Identificatie van vetzuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

Samenvatting

We stellen een protocol voor om vetzuren te identificeren zonder dat ze hoeven te worden gezuiverd. Het combineert informatie over de retentietijd met de massaspectra van drie soorten vetzuurderivaten: vetzuurmethylesters (FAME's), 4,4-dimethyloxazolinederivaten (DMOX) en 3-pyridylcarbinylester (picolinyl).

Samenvatting

Bacillus species bevatten vertakte keten en onverzadigde vetzuren (FA's) met verschillende posities van de methylvertakking (iso- of anteiso) en de dubbele binding. Veranderingen in FA samenstelling spelen een cruciale rol in de aanpassing van bacteriën aan hun omgeving. Deze veranderingen leiden tot een verandering in de verhouding van iso versus anteiso vertakte FA, en in de hoeveelheid onverzadigde FA opzichte van verzadigde FA's met dubbele bindingen gemaakt op specifieke posities. Nauwkeurige beschrijving van de FA profiel moet de aanpassingsmechanismen van Bacillus species begrijpen.

Veel van de FA van Bacillus zijn niet commercieel beschikbaar. De hierin voorgestelde strategie identificeert FA's door het combineren van informatie over de retentietijd (door berekening van de equivalente ketenlengte (ECL)) met de massa spectra van drie soorten FA derivaten: vetzuurmethylesters (FAME), 4,4-dimethyl oxazoline derivaten (DMOX), en3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). Deze methode kan de FA identificeren zonder de noodzaak om de onbekende FA zuiveren.

Vergelijking chromatografische profielen van FAME bereid uit Bacillus cereus met een commercieel mengsel van standaarden maakt de identificatie uit onvertakte verzadigde FA's, de berekening van de ECL en hypotheses over de identiteit van de andere FA. FAME vertakte verzadigde FA's, iso- of anteiso, vertonen een constante negatieve verschuiving in de ECL, vergeleken met lineaire verzadigde FA's met hetzelfde aantal koolstofatomen. FAME onverzadigde FA kan worden gedetecteerd door de massa van de moleculaire ionen en leiden tot een positieve verandering in de ECL vergeleken met de overeenkomstige verzadigde FA's.

De vertakking positie van FA en de dubbele binding positie van onverzadigde FA kan worden geïdentificeerd door het elektron ionisatie massaspectra van picolinyl en DMOX derivaten, respectievelijk. Deze benadering identificeert alle onbekende verzadigde taked FA, onverzadigde rechte keten FA en onverzadigde vertakte FA uit de B. cereus extract.

Inleiding

Vetzure methylester (FAME) gaschromatografie (GC) is een belangrijke methode voor lipide karakterisering. Al snel scheidt en kwantificeert de verschillende vetzuren (FA) van een monster na een korte extractiestap. Derivaten van methylesters zijn zeer volatiel, stabiel en inert ten opzichte van de chromatografiekolom, waardoor pieken met staarten vermeden. Hun identificatie is vrij eenvoudig als het monster uit bekende FA omdat de chromatografische profielen ofwel gepubliceerd of in vergelijking met de normen. Bovendien wordt de herhaalde injectie van kalibratiestandaarden voor het kwantificeren van verschillende FA niet vereist, gezien hun nagenoeg constant reactie op vlamionisatiedetectie (FID) ^1.

Naast FID, massaspectrometrie (MS) detectie levert een reeks aanvullende informatie FAME bevestigen. Echter, wanneer FAME's worden opgeladen met behulp van electron ionisatie (EI), de resulterende spectra niet altijd mogelijk voor the identificatie van FA fijne structuur. Bijvoorbeeld, vertakking positie (dat wil zeggen een vertakte methylgroep) is moeilijk te voorspellen, omdat de diagnostische ionen zijn moeilijk op te sporen ¹ en Karakteristiek doelion overvloed machine-afhankelijk, die het gebruik van massaspectra bibliotheken ^2. Een andere uitdaging ligt in het identificeren van de dubbele binding positie, omdat EI veroorzaakt dubbele binding migratie. Zo kan FA isomeren met verschillende dubbele binding posities niet worden onderscheiden door hun massa spectra. Gelukkig zijn andere instrumenten ontwikkeld voor FA identificatie. Zo kan de aanwezigheid en de positie van vertakking of dubbele bindingen in FA worden gegist door berekening van de equivalente ketenlengte (ECL) ^3.

Derivatisering andere methoden resulteren in verschillende massaspectra, afhankelijk van de plaats van een dubbele binding of een vertakte methylgroep. 4,4-dimethyl oxazoline derivaten (DMOX) ⁴ zorgen voor EASy identificatie van de plaats van enkelvoudig onverzadigde vetzuren dubbele bindingen. 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl ester) derivaten zorgen voor de ondubbelzinnige identificatie van de locatie van methylvertakte FA ^5. Combineren chromatografische (ECL) en massaspectra (DMOX en picolinyl) informatie kan bij de identificatie van de meeste FA zonder dat ingewikkelde zuiveringsmethoden gebruikt, zoals vereist voor kernspinresonantie (NMR) spectrum, het onbetwistbaar werkwijze voor structuurkarakterisering ¹ .

Bacteriën van het genus Bacillus, die een aantal menselijke en dierlijke pathogenen omvatten, kunnen zeer divers niches koloniseren en worden daarom op grote schaal in het milieu ^6. Onder het geslacht Bacillus, wordt FA vorm beïnvloed door de ecologische niche van de diersoorten die modulaties in FA patronen aan te passen aan uiteenlopende omgevingsveranderingen (bijvoorbeeld groeimedium, temperatuur,pH, etc.) ^7-9. Vanwege de relatieve homogeniteit van de FA patroon over species van het genus Bacillus tijdens de groei in gestandaardiseerde omstandigheden bepaling FA samenstelling is één van de belangrijkste criteria voor de Bacillus species definiëren. Een unieke eigenschap van de Bacillus genus is de overvloed van vertakte FA's met 12-17 koolstoffen ^10-12 met de verhouding tussen iso en anteiso isomeren als een belangrijke determinant van de aanpassing aan de milieu-omstandigheden. Bacillus species tevens aan aan omgevingschommelingen door het veranderen van de hoeveelheid onverzadigde vetzuren. In sommige species, zoals Bacillus cereus, twee vetzuurdesaturasen maken dubbele bindingen in verschillende posities van de alkylketen ¹³ verschillende rollen in aanpassing ^9. Het voorbeeld van de Bacillus genus illustreert het belang van de dubbele binding positie nauwkeurig identificeren en FA vertakking. Verzamelensluitend, de identificatie van Bacillus FA patronen heeft verschillende nuttige toepassingen. Hierin stellen we een nieuwe GC-MS benadering voor Bacillus FA patroonidentificatie dat de inherente beperkingen van een klassieke GC-MS analyse overwint.

Deze innovatieve benadering kan direct worden gebruikt op ruw biologisch materiaal, en bestaat uit een combinatie van bestaande technieken: gegevens over retentietijden (ECL) en massaspectra van verschillende FA derivaten (FAME, DMOX en picolinyl-ester).

We gebruiken de volgende FA nomenclatuur. i, een en n geven iso, anteiso methylgroep vertakt en onvertakt vetzuur, respectievelijk. Onverzadigde FA werden genoemd door C: d waarin C het aantal koolstofