwen van de Device

  1. Pilot Experimenten
    LET OP: De vereiste lichtsterkte voor een bepaalde optogenetische gereedschap en celtype kunnen aanzienlijk verschillen. Pilot experimenten met prototypes zijn nuttig om de minimale lichtintensiteit nodig te schatten. Optogenetic het instrument voor de volgende experimenten is Dronpa-Linker-Dronpa fusieconstruct. De Dronpa sequentie werd in de handel verkregen (zie lijst van Materials). Een lange linker werd gekloneerd tussen twee Dronpa sequenties om de expressie construct intramoleculaire (en intermoleculaire) dimeren. De hieronder beschreven stappen kunnen worden aangepa....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de LED Thermo Flow met een flowcytometer

De functionele kern van de inrichting een cilindrische kamer waarin LED-lampen zijn in een cirkelvormig naar binnen gerichte wijze. Deze kamer kan worden verbonden met een watertoevoer en de pomp, die het mogelijk maakt de temperatuur van de LED's, evenals het celmonster. De LED's zijn aangesloten op een transformator en derhalve de lichtsterkte van elke golflengte .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De LED Thermo Flow is een innovatief apparaat om optogenetic gereedschappen studeren in een flowcytometer.

Tot nu toe hebben optogenetic monsters werden alleen verlicht met microscopie lasers of zaklamp apparaten 11,12. Afhankelijk van de hoek en de afstand van de zaklamp om het monster wordt aanzienlijke verschillen in de hoeveelheid belichting verwacht tussen experimenten. Verder is er een limiet aan het aantal zaklampen een persoon kan werken in een experiment. Dit beperkt de e.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken J. Schmidt van de Universiteit van Freiburg voor het bouwen van het apparaat. We danken P. Nielsen en D. Medgyesi voor hun ondersteuning en kritische lezing van dit manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft via SFB746 en door de Excellence Initiative van de German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Glass FACS tubeThermo Fisher Scientific; Waltham, USA14-961-26Borosilicate glass tubes 12x75 mm
Flow CytometerBD Bioscienceg; Heidelberg, GermanyFortessa IISpecial Order
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-NAddgene; Cambridge, USA41645
PolyJetSignaGen, Rockville, USASL100688
LED 505 nmAvago Technologies; Boeblingen, GermanyHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nmAvago Technologies; Boeblingen, GermanyUV5TZ-400-15
Plexiglas tube 15 mmMaertin; Freiburg, Germany76999
Plexiglas 3 mmMaertin; Freiburg, Germany692230
Plexiglas 2.5 mmMaertin; Freiburg, Germany692225
Plexiglas 1.5 mmMaertin; Freiburg, Germany692215
PVC tile 5 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.005
PVC tile 6 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.006
PVC block 50 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany61870-010
2-MercaptoethanolEMD; Germany805740
FCSPAN Biotech; Aidenbach, GermanyP30-3302
Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL)Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany15140-122
Acrifix plexiglas glueEvonic industries, Essen, Germany1R0192
Tangit PVC-U glueHenkel, Düsseldorf, Germany
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
  2. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
  3. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Wein....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetics Flow CytometryLED Thermo FlowPhotoswitching KineticsDronpa ProteinsFluorescence IntensityLight IntensityWavelength LEDsFlow Cytometric MeasurementsCell Signaling PathwaysRamos B Lymphocytes

Gerelateerde artikelen