Methodenartikel

Een alternatieve benadering voor Monstervoorbereidingstesten met een lage aantal cellen voor TEM Analyse

13.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/54724

⸱

12 oktober 2016

 , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children’s Research Foundation

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om monsters met een laag aantal cellen voor te bereiden op transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse.

Samenvatting

Transmissie elektronen microscopie (TEM) geeft details van de cellulaire organisatie en ultrastructuur. Echter, TEM analyse van zeldzame celpopulaties, met name cellen in suspensie zoals hematopoietische stamcellen (HSCs) blijft beperkt door de eis van een hoog aantal cellen tijdens de voorbehandeling. Er zijn enkele cytospin of monolaag benaderingen TEM analyse van schaarse monsters, maar deze benaderingen niet significante kwantitatieve gegevens uit het beperkte aantal cellen. Hier wordt een alternatieve en nieuwe benadering voor de monstervoorbereiding in TEM studies beschreven voor zeldzame celpopulaties dat kwantitatieve analyse mogelijk maakt.

Een relatief laag aantal cellen, dat wil zeggen, 10.000 HSCs, werd met succes gebruikt voor TEM analyse werden de miljoenen cellen doorgaans gebruikt voor TEM studies. In het bijzonder werd Evans blauw kleuring uitgevoerd na paraformaldehyde-glutaaraldehyde fixatie (PFA-GA) naar het kleine cel pel visualiserenlaat die gefaciliteerd inbedding in agarose. Clusters van talrijke cellen waargenomen in ultra-dunne secties. De cellen hadden een goed bewaard morfologie en de ultra-structurele details van het Golgi complex en verschillende mitochondriën toegankelijk. Deze efficiënte, eenvoudige en reproduceerbare protocol maakt monstervoorbereiding van geringe aantal cellen en kan worden gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van TEM zeldzame celpopulaties van biologische monsters beperkt.

Inleiding

Ultra-structurele en suborganel data van cellen zijn voornamelijk aangetoond door transmissie- elektronenmicroscopie (TEM) studies weefsels of celpellets 1,2. Stevige stukjes weefsel kan eenvoudig worden gebruikt voor elektronenmicroscopie studies. Echter, TEM analyse 1,3 op cellen in suspensie blijven uitdagend en vereisen hoge celaantallen, dwz miljoenen cellen. Hierdoor ultra-structurele analyses van zeldzame celpopulaties in suspensie, bijvoorbeeld hematopoietische stamcellen (HSC) worden niet gemakkelijk beoordeeld. Meerdere pogingen voor TEM analyse van schaarse monsters met behulp van cytospin of monolaag benaderingen niet aan belangrijke kwantitatieve gegevens te krijgen van het beperkte aantal cellen. Zo is de eis van een hoog aantal cellen beperkt het gebruik van deze krachtige instrument om de subcellulaire ultrastructurele data van zeldzame celpopulaties begrijpen.

Een belangrijke beperking voor TEM studies met een beperkt aantal van de cels in suspensie is de lokalisatie van de cellen voor verwerking en dus TEM onderzoeken van beperkte cellen met bijzonder kleine afmetingen blijven uitdagend. Verschillende alternatieve benaderingen zijn genomen om deze beperking tegen te gaan: de BSA / bisacrylamide (BSA-BA) gemedieerde polymerisatie van celsuspensie, de kleuring van cellen met een kleurstof ze zichtbaar op een dunne film-ondersteuning, inclusief dekglaasjes te maken, en TEM analyses van cytospinpreparaten 4-6. Echter, was zeer beperkt succes, als zeer weinig cellen werden gevonden in de secties na ultra-snijden. De belangrijkste uitdaging voor het identificeren van schaarse cellen blijft bestaan, omdat de cel monolaag grotendeels onzichtbaar in de gestolde gel voor het snijden blijft. Bovendien kunnen cytospine bereiding van cellen hun cellulaire organisatie veranderen door celspreiding en de kwetsbaarheid van de celstructuur. Vandaar dat deze inherente nadelen rechtvaardigen een nieuwe benadering voor TEM studies uit te voeren vanaf zeldzame celpopulaties met meerconsistentie. Om dit probleem op te lossen, hebben we een nieuwe en alternatieve monstervoorbereiding methode beschreven voor TEM studies zeldzame celpopulaties 7.

Hier melden wij een efficiënte monstervoorbereiding protocol om TEM uit te voeren vanaf schaarse biologische monsters met consistente kwalitatieve en kwantitatieve resultaten. Evans blauw kleuring werd uitgevoerd na bevestiging aan een kleine cel pellet van lage aantal cellen, dat wil zeggen, 10.000 beenmerg hematopoietische stamcellen en stamcellen die anders onzichtbaar zou zijn gebleven lokaliseren, en de pellet werd ingebed in agarose voor uitdroging en hars inbedding processen. Deze methode bundelt de cellen elkaar en maakt een efficiënte analyse van de ultrastructuur en subcellulaire organisatie van hematopoietische stamcellen (aangeduid als Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -, HSC), een zeldzame 0,2-0,5% celpopulatie in het beenmerg. Deze experimentele proprotocol kan nuttig zijn om ultra-structurele studies uit te voeren en de kwantitatieve resultaten op vele zeldzame, maar zeer belangrijke populatie te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de institutionele dier commissie bij Research Foundation de Cincinnati Children's. Voor dit onderzoek werden hematopoietische stamcellen uit het beenmerg van C57BL / 6 inteeltmuizen leeftijd 2-4 maanden. Celsortering middels FACS na kleuring van BM met verschillende oppervlakte makers zoals Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 en CD34 werd gebruikt voor zuivering van HSC op basis Lin- Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating strategie standaard protocol beschreven vóór 8.

LET OP: Een aantal zeer giftige chemicaliën worden gebruikt tijdens deze procedure. Deze zijn giftig bij inademing en contact met de huid. Draag handschoenen en beschermende kleding. Werken in zuurkast tijdens het werken met deze chemicaliën.

1. Cellen, Fixatie, vlekken en pre-inbedding

  1. Sorteren 10.000 hematopoietische stamcellen (middels Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating strategie; LT-HSC populatie) in een 1,5 ml microcentrifugebuis met 600 pl Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) met 10% foetaal runderserum middels FACS.
  2. Spin down gesorteerde HSCs bij 1000 g gedurende 10 min in een 1,5 ml microcentrifugebuis met een centrifuge met swing-out emmers. Verwijder medium door behoedzame aspiratie en laat 200 ul medium in de buizen bij elke stap. In dit stadium de celpellet onzichtbaar blijft in de buis.
  3. Fixeer de cellen door toevoeging van 0,2 ml 2x fixeeroplossing bij kamertemperatuur (KT) gedurende 1 uur 1,9.
    1. Maak de fixerende oplossing vers voor gebruik. Bij 1x wordt de oplossing bestaat uit 3% paraformaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaatbuffer.
  4. Centrifugeer de cellen bij 1000 xg gedurende 10 min bij 30 ° C onder toepassing van een centrifuge met swing-out emmers.
  5. Was de cellen met 600 pi 0,1 M cacodylaatbuffermiddels centrifugatie en laat 200 pl buffer in de buis na centrifugeren.
  6. Vlekken op de gefixeerde cellen door toevoeging van 200 ui 2 mg / ml oplossing van Evans Blue in cacodylaatbuffer en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. De cellen zullen blauw gekleurd.
  7. Was de cellen 3 maal met 600 ui 0,1 M cacodylaatbuffer middels centrifugatie en laat 200 pl buffer in de buis telkens.
  8. Resuspendeer de cellen in 200 ul buffer en breng de celsuspensie aan een 0,5 ml buis. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min met behulp van een tafelblad centrifuge. Verwijder voorzichtig buffer zonder de nu zichtbaar kleine celpellet en laat 50 pl buffer in de buis.
  9. Voeg 200 mg laagsmeltende agarose 5 ml 0,1 M cacodylaatbuffer in de 15 ml buis voor een 4% agarose-oplossing. Smelt de agarose door de overdracht van de buis aan kokend water in een 100 ml glazen fles en blijf lauw tot gebruik.
  10. Voeg 200 ui 4% laagsmeltende agarose opgelost in 0,1 M cacodylaTE-buffer aan de celsuspensie in 0,5 ml buis direct gecentrifugeerd bij 1000 xg gedurende 10 min bij 30 ° C met een tafelblad centrifuge.
  11. Na bevestiging dat cellen gepelleteerd onderaan de 0,5 ml buis in de halfvaste agarose na centrifugatie geeft de buis 4 ° C of ijs overdragen gedurende 20 min om de agarose stollen. Deze stap is zeer kritisch, als een kleine toegankelijk celpellet in deze stap resulteert in een goede cluster van cellen onder de elektronenmicroscoop.
  12. Breng voorzichtig de gestolde agarose met de celpellet van de buis naar een 35 mm plastic petrischaal met buffer met behulp van een 27 G naald 3,10.
  13. Trim de gestolde agarose met de celpellet in een stuk van ongeveer 1-2 mm met een scalpel. Breng de agarose stuk met de celpellet om een ​​nieuwe 1,5 ml buis.
  14. Was 2-3 maal van 600 gl 0,1 M cacodylaatbuffer door het toevoegen en verwijderen van buffer met een pipet zonder centrifugeren. Gebruik deze agarose stuk waarin de cel pellet voor de volgende stap. Bij deze stap kan het monster worden bewaard bij 4 ° C geïncubeerd alvorens naar de volgende stap.

