Er zijn nieuwe isolatiemethoden voor primaire endotheelcellen uit bloedvaten nodig. Dit protocol beschrijft een nieuwe techniek die bloedvaten van belang volledig omkeert, waardoor alleen de endotheelzijde wordt blootgesteld aan enzymatische vertering. De resulterende pure endotheelcelcultuur kan worden gebruikt om hart- en vaatziekten, ziektemodellering en angiogenesis te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en Cultuur van primaire endotheelcellen van Canine slagaders en aders
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hart- en vaatziekten worden bestudeerd in zowel de menselijke als de diergeneeskunde. Endotheelcellen zijn uitgebreid gebruikt als een in vitro model om vasculogeneze, (tumor) angiogenese en atherosclerose te bestuderen. De huidige standaard voor in vitro onderzoek naar menselijke endotheelcellen (EC's) is het gebruik van Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC's) en Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAEC's). Voor caninendotheelonderzoek is er slechts één cellijn (CnAOEC) beschikbaar, afgeleid van canin aorta-endotheel. Hoewel dit momenteel nog niet volledig wordt begrepen, is er een verschil tussen EC's afkomstig uit slagaders of aders. Voor een meer directe aanpak van in vitro functionaliteitsstudies op EC's, beschrijven we een nieuwe methode voor het isoleren van Canine Primary Endothelial Cells (CaPEC's) uit verschillende bloedvaten. Deze techniek vermindert de kans op besmetting met snelgroeiende cellen zoals fibroblasten en gladde spiercellen, een probleem dat gebruikelijk is bij standaard isolatiemethoden zoals het doorspoelen van het vat met enzymatische oplossingen of het snijden van het vat voorafgaand aan de vertering van het weefsel dat alle cellen bevat. De techniek die we beschrijven, is geoptimaliseerd voor het hondenmodel, maar kan gemakkelijk worden toegepast op andere soorten zoals mensen.
Inleiding
Honden worden gebruikt als grote diermodel voor cardiovasculaire ziekte onderzoek en kan ook last hebben van aangeboren (genetische) vasculaire abnormaliteiten 1, 2. Om deze ziekten commerciële endotheliale cellijnen worden vaak gebruikt om endotheelcellen (EC) functionaliteit beoordelen bestuderen. Voor honden is er een commercieel endotheliale cellijn beschikbaar (CnAOEC), afkomstig van honden aorta. Deze cellijn wordt meestal gebruikt in studies als controle normale EC 3-5. In menselijke cardiovasculair onderzoek het meest gebruikte endotheliale cellijnen humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) en Human Umbilical Artery endotheelcellen (HUAECs) afgeleid van menselijke navelstreng ader en slagader, respectievelijk. HUVEC's werden gebruikt als de gouden standaard voor vasculaire onderzoek sinds 1980 6. Zij worden beschouwd als de klassieke modelsysteem endotheelfunctie en aanpassing ziekte bestuderen. Endotheelcellen geïsoleerd uit verschillende bloedvaten variëren appearance en functionaliteit door genetische achtergrond en blootstelling aan de micro-7. Bovendien, HUVEC en HUAECs zijn afgeleid van navelstreng, een ontwikkelings vasculaire structuur die misschien niet volledig nabootsen volwassen bloedvaten met betrekking tot de voorwaarden die worden blootgesteld en respons op disease. Vandaar dat het vertalen van de resultaten gevonden in HUVECs en HUAECs aan hart- en vaatziekten in het algemeen onvoldoende is.
