We beschrijven hier een transgenisch reportermuismodel om de IL-22-producerende cellen in verschillende muisweefsels te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de locatie van andere cytokinen of secretoire eiwitten in de muis te volgen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Reportermuizen zijn op grote schaal gebruikt voor de lokalisatie van de expressie van gerichte genen observeren. Dit protocol richt zich op een strategie om een nieuwe transgene reporter muismodel vast te stellen. We kozen te visualiseren interleukine (IL) 22 genexpressie omdat cytokine heeft belangrijke activiteiten in de darm, waar het bijdraagt aan weefsel beschadigd door ontsteking herstellen. Reportersystemen bieden grote voordelen boven andere werkwijzen voor het identificeren producten in vivo. In het geval van IL-22, had andere studies eerste geïsoleerde cellen uit weefsels en vervolgens opnieuw gestimuleerde cellen in vitro. IL-22, die normaal wordt uitgescheiden, werd opgesloten in cellen met een geneesmiddel, en intracellulaire kleuring werd gebruikt voor het visualiseren. Deze werkwijze identificeert cellen die in staat is IL-22, maar niet bepalen of ze dat deden in vivo. De reporter ontwerp omvat het inbrengen van een gen voor een fluorescerend eiwit (tdTomato) in de IL-22-gen in dergelijke way dat het fluorescerende eiwit kan worden uitgescheiden en derhalve blijft opgesloten in de cellen in vivo. Fluorescerende producenten kunnen vervolgens worden gevisualiseerd in weefselcoupes of door ex vivo analyse door middel van stromingscytometrie. De eigenlijke bouwproces voor de reporter opgenomen recombineering een bacterieel kunstmatig chromosoom dat de IL-22-gen bevatte. Deze gemanipuleerde chromosoom werd vervolgens in het muis genoom. Homeostatische IL-22 reporter expressie werd waargenomen in verschillende muizenweefsels, waaronder de milt, thymus, lymfeklieren, Peyer's patch en darmen, met stroomcytometrie analyse. Colitis werd geïnduceerd door T-cellen (CD4 + CD45RBhigh) overdracht en reporter expressie werd gevisualiseerd. Positieve T cellen werden eerst in de mesenterische lymfeklieren en vervolgens geaccumuleerd zij in de lamina propria van de distale dunne darm en colon weefsel. De strategie van het gebruik van BAC's gaf goede-fidelity reporter uitdrukking in vergelijking met IL-22 expressie en het is eenvoudiger dan knock-in procedures.
Inleiding
Celtype-specifieke expressie van reportergenen nuttig om cellen actief expressie het doelwit weefsels onder homeostatische en verstoorde staten identificeren. Het staat ook voor de zuivering van deze cellen die levensvatbaar blijven hun andere eigenschappen te bestuderen. Reportermuizen zijn gebruikt in het ophelderen van het werkingsmechanisme van bepaalde cytokines, transcriptiefactoren en regulerende elementen. Previous strategieën 1, 2, 3 hebben grotendeels gebruikt kloppen de reporter in het doel-locus in de muis chromosoom, een tijdrovende en kostbare procedure. Dus ee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dieren kregen de juiste zorg in overeenstemming met de in de Guide 2011 voor de zorg en het gebruik van het Laboratorium Comité Dieren van Frederick National Laboratory for Cancer Research experimentele procedures.
1. Generatie van IL-22-tdTomato Reporter muizen door BAC recombineering
OPMERKING: De muizen moeten onbewust en niet bewegen in reactie op een schadelijke prikkel. Steriliseer de chirurgische gebied met 70% ethanol en steriliseer alle chirurgische instrumenten met een glazen kraal sterilisator.
- Zuiver BAC DNA (RP23-401E11, lengte kloon 228.391 bps) met een alkalische extractiewerkwij....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een muis-IL-22 reporter transgen is gemaakt met recombineering een bacterieel kunstmatig chromosoom die het IL-22 locus wijzigen. Figuur 1 een schema van pBACe3.6 vector die het gen sacBII een positieve selectiemerker en chlooramfenicol antibioticumresistentiegen 11. Na de introductie tdTomato in exon 1, werd de signaalpeptidesequentie verstoord, zie figuur 2. Aldus werd de tdTomato reporter opgesloten in de IL-22 tot exp.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
IL-22 speelt een essentiële rol in de aangeboren afweer en weefsel remodeling. IL-22-producerende cellen zijn geïdentificeerd ex vivo door intracellulaire kleuring. Echter, het blijft moeilijk om IL-22 expressie volgen in situ, in de normale toestand of ontstekingsaandoeningen. Dit protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor een IL-22 reporter muismodel, waardoor we de reporter tot expressie brengen in vivo te lokaliseren ontwikkelen. Het reportergen codeert TdTomato werd in de IL-22 locus o.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We bedanken Kelli Czarra en Megan Karwan voor technische hulp met dieren, Kathleen Noer en Roberta Matthai voor hulp bij flowcytometrie, en Donna Butcher en Miriam R. Anver voor pathologieanalyse. Dit project werd ondersteund door een subsidie van de Ely and Edythe Broad Foundation (aan Scott Durum) en is geheel of gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder contractnummer HHSN261200800001E (MRA).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
Referenties
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing ce....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