2. Osmification, Uitdroging, Embedding

  1. Verwijder de cacodylaatbuffer van 1,5 ml buis met de celpellet met agarose met een pipet. Voeg 1,0 ml van 1% osmiumtetraoxide (OsO 4) oplossing in een zuurkast, en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  2. Was driemaal met 600 ui 0,1 M cacodylaatbuffer en overbrengen van het monster naar een 20 ml glazen scintillatiebuisje met een kap.
  3. Verwerk de steekproef voor uitdroging, infiltratie en het integreren hars (bijv LX-112) met periodieke veranderingen van de volgende oplossingen in een 6-wells plaat. Verplaats de cel-pellet agarose stuk behulp van een tang.
    1. Dompel het monster in 25% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    2. Dompel het monster in 50% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    3. Dompel het monster in 75%ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    4. Dompel het monster in 95% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    5. Dompel het monster in 100% ethanol bij kamertemperatuur gedurende 15 min, tweemaal.
    6. Dompel het monster in ethanol: resin (3: 1) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    7. Dompel het monster in ethanol: resin (1: 1) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    8. Dompel het monster in ethanol: resin (1: 3) bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    9. Dompel het monster in zuivere hars bij kamertemperatuur gedurende 60 min, tweemaal.
  4. Breng het monster op de bodem van de piramide tip vormige rubber mal met behulp van een tang zorgvuldig en voeg meer pure hars op de top van het monster om de mal te vullen. Incubeer het monster bij 60 ° C gedurende 72 uur voor polymerisatie hars.
  5. Verwijder de gepolymeriseerde hars piramide van de mallen door het verdraaien van de rubberen mal. Een kleine zwarte cluster van cellen moet zichtbaar zijn in de gepolymeriseerde hars piramide, zoals eerder 7 beschreven. Bevestig de gepolymeriseerde hars piramide op de montage van de cilinder met behulp van cyanoacrylaat.

3. Snijden en Transmission Electron Microscopy

  1. Knip het piramideblok met een scheermesje en een diamanten mes na montage het blok op een ultra-microtoom. Voeg een korte brede trapeziumvorm met de bovenkant en de onderkant van het blok evenwijdig aan elkaar en bij gelijkmatig schuine kanten. Deze vorm van de piramide helpt voor seriële snijden.
  2. Verder, trim het blok rond de cel pellet met de diamant mes en verwijder de plastic delen rond de cel pellet agarose stuk.
  3. Snijd 1 micrometer secties met behulp van een ultra-microtoom. Verplaats de 1 micrometer secties uit het water boot naar een glasplaatje met behulp van een wimper gereedschap en een metalen lus gereedschap zoals eerder gemeld 7. Transfer secties op objectglaasjes en overdracht objectglaasjes hete plaat (37 ° C) te drogen.
  4. Een druppeltje toluïdineblauw oplossing van de secties met een spuit met 0,22 urn filter en incubeer gedurende 3 min. Spoel de dia's met gedestilleerd water en let de secties drogen. Controleren met een lichtmicroscoop om de positie van de cellen te identificeren.
  5. Snijd ultra-dunne secties (70-100 nm) met een diamanten mes. Move 2-3 secties op 200-mesh netten uit het water boot naar een glazen petrischaal met behulp van een wimper tool.
  6. Breng de glazen petrischaal met netten sectie om een ​​hete plaat bij 30 ° C te drogen secties 30 min.
  7. Vlekken op de roosters met dalingen van 1% uranylacetaat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en spoel in gedestilleerd water 6-8 tijden. Vlek met Reynolds loodcitraat bij kamertemperatuur 5 minuten en spoel in gedestilleerd water 6-8 keer. Breng de glazen petrischaal met de roosters een hete plaat bij 37 ° C te drogen secties.
  8. Analyseer de secties met een elektronenmicroscoop bij 80 kV 7.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een efficiënte en consistente protocol voor monstervoorbereiding tot TEM analyse van een gering aantal cellen wordt beschreven uit te voeren. Post-fixatie kleuren met Evans blauw en de overdracht van cellen naar een 0,5 ml microcentrifugebuis geholpen visualiseren kleine celpellet 7. Osmification met osmiumtetraoxide in agarose geleid tot een eenvoudige detectie van het donkere celpellet gedurende de dehydratie en inbedding.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze methode maakt het mogelijk TEM analyse van laag aantal cellen, met behulp van Evans blauwe vlekken en agarose inbedding een kleine cel pellet te lokaliseren tijdens de uitdroging, hars inbedding en snijden processen. Belangrijk stelt zij celgroepen elkaar en behoudt de cel ultra-structuur, hetgeen wenselijk om meerdere cellen voor het kwantificeren van data worden onderzocht.

