Methodenartikel

LED Thermo Flow - De combinatie van optogenetics met flowcytometrie

DOI:

10.3791/54707

⸱

30 december 2016

 ,  ,  , 
1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optisch bestuurde stoffen zijn krachtige hulpmiddelen om signaalroutes te bestuderen. Om het spectrum van mogelijke experimenten uit te breiden, hebben we een apparaat ontwikkeld voor het bestuderen van optisch bestuurde stoffen in realtime met behulp van flowcytometrie: de LED Thermo Flow.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetische hulpmiddelen maken geïsoleerde, functionele onderzoeken mogelijk van bijna elke signaalmolecuul binnen complexe signaalroutes. Een groot obstakel is de gecontroleerde aflevering van licht aan de celmonster en daarom zijn de meest populaire hulpmiddelen voor optogenetische studies microscoopgebaseerde celanalyses en in vitro experimenten. De flowcytometer heeft grote voordelen ten opzichte van een microscoop, inclusief de mogelijkheid om snel duizenden cellen met enkele celresolutie te meten. Toch wordt het nog niet veel gebruikt in de optogenetica. Hier presenteren we een apparaat dat de kracht van optogenetica en flowcytometrie combineert: de LED Thermo Flow. Dit apparaat verlicht cellen op specifieke golflengten, lichtintensiteiten en temperaturen tijdens flowcytometrische metingen. Het kan worden gebouwd tegen lage kosten en kan worden gebruikt met de meeste gangbare flowcytometers. Om de bruikbaarheid te demonstreren, hebben we de fotoswitching-kinetica van Dronpa-eiwitten in vivo en in realtime gekenmerkt. Dit protocol kan worden aangepast aan bijna alle optisch gecontroleerde stoffen en breidt de set mogelijke experimenten aanzienlijk uit. Wat nog belangrijker is, het zal de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe optogenetische hulpmiddelen aanzienlijk vereenvoudigen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetische gereedschappen zijn steeds populairder, mede omdat ze kunnen worden gebruikt om de bedrading van signaalwegen 1-4 ontcijferen. Zij zijn gebaseerd op het vermogen van activeerbare eiwitten om hun conformatie en bindingsaffiniteit veranderen wanneer verlicht met licht. Fuseren van deze eiwitten aan signalering elementen zorgt voor de specifieke regeling van een enkele speler binnen complexe intracellulaire signaalroutes 5-12. Bijgevolg kan een signaleringsroute worden bestudeerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

De meeste cellen gebaseerde studies optogenetic gebruik microscopie gebaseerde methoden gecombineerd met kweken in de aanwezigheid van licht, gevolgd door biochemische analyse 11,12. Daarentegen een flowcytometer singularitseert cellen langs een capillaire en meet celgrootte en granulariteit fluorescentie-intensiteiten. Deze werkwijze heeft grote voordelen ten opzichte van microscopische of biochemische werkwijzen, waaronder de mogelijkheid duizend g analyserends van levende cellen bij eencellige resolutie in een zeer korte tijd. Daarom is het wenselijk om optogenetics combineren met flowcytometrie.

Voor zover wij weten, is er geen vastgesteld protocol voor optogenetic flowcytometrie. Een algemeen aanvaarde procedure handmatig cellen verlichten van buiten de reactiebuis met flitslicht apparaten. Echter, handmatige belichting in de stroom vereist cytometer het licht door de reactie buis te passeren en, voor live-cell imaging, een cilindrische, verwarmd waterreservoir. Dit veroorzaakt aanzienlijke lichtverstrooiing en lichtverlies. Bovendien, de lichtintensiteit door handmatige belichting niet reproduceerbaar tussen experimenten (hoek, afstand, etc.) en er een praktische grens aan het aantal golflengten in één experiment.

Door het construeren van de LED Thermo stromingsinrichting, waren we in staat om deze beperkingen te overwinnen. Met deze inrichting kunnen cellen worden verlicht met specifieke golflengten in een temp-Erature gecontroleerde wijze tijdens flowcytometrische metingen. Dit zorgt voor nauwkeurige en reproduceerbare hoeveelheden licht binnen en tussen experimenten.

Om het nut van onze inrichting in vivo te demonstreren, namen we het fluorescentiesignaal van Dronpa in Ramos B-cellen tijdens photoswitching. Ramos B-cellen zijn afgeleid van een menselijk Burkitt-lymfoom. Dronpa een fluorescent eiwit dat bestaat als een monomeer, dimeer of tetrameer. In zijn monomere vorm, niet-fluorescerend. Belichting met 400 nm licht induceert dimerisatie en tetramerisatie en maakt de Dronpa eiwit fluorescent. Dit proces kan door belichting met 500 nm licht. De Dronpa proteïne is gebruikt om de functie en locatie van signaaleiwitten 4,13 beheersen.

