De geïsoleerde Mouse perfusie Kidney Techniek

Samenvatting

De muis die geperfuseerde nier (MIPK) is een techniek voor het houden van een muizennier onder ex vivo omstandigheden geperfuseerd en functioneel voor 1 uur. De buffers en operatietechniek worden beschreven.

Samenvatting

De muis die geperfuseerde nier (MIPK) is een techniek voor het houden van een muizennier onder ex vivo omstandigheden geperfuseerd en functioneel voor 1 uur. Dit is een voorwaarde voor de fysiologie van het geïsoleerde orgaan en vele innovatieve toepassingen die in de toekomst mogelijk is, zoals perfusie van cellen ontdoen van nier biotechniek of de toediening van anti-afwijzing of genoom bewerken geneesmiddelen in hoge doses prime de nier voor transplantatie. Ten tijde van de perfusie kan de nieren worden gemanipuleerd, nierfunctie meetbaar zijn en verschillende geneesmiddelen toegediend. Na de procedure kunnen de nieren worden getransplanteerd of bewerkt voor moleculaire biologie, biochemische analyse of microscopie.

Dit artikel beschrijft het perfusaat en de chirurgische techniek die nodig is voor de ex vivo perfusie van nieren muis. Details van de perfusie inrichting worden gegeven en gegevens zijn die de vANSPRAKELIJKHEID van de voorbereiding van de nieren: renale bloedstroom, vasculaire weerstand, en urine gegevens als functioneel, transmissie electronenmicroscoop van verschillende nephron segmenten als morfologische uitlezingen en western blots van transporteiwitten van verschillende nephron segmenten als moleculaire uitlezing.

Inleiding

De geïsoleerde perfusie van organen is het onderwerp van een voortdurende inspanning onder fysiologen al vele tientallen jaren ^1. De techniek maakt de functie van het orgaan, zonder systemische invloeden zoals bloeddruk, hormonen of zenuwen, te bestuderen. Carl Eduard Loebell wordt beschouwd als de eerste te hebben beschreef de succesvolle perfusie van een geïsoleerde nier, in 1849 ² te zijn. Sindsdien is de perfusie apparaat aanzienlijke verfijning ondergaan. Frey en Gruber introduceerde een kunstmatige long voor oxygenatie en pulserende pomp voor continue perfusie ^2. Terwijl de vroege onderzoekers bestudeerden vooral de nieren van de grote zoogdieren, namelijk varkens en honden ^{2 3} -het eerste verslag van het gebruik van de rat nieren, door Weiss et al. , Was een mijlpaal in de studie van kleine zoogdieren-orgel perfusie ^4. Schurek et al. meldde de noodzaak van het toevoegen van zoogdieren erytrocyten aan het perfusaat voldoende als tubulaireoxygenatie moest worden bereikt ^5. Kritiek voor langdurige experimenten was de introductie van continue dialyse van de buffer van dezelfde onderzoeksgroep ^6. In 2003, Schweda et al. waren de eersten die een geïsoleerd functionele muis doorbloed nier (MIPK) ^7, later verfijnd door Rahgozar et al melden. ¹⁸ en Lindell et al. ^14.

Terwijl technisch lastiger dan de rat geïsoleerde geperfuseerde nier, het gebruik van de MIPK draagt ​​het voordeel dat het gebruik van een breed scala van genetisch gemanipuleerde muizen. Dit document geeft de details van de methode van de auteurs voor perfuseren geïsoleerde muis nieren gedurende 1 uur. De methode maakt het mogelijk voor de continue evaluatie van renale stroomsnelheid, vasculaire weerstand, afgifte van hormonen, bloed gas analyse, urine-analyse, en de toepassing van drugs. De procedure kan nieren worden verwerkt voor moleculaire en biochemische analyse, voor microscopie worden vastgesteld, ofgetransplanteerd in een ontvanger muis (Figuur 1).

Figuur 1: Overzicht van mogelijke Input / Output aan de geïsoleerde geperfuseerde nier. BGA: Blood gas analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze techniek zal waarschijnlijk krijgen steeds meer aandacht de komende jaren, zoals vele innovatieve toepassingen worden met het aanbreken van langdurige normotherme nier perfusie besproken voorafgaand aan de transplantatie (met of zonder de toepassing van anti-afwijzing of-genoom bewerken drugs) ^{8, 9, 10 , 11,} de bioengineering van hele nieren van cellen ontdane scaffolds ^12, en de toepassing van hoge doses van fluorescente kleurstoffen voor beeldvorming multiphoton ¹³ . Het is ook een ideaal model waarmee de rol van specifieke genen te bestuderen bij acuut nierfalen ^14.