In TEM onderzoeken, wordt een celpellet met miljoenen cellen vaak vereist voor een efficiënte inbedding in een a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken de Pathology Research Core voor de hulp bij elektronenmicroscoopanalysestudies in het Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Het werk werd ondersteund door NIH (American Society of Hematology Bridge award naar MDF; R01 DK102890 naar MDF).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Paraformaldehyde 20% Aqueous SolnElectron microscopy Sciences15713VOORZICHTIG Toxisch via inademing, contact met de huid. Draag handschoenen, gebruik afzuiging.
Gluteraldehyde 70% Aqueous SolnElectron microscopy Sciences16350VOORZICHTIG Toxisch via inademing, contact met de huid. Draag handschoenen, gebruik afzuiging.
Cacodyladate buffer Electron microscopy Sciences12300Maak 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in gedistilleerd water, bewaar bij 4 °C. VOORZICHTIG Irriterend bij inademing of contact met de huid, draag handschoenen en werk in afzuigkap.
Evans Blue SigmaE-2129
Low melting agarose Sigma AldrichA-5030
Osmium tetraoxideElectron microscopy Sciences191301 g in 50 ml van 0.1 M cacodyladate buffer om 2% OsO4 voorraad te maken, VOORZICHTIG Zeer toxisch bij inademing of contact met de huid, sterke oxidator, draag beschermende kleding, oogbescherming, gebruik afzuigkap.
LX-112 Inbeddingskits (LADD®)
DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)LADD21340Meng 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 samen en voeg vervolgens 1.4% DMP-30 toe
NMA (Nadic methyl anhydride)LADD21350
Epoxyharsen Epon 812 (LX-112)LADD21310VOORZICHTIG Toxisch via inademing, contact met de huid. Draag handschoenen, beschermende kleding, gebruik afzuigkap.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)fenol)LADD21370
Reynolds lead citrate (EM Stain II)LeicaVOORZICHTIG Toxisch via inademing, vermijd contact met de huid of ogen.
Uranyl acetate (EM Stain I)Leica8072820VOORZICHTIG Toxisch via inademing, vermijd contact met de huid of ogen.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)ATCC30-2005samenstelling: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, natriumpyrovaronaat etc. Voor details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
Pyramid tip mold Ted Pella10585
montage cilindersTed Pella10580
Ultra-microtome (Leica EM UC7)
200 mesh grids (nikil)Electron microscopy SciencesG-200 Ni
ElektronenmicroscoopHitachi model H-7650 
BeeldopnamesoftwareAMT-600 
35 mm plastic petrischalenFisher scientific
Quick Bond Super lijm Cyanoacrylaat Electron microscopy Sciences72588
Veiligheidsmesjes
Glazen scintillatiebuisjes Fisher scientific 03-337-14
Glazen objectglaasjes 
Eyelash tool
Metaal lus tool 

Referenties

  1. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
  2. Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
  3. Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
  4. Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
  5. Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
  6. Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
  7. Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
  8. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
  9. Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
  10. Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
  11. Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hematopo tische stamcellenEvans Blue kleuringagarose inbeddingosmiumtetroxideultramicrotoom sectioneringuranylacetaat kleuringloodcitraat kleuring

Gerelateerde artikelen