Bij het bestuderen aanpassing en gedrag van volwassen EC moet primaire EC uit het vat plaats worden gebruikt als een directere aanpak. Om deze cellen te isoleren, zijn verscheidene werkwijzen gerapporteerd. Een veel beschreven werkwijze, die ook wordt gebruikt voor HUVEC, wordt het vat spoelen met een enzymatische digestieoplossing 8. Dit resulteert vaak verontreinigd met niet-ECs zoals gladde spiercellen en fibroblasten 9. Een andere veel gebruikte werkwijze voor isolatie enzymatische digestie van gehakt vaatweefsel gevolgd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) op basis van endotheelcellen marker Cluster van Differentiatie (CD) 31 7, 8. FACS sortering en daaropvolgende celcultuur vereist relatief veel cellen en is daarom niet geschikt voor het isoleren van endotheel van kleine bloedvaten. Wij zijn dan ook gericht op het ontwikkelen van een nieuwe robuuste methode voor het isoleren van een zuivere endotheelcellen bevolking uit verschillende honden bloedvaten met een hoge zuiverheid. Om de efficiëntie van de nieuwe isolatiewerkwijze testen we geïsoleerd en verkregen zuivere Canine Primaire endotheelcellen (CAPEC) kweken van verschillende honden slagaders en aders, zowel grote als kleine. Deze methode maakt het ook mogelijk de cultuur van endotheelcellen afkomstig van zieke en / of afwijkende schepen zoals aangeboren intra- of extra-lever portosystemische shunts, een veel voorkomende ziekte bij honden 2. De werkwijze maakt de isolatie van aanvullende relevante celtypes van hetzelfde vat zoals vasculaire gladde spiercellen aangezien de meeste van het vaartuig blijft intoptreden tijdens de procedure.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethiek statement: Bloedvaten die in deze studie werden geoogst als overtollig materiaal verkregen uit verse honden kadavers (n = 4) van gezonde honden gedood voor andere niet-verwante onderzoek (Universiteit 3R-beleid). Afwijkende bloedvaten (intra- en extrahepatische portosystemische shunts, n = 1 elk) werden geoogst post-mortem na geïnformeerde toestemming van de eigenaren van honden voorgelegd aan de Universiteitskliniek voor Gezelschapsdieren van de Universiteit Utrecht.
1. Isolatie en cultuur van de Primary Canine endotheelcellen
- Voorbekleding 6-well platen met 2 ml / putje 0,5% w / v gelatine, laat gedurende 2 uur in een incubator met een vochtige atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Verwijder overtollig gelatine-oplossing voorafgaand aan het zaaien van de primaire cellen.
- Aseptisch verwijderen van het bloedvat (s) van belang (bijvoorbeeld, aorta, vena cava, vena porta) uit een nieuw hond kadaver (Figuur 1A). Handhaving van de anatomie van het schip systeemdoor het plaatsen van rechte tang aan beide uiteinden van het vat plaats. Onnodige manipulatie van het weefsel met een tang om schade aan de endotheelcellen te voorkomen.
- Snijd de geklemd vat aan beide uiteinden voorzien chirurgische schaar en uit het kadaver. Transport in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) op ijs.
LET OP: Een vaartuig lengte van circa 5 cm is de voorkeur voor deze procedure, maar die 1 cm meten zal ook voldoende cellen tot cultuur.
- Snijd de geklemd vat aan beide uiteinden voorzien chirurgische schaar en uit het kadaver. Transport in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) op ijs.
- Breng de bloedvat een petrischaal gevuld met ijskoude HBSS. Gebruik chirurgische schaar, verwijder aanhechtend weefsel en vet van de buitenkant van het vat, waarbij het vat zelf intact (Figuur 1B). Zorg ervoor dat het vat is duidelijk zichtbaar te allen tijde bij het snijden: trek vernietiging van het omringende weefsel met een klem of pincet voor een optimale weergave.
- Sluit alle takken van het schip met ligaturen (bijv polyglactine 3-0) en vervolgens deze te verwijderenmet chirurgische schaar of een scalpel.
- Voer voorzichtig een vat met een gebogen uiteinde Halsted mosquitoklem klemt het uiteinde van de tang aan het andere einde van het vat en vervolgens terugtrekken langzaam omkeren van het vat totdat het volledig binnenste buiten (figuur 1C-G). De buitenkant bestaat nu uit de endotheliale cellaag. Als er een probleem wordt aangetroffen op het omkeren van het vat, onder te dompelen in HBSS opnieuw om wrijving te verminderen.
- Plaats samentrekkende hechtdraden aan beide uiteinden van het vat om het volledig sluiten en de blootstelling van niet-endotheliale vaatweefsel de destructieprocedure (Figuur 1H) te voorkomen. Gebruik de ligatuur uiteinden om de omgekeerde vat te manipuleren.