Een stap-voor-stap protocol gegeven zodat andere laboratoria geïsoleerde muizennier perfusie succes uit te voeren. Eerst wordt de samenstelling en de bereiding van de buffer opgegeven. Vervolgens wordt de operatie beschreven en de kritische stappen worden. Ten derde, gegevens worden gepresenteerd die representatief zijn voor een succesvolle voorbereiding zijn: renale bloedstroom, vaatweerstand, glomerulaire filtratiesnelheid en fractionele uitscheiding van elektrolyten-all als functionele metingen van de levensvatbaarheid-en transmissie elektronen microfoto van de morfologie van verschillende nephron segmenten van geperfundeerde nieren vastgesteld na 1 uur van perfusie.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren in dit manuscript beschreven, werden uitgevoerd volgens Zwitsers recht en door de veterinaire dienst van het kanton Zürich, Zwitserland goedgekeurd.

1. Buffer Voorbereiding

1. Bereid oplossingen 1-4 en de oplossing antidiuretisch hormoon (ADH) (Tabel 1).
2. Bereid de dialyse buffer (Tabel 1).
   Opmerking: Dit is de buffer als de dialyse buffer tijdens de perfusie. Later zal de erytrocyten worden verdund in de buffer tot de uiteindelijke perfusaat vormen.
3. Erytrocytpreparaat.
   1. Verdun 250 ml humaan erytrocytenconcentraat (getest materiaal verkregen van de plaatselijke bloedbank) tot 500 ml met dialyse buffer. Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 8 minuten. Verwijder de buffer, zorg dat u geen erytrocyten niet te verwijderen. Herhaal 3x.
4. Bereid de albumine (runderserumalbumine; BSA) buffer.
   1. In 200 ml dialysis buffer, los 44 g BSA met behulp van een roerstaafje. Filter de oplossing met filter papier.
5. Bereid de perfusaat.
   1. Filter de erytrocyten uit stap 1.3.1 door middel van filter papier in de BSA buffer. Vult tot een totaal volume van 800 ml met dialysebuffer.
      LET OP: Dit is de laatste perfusaat. De hematocriet moet nu tussen 8 en 12%. Het perfusaat kan worden bewaard tot 12 uur bij 4 ° C.

2. Initiëren Dialyse en Oxygenatie

1. Zet het waterbad rond de grotere bufferreservoir kleiner bufferreservoir en de vochtige kamer (een kleine, dubbelwandige kamer gebracht tot 37 ° C en 100% vochtigheid later houden de nier) tot 37 ° C (figuur 2) .
2. Vul het grotere bufferreservoir met de dialysebuffer en hoe kleiner reservoir van het perfusaat.
3. Schakel de _5% CO2 / 95% _O2 gas aanvoer naar de dialyse buffer.
4. Schakel continue dialyse van het perfusaat tegen dialyse buffer. Zorg ervoor dat low-flux dialyse tubing gebruiken. Ga verder met stap 3.

Figuur 2: schematische tekening van de perfusie Circuit. Schema toont de belangrijkste onderdelen van het perfusiecircuit en de richting van de bufferstroom. Alle componenten omgeven door donkerblauwe worden bij 37 ° C gehouden met een waterbad / thermostaat. 1: Dialyse buffer van ten minste 3 keer het volume van de perfusie buffer continu geborreld met _95% O2 / 5% _CO2. 2: dialysebuffer en perfusiebuffer continu gedialyseerd tegen elkaar in een dialysebuis door een rollerpomp. 3: Hierdoor dialyse, de perfusie buffer verrijkt met _9% O2 / 5% CO ₂ en elektrolyten worden constant gehouden throughout perfusie. 4: Een rollenpomp stuwt de perfusie buffer naar de nier. 5: Een windketel verwijdert peristaltische golven en fungeert als een zeepbel te houden. 6: Druk meters (aangesloten op 4. (roller pomp) continue druk te houden terwijl het toestaan van vrij afwisselend flow). 7: Gedurende perfusie, de nier blijft in een vochtige kamer 100% luchtvochtigheid en 37 ° C nier temperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Chirurgische Procedure Part 1 (voor een schema van ligaturen, zie figuur 3)

Opmerking: Voer alle ligaturen met behulp van 5-0 chirurgische draad.