Hier, uitgedrukt we een Dronpa-Linker-Dronpa eiwit in Ramos B-cellen photoswitching van Dronpa bestuderen in een flowcytometer. Met behulp van onze apparaat, waren we in staat om efficiënt enreproduceerbaar PHOTOSWITCH Dronpa tijdens het opnemen van de fluorescentie-intensiteit in real time. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de huidige verlichting protocollen met handmatige belichting en aanzienlijk verbreedt de experimentele repertoire voor optogenetic gereedschappen en kooi verbindingen. Met behulp van onze apparaat zal aanzienlijk vereenvoudigen en versnellen van de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe optogenetische gereedschappen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het ontwerpen en bouwen van de Device

  1. Pilot Experimenten
    LET OP: De vereiste lichtsterkte voor een bepaalde optogenetische gereedschap en celtype kunnen aanzienlijk verschillen. Pilot experimenten met prototypes zijn nuttig om de minimale lichtintensiteit nodig te schatten. Optogenetic het instrument voor de volgende experimenten is Dronpa-Linker-Dronpa fusieconstruct. De Dronpa sequentie werd in de handel verkregen (zie lijst van Materials). Een lange linker werd gekloneerd tussen twee Dronpa sequenties om de expressie construct intramoleculaire (en intermoleculaire) dimeren. De hieronder beschreven stappen kunnen worden aangepast aan vele andere optogenetic gereedschappen of optisch gereguleerde stoffen.
    1. Transduceren Ramos B-lymfocyten met een Dronpa-Linker-Dronpa construct bevattende de instructies van de fabrikant voor transductie met de retrovirale-bevattende supernatant van verpakkingscellen. Oogst en tellen cellen volgens een voorafviously gepubliceerd protocol 13.
    2. Resuspendeer cellen bij een concentratie van 1 x 10 6 / ml in medium (RPMI 1640, 10% door warmte geïnactiveerd FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 U / ml streptomycine, en 50 pM 2-mercaptoethanol) en overbrengen naar een glazen FACS buis.
    3. Steek de buis in een flowcytometer en het meten van de fluorescentie-intensiteit van Dronpa (GFP kanaal) 14,15.
    4. Draag beschermende bril voor alle verdere stappen om de ogen te beschermen tegen mogelijk schadelijke golflengten.
    5. Handmatig op een 500 nm LED aan de buitenzijde van de buis en verder het meten van de fluorescentie-intensiteit van Dronpa.
    6. Toename van het aantal en / of de intensiteit van de LED-verlichting tot Dronpa fluorescentie-intensiteit afneemt.
    7. Handmatig op een 400 nm LED aan de buitenzijde van de buis en verder het meten van de fluorescentie-intensiteit van Dronpa.
    8. Toename van het aantal en / of de intensiteit van de LED-verlichting tot de Dronpa fluocerend intensiteit toeneemt.
    9. Gebruik minstens evenveel LED bouw van het apparaat zoals voorspeld noodzakelijk te zijn van de photoswitching stapsgewijs 1.1.5 en 1.1.7.
  2. Het bouwen van het apparaat
    LET OP: Het apparaat is gebouwd door een professionele machinale winkel, de Arbeitsgruppe Technik van de Universiteit van Freiburg. De meeste onderdelen zijn op maat gemaakt en niet in de handel verkrijgbaar. De exacte afmetingen van elk deel zijn weergegeven in figuren 1 en 2. Om de montage van dit apparaat te verduidelijken, Aanvullende Video 1 is aangebracht en de meest essentiële stappen worden hierna beschreven.
    1. Molen piece A uit polyvinylchloride (PVC) met de exacte maten figuur 1A.
    2. Steek LED-verlichting in de gaten van het werk A en verzegelt elk gat met PVC lijm om water lekkage te voorkomen.
    3. Sluit LEDs naar een multichannel transformator (elke golflengte moet een aparte chann bezettenel) met een verstelbare uitgangsvermogen 0-29 mA.
    4. Bevestig de buitenmantel (B) met 3 schroeven piece A zoals getoond om de LED's te beschermen tegen fysieke schade.
    5. In staat zijn om het apparaat te verbinden met een waterpomp, lijm in de buis clips (C) in de gaten van het stuk A (weergegeven in figuur 1a, doorsnede Y: 9 mm en 61,5 mm) met behulp van PVC lijm.
    6. Snijd een 58,5 mm lang Plexiglas buis (D1).
    7. Vervaardiging stukken D2 en D3 van plexiglas zoals weergegeven in figuur 2.
    8. Lijm stuk D3 naar de bodem van D1 met plexiglas lijm.
    9. Bevestig een rubberen O-ring stuk D2 en lijm het aan de top van de D1 met plexiglas lijm.
      LET OP: De stukken D1, D2 en D3 vormen samen stuk D.
    10. Inzetstuk D in stuk A met 3 schroeven.
    11. Test de inrichting voor waterlekkage voordat de stroom naar de transformator.

2. Het meten van de kinetiek van een optogenetische Tool

  1. Bereid cellen
    1. Cultuur Ramos B-cellen in RPMI-medium (RPMI 1640, 10% door warmte geïnactiveerd FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 U / ml streptomycine, en 50 pM 2-mercaptoethanol) bij een dichtheid van 3- 10 x 10 6 cellen / ml bij 37 ° C en 5% CO2.
    2. Oogst Ramos B-cellen door centrifugatie bij 350 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten.
    3. Aantal cellen met behulp van een Neubauer telkamer volgens de instructies van de fabrikant en resuspendeer 1-5 x 10 6 cellen in 600 pl medium.
    4. Overdracht van de cellen om een ​​glazen FACS buis, leg ze op ijs en hen te beschermen tegen licht tot de meting.
  2. Bereid de flowcytometer en het apparaat.
    1. Sluit het apparaat aan een verwarmde waterpomp en de temperatuur op 37 ° C.
    2. Bij het gebruik van glazen FACS buizen, wisselen de zwarte O-ring van de flowcytometer met een rubberen O-ring en bovendien passen silicium grgemak.
  3. maat
    1. Steek de glazen FACS buis in het apparaat en sluit deze aan op de flowcytometer (figuur 3).
    2. Start de meting en noteer Dronpa fluorescentie-intensiteit (GFP kanaal).
    3. Verlichten de cel monster met 400 nm of 500 nm licht respectievelijk en noteer de Dronpa fluorescentie-intensiteit (GFP kanaal).
  4. Gegevensanalyse
    1. Analyseer experimentele gegevens met geschikte software flowcytometer. Plot voorwaartse verstrooiing tegen zijwaartse scatter en de poort van de levende cellen. Zet de Dronpa fluorescentie-intensiteit in de tijd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van de LED Thermo Flow met een flowcytometer

De functionele kern van de inrichting een cilindrische kamer waarin LED-lampen zijn in een cirkelvormig naar binnen gerichte wijze. Deze kamer kan worden verbonden met een watertoevoer en de pomp, die het mogelijk maakt de temperatuur van de LED's, evenals het celmonster. De LED's zijn aangesloten op een transformator en derhalve de lichtsterkte van elke golflengte ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De LED Thermo Flow is een innovatief apparaat om optogenetic gereedschappen studeren in een flowcytometer.

Tot nu toe hebben optogenetic monsters werden alleen verlicht met microscopie lasers of zaklamp apparaten 11,12. Afhankelijk van de hoek en de afstand van de zaklamp om het monster wordt aanzienlijke verschillen in de hoeveelheid belichting verwacht tussen experimenten. Verder is er een limiet aan het aantal zaklampen een persoon kan werken in een experiment. Dit beperkt de e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken J. Schmidt van de Universiteit van Freiburg voor het bouwen van het apparaat. We danken P. Nielsen en D. Medgyesi voor hun ondersteuning en kritische lezing van dit manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft via SFB746 en door de Excellence Initiative van de German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Glass FACS tubeThermo Fisher Scientific; Waltham, USA14-961-26Borosilicate glass tubes 12x75 mm
Flow CytometerBD Bioscienceg; Heidelberg, GermanyFortessa IISpecial Order
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-NAddgene; Cambridge, USA41645
PolyJetSignaGen, Rockville, USASL100688
LED 505 nmAvago Technologies; Boeblingen, GermanyHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nmAvago Technologies; Boeblingen, GermanyUV5TZ-400-15
Plexiglas tube 15 mmMaertin; Freiburg, Germany76999
Plexiglas 3 mmMaertin; Freiburg, Germany692230
Plexiglas 2.5 mmMaertin; Freiburg, Germany692225
Plexiglas 1.5 mmMaertin; Freiburg, Germany692215
PVC tile 5 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.005
PVC tile 6 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.006
PVC block 50 mmMaertin; Freiburg, Germany690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany61870-010
2-MercaptoethanolEMD; Germany805740
FCSPAN Biotech; Aidenbach, GermanyP30-3302
Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL)Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany15140-122
Acrifix plexiglas glueEvonic industries, Essen, Germany1R0192
Tangit PVC-U glueHenkel, Düsseldorf, Germany
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
  2. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
  3. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  4. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
  5. Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
  6. Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898(2015).
  7. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  8. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925(2014).
  9. Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
  10. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  11. Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
  12. Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
  13. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
  14. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  15. Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
  16. Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetics Flow CytometryLED Thermo FlowPhotoswitching KineticsDronpa ProteinsFluorescence IntensityLight IntensityWavelength LEDsFlow Cytometric MeasurementsCell Signaling PathwaysRamos B Lymphocytes

Gerelateerde artikelen