- Als de spijsvertering en cultuur later wordt uitgevoerd, cryopreserve de omgekeerde vat voorafgaand aan de vertering protocol (stap 1.7).
- Leg de omgekeerde vaartuig in een cryovial en vul met celcultuur bevriezing medium. Ontdooide tot -80 ° C met een ijskoud container. Bewaar bij -80 ° C of vaartuigen voor gebruik binnen een week. Voor de lange termijn opslag, plaats cryovials bij -180 ° C. Bij het uitvoeren van het EG-isolatie, dooi de cryovials snel in een waterbad (37 ° C) en onmiddellijk plaatsen in ijskoude HBSS. Handel zoals beschreven in 1.7.
LET OP: Houd er rekening mee dat de totale opbrengst van de EC na isolatie lager zal zijn als gevolg van het verlies van de levensvatbaarheid tijdens het invriezen.
- Leg de omgekeerde vaartuig in een cryovial en vul met celcultuur bevriezing medium. Ontdooide tot -80 ° C met een ijskoud container. Bewaar bij -80 ° C of vaartuigen voor gebruik binnen een week. Voor de lange termijn opslag, plaats cryovials bij -180 ° C. Bij het uitvoeren van het EG-isolatie, dooi de cryovials snel in een waterbad (37 ° C) en onmiddellijk plaatsen in ijskoude HBSS. Handel zoals beschreven in 1.7.
- Breng het vaartuig naar een 50 ml buis en spoel het twee keer in HBSS om erytrocyten te verwijderen (of resterende bevriezing medium in het geval van het ontdooien) (Figuur 1I).
- Digest het vaartuig in een 50 ml buis met een oplossing van 30 ml collagenase type II (0,15 U / ml) en dispase (0,15 U / ml) in Canine endotheelcellen groeimedium (CECGM) gedurende 1 uur bij 37 ° C met intermitterende zachte agitatie.
- Verwijder het vat uit de buis en centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 250 x g.
- Resuspendeer de celpellet in een CECGMnd zaad 2 ml celsuspensie per putje (1-3 putten afhankelijk van de grootte van het vaartuig). De cellen te kweken bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 in lucht en veranderen het kweekmedium tweemaal per week.
- Passage van de cellen bij een confluentie van 70-80% bereikt.
- Was de cellen met voorverwarmd HBSS om dode of niet-ingeschreven cellen te verwijderen. Voeg 200 ul recombinant cel-dissociatie enzym (1x) aan elk putje en zet terug in de incubator gedurende 5 minuten of totdat alle cellen worden losgemaakt.
- Overdracht van de cellen om een 15 ml buis en stop trypsine door toevoeging van 10 ml kweekmedium (CEGM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS). Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 250 x g. Voortzetting van de cultuur in een gelatine pre-gecoate plaat of kolf.
2. Analyse
- Cultuur Canine aorta endotheelcellen (CnAOECs) te zoeken en de morfologie van de primaire en commerciële cellijnen tweemaal per week met een microscoop.
LET OP: THij typische groeiende patroon van de EC aan flarden kan het best worden waargenomen wanneer een confluentie van> 70% is bereikt.- Cultuur CnAOECs in CECGM op een 0,5% w / v gelatine voorbekleed T75 kolf. Passage cellen eenmaal per week bij de confluentie is 70-80%.
- Voor passage, was de cellen eenmaal met voorverwarmde HBSS en voeg 1 ml recombinant cel-dissociatie enzym (1x). Plaats de kolf opnieuw in de incubator gedurende 5 minuten of totdat alle cellen worden losgemaakt. Inactiveren trypsine door toevoeging van 10 ml kweekmedium (CEGM) inclusief 10% FCS. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 250 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml kweekmedium.
- Neem een 10 pl aliquot van de celsuspensie en verdund 1: 1 met 0,4% trypan blauw. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde cel tegen te gaan, en de plaat uit 4,0 x 10 5 levensvatbare cellen in een nieuwe T75 kolf. Voeg 10 ml voorverwarmd CECGM aan de kolf en kweek bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
- Cultuur CnAOECs in CECGM op een 0,5% w / v gelatine voorbekleed T75 kolf. Passage cellen eenmaal per week bij de confluentie is 70-80%.
- Isoleer RNA van passage 1 van de gekweekte CaPECs en CnAOECs.