1. Verdoven een muis door intraperitoneale injectie (10 ul / g lichaamsgewicht, 20 mg / ml ketamine en 1 mg / ml xylazine opgelost in 0,9% NaCl). Bevestig voldoende diepte van AnesthESIA door het testen voor de afwezigheid van de achterste voet reflexen.
2. Bevestig de muis in een liggende positie in de vochtige kamer. Bescherm de ogen met dierenarts zalf. Plaats een 1 ml spuit onder de ruggengraat naar de lumbale vaten verhogen.
3. Voer een mediane laparotomie van de schaamstreek kuif aan het borstbeen opening eerst de huid, dan is de buikspieren, met een schaar.
4. Verwijder de darm en plaats het op de linkerkant van de muis laterale uit de buik.
5. Bevrijd de blaas uit bindweefsel en verken zowel urineleiders en de plasbuis.
6. Plaats een ligatuur rond de linker ureter (ligatuur I). Sluit het.
7. Plaats een ligatuur rond de plasbuis (ligatuur II). Sluit het.
8. Plaats een "lasso" ligatuur rond de gehele blaas (ligatuur III).
9. Insnijden de blaas 1 mm.
10. Canule de opening 2 cm PE 50 buis.
11. Sluiten ligatuur III rond de buis.
12. Snijd de linker urineleider en de urinebuis distale van de ligaturen. het bladder is nu aan de rechter ureter alleen en vrij bewegen.
13. Schakel de abdominale aorta van bindweefsel en vet.
14. Plaats een abdominale aorta mid-ligatuur (ligatuur IV).
15. Plaats een ligatuur rond de aorta onder het diafragma tussen de mesenterica superior en het Celiac kofferbak (ligatuur V).
16. Plaats een ligatuur rond de mesenterica superior (ligatuur VI).
17. Plaats een aorta ligatuur direct onder rechts en boven de linker nierslagader (ligatuur VII).
18. Plaats een ligatuur rond de staartader pakket (cava) (ligatuur VIII). Ga verder met stap 4.

Figuur 3: schematische tekening van de Ligatures geplaatst tijdens de operatie. Uitzicht op de open buik na de laparotomie. De darm wordt verplaatst naar links. L en R geven de linker en rechter nier. Dezwarte lijnen tonen het gebied van de respectievelijke ligatuur. Ligaturen eerst gelegd en dan gesloten, in de volgorde in de tekst. X geeft de locatie van de incisie voor aorta infusen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Vullen van de perfusiekringloop

1. Start de roterende pomp en vul de buis met perfusaat. Zorg ervoor dat alle luchtbellen leeg te maken van het.
2. Vul het windketel apparaat tot ongeveer mid-level met perfusaat.
3. Kalibreer de drukomvormer aan 0 mm Hg wanneer alle buis wordt gevuld en flow 0. Laat de perfusie naald onder nier niveau gedurende deze tijd.
4. Houd stroom op een constant minimaal niveau (0,6 ml / min) en ga verder met stap 5.

5. Chirurgische Procedure Part 2

1. Plaats een klem tussen ligatuur IV en de vertakking van de linker renal slagader.
2. Maak een kleine incisie in de aorta staart van ligature IV, zorg ervoor dat niet snijd de dorsale muur.
3. Verwijden van de opening in de aorta met een vaatverwijder.
4. Canule van de aorta met een naald (2 cm lang, trok PE 50), duwt de punt alleen maar om de klem.
5. Open de klem.
6. Duw de punt van de naald craniaal tot aan de kruising van de rechter nierslagader en de aorta bereikt.
7. Sluit ligatuur VII.
8. Sluit ligatuur IV.
9. Open de kist met een schaar door het ontleden van het middenrif. Met een enkele cut, scheiden de aorta, vena cava, hart en vegetatieve zenuwen. Met deze stap wordt het dier opgeofferd via snelle verbloeding onder continu diep narcose.
10. Start drukregeling de perfusiepomp. Handhaaf de gemiddelde druk tussen 80 en 100 mmHg.
11. Sluiten ligatuur V.
12. Sluit ligatuur VI.
13. Sluit ligatuur VIII.
14. Gratis de rechter nier van verbindende tissue en de inbedding in het vet capsule met een schaar.
15. Snijd de aorta proximaal aan Ligatuur V.
16. Snijd de mesenterica superior distaal aan Ligatuur VI.
17. Snijd de nier ondersteunende schip bundel uit, zorg ervoor dat niet in de vaten zelf te snijden.
18. Snijd de lever in de verbinding met de nier. Zorg ervoor dat de nieren vrij, maar laat een klein deel van de lever hechtend aan, zodat de vena cava opengehouden wordt door het.
19. Neem de nier bundel uit de muis. Verwijder de muis uit de vochtige kamer.
20. Plaats een "lasso" ligatuur rond de aansluiting van de lever en de nieren (ligatuur IX).
21. Canule van de vena cava met een veneuze lijn (2 cm PE 50).
22. Sluit ligatuur IX. Veneuze uitstroom door de veneuze lijn moet onmiddellijk beginnen.
23. Sluit de vochtige kamer.

6. Downstream Analyses

1. Gedurende het volgende uur, voortdurend te controleren bloedstroom en intravascular druk ^15. Verzamel veneuze uitstroom, die kan worden gebruikt voor analyse van bijvoorbeeld renale reninesecretie ^7. Verzamel urine voor de analyse van de elektrolyt concentratie en glomerulaire filtratiesnelheid ^14. Na 1 h perfusie, nieren kan worden snel bevroren voor western blotting of beeldvorming vastgesteld nadert ^16.

Resultaten

Met de werkwijze beschreven, kan geïsoleerd muis nieren levensvatbaar is ten minste 1 uur. We testten het weefsel levensvatbaarheid na 1 uur van continue perfusie met functionele (renale bloedstroom en vasculaire weerstand, bloedgasanalyse van veneuze uitstroom, glomerulaire filtratiesnelheid, urinair fractionele Na ⁺ en K ⁺ excretie en urine osmolaliteit) en morfologische (transmissie elektronen microscopie, TEM) methoden vier nieren van wildtype C57BL / 6 muizen. ...

Discussie

De muis die geperfuseerde nier is een hulpmiddel voor het bestuderen van nierfunctie in een gecontroleerde omgeving ex vivo gedurende 1 uur, de kloof tussen in vivo experimenten bij intacte dieren, eventueel ontsierd door de impact van talrijke systemische factoren, en in vitro experimenten geïsoleerde nefron segmenten of gekweekte cellen, die de impact van intacte orgaan structuur op de functie noodzakelijk verwaarlozen. Er is, om de kennis van de auteurs, geen alternatieve techniek waarmee d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Perfusiekringloop:
Vochtige kamer 834/8	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2901
Cannula met mand en zijpoort	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2947
Thermostaat TC120-ST5	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-4544
ISM 827/230V Rollerpomp Reglo Analogue	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-0114
Reservoir gemanteld voor bufferoplossing 1 L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3438
Reservoir gemanteld voor bufferoplossing 0.5 L	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3436
Druktransducer APT300	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3862
TAM-D Plugsys Transducer	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-1793
SCP Plugsys servoregelaar	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-2806
Windkessel	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3717
HSE-USB data acquisitie	Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH	73-3330
Laag-Flux Dialysator Diacap Polysulfone	B.Braun	7203525
PE-Buis voor aorta cannulatie 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/8
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Buffer reagentia:
Aminoplasmal 10%	B.Braun	134518064
Natriumpyruvaat	Sigma-Aldrich	P2256-25G
L-Glutaminzuur natriumzout hydraat	Sigma-Aldrich	G1626-100G
L-(-)-Appelzuur natriumzout	Sigma-Aldrich	M1125-25G
Natrium-L-Lactaat	Sigma-Aldrich	L7022-10G
Alpha-Ketoglutaarzuur natriumzout	Sigma-Aldrich	K1875-25G
NaCl	Sigma-Aldrich	31434-1KG-R
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761-5KG
KCl	Sigma-Aldrich	60130-1KG
Urea	Sigma-Aldrich	U5378-500G
Creatinine	Sigma-Aldrich	C4255-10G
Ampicilline	Roche	10835242001
MgCl2 * 6H2O	Sigma-Aldrich	M2393-500G
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
CaCl2 * 6H2O	Riedel-de-Haën	12074
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638-500G
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S0876-500G
Antidiuretisch Hormoon dDAVP	Sigma-Aldrich	V2013-1MG
FITC-Inuline	Sigma-Aldrich
Filter gebruikt voor erytrocyt filtratie	Macherey-Nagel	MN 615
BGA Analyse:
ABL 80 flex	Radiometer Medical ApS
Elektronenmicroscoop:
Philips CM100 TEM	FEI