- Vang minimaal 1 x 10 3 cellen als pellet, voeg 20 ul monsterbereiding reagens (SPR) en incubeer gedurende 1 min om de cellen te lyseren. Na incubatie zorgvuldig verzamelen cellysaat bevattende totaal RNA en bewaar bij -70 ° C.
- Converteren mRNA in cDNA met behulp van een cDNA-synthese kit (bijv iScript) volgens de instructies van de fabrikant. cDNA bewaar bij 4 ° C maximaal een week, of bij -20 ° C voor lange termijn tot gebruik de qPCR voeren.
- Meet genexpressie van de endotheliale marker CD31 om endotheelcellen oorsprong te bevestigen. Voer experimentele opstelling en kwantificering met behulp van de MiQE précis richtlijnen 10. Voor normalisatie, het meten van de expressie van genen verwijzing GAPDH, RPS19 en B2MG 11.
- Bereid een 10-voudige verdunning van het verkregen cDNA in nuclease vrij water.
- Klaarmakeneen 4-voudige verdunning van samengevoegde cDNA monsters voor de standaardlijn en gebruik nuclease vrij water als een niet-mal controle. Verdun de monsters vijf keer naar een 50-voudig de totale verwatering voor qPCR reacties te bereiken. Pipetteer 10 ul reacties in tweevoud in een 384-well formaat met behulp van 4 pi cDNA en 6 pi van de fluorofoor gemengd met 20 pmol reverse en voorwaartse primer (tabel 1).
- Stel het programma 95 ° C gedurende 5 min voor Taq polymerase activering, gevolgd door 39 cycli van 10 sec bij 95 ° C voor denaturatie, en 30 sec bij Tm voor annealing en verlenging. De Tm voor elke primerset wordt weergegeven in tabel 1.
- Voeren smeltcurve analyses na elke run op slechts één product te waarborgen wordt versterkt. Normaliseren van de expressieniveaus van de monsters met de gemiddelde hoeveelheid die de referentie genen, en bereken de ACt als reactie-efficiëntie tussen 95% en 105%.
- Assess EG functionaliteit met een Angiogenesis assay.
- Voeg 10 ul van extracellulaire matrix aan elk putje van een voorgekoelde angiogenese glijbaan en verspreid met een pipet op het oppervlak van de put omvatten. Houd de extracellulaire matrix op ijs en vermijd de introductie van luchtbellen in de gel. Stollen de gel door het plaatsen van de slede in een petrischaal met water doordrenkte papieren handdoekjes in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 30 minuten.
- Voeg 1,0 x 10 4 primaire EC aan 50 gl endotheelcellen groeimedium per putje. Incubeer de glijbaan voor 6 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Na 6 uur foto's nemen met een 20x vergroting, en zorg ervoor dat het geheel goed onder in het beeld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Verschillende bloedvaten werden met succes aan de beschreven isolatieprotocol (figuur 2). Het was mogelijk om te ontleden en te keren aorta, vena cava, vena porta en kransslagader van gezonde honden (alle schepen van elke hond, n = 4). Met dezelfde aanpak EC werden geïsoleerd uit twee aangeboren portosystemische shunts (extrahepatische en intrahepatische, n = 1 per stuk). Hoewel aorta gemakkelijk werd omgekeerd, thoracale aorta segmenten waren een grotere uitdaging dan d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In studies gericht op honden EC de primaire lijn CnAOEC wordt gebruikt om de endotheliale lijnen van de hond 3, 12, 13 te modelleren. In humane studies, is de HUVEC cultuur nog steeds beschouwd als de gouden standaard. Het is duidelijk dat, met de nadruk alleen op de EC afkomstig uit de navelstreng is een stevige beperking in de cardiovasculaire onderzoek. Endotheelcellen een genexpressie patroon bepalen arterioveneuze specificatie. Om rekening houden met deze verschillen in postnatale vaartuigen stellen wij ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Hans de Graaf en Tomas Veenendaal bedanken voor hun technische hulp bij het kweken van de EC's.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Bewaar op ijs voor gebruik |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Laat langzaam ontdooien op ijs |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
Referenties
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128(2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445(2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183(2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74(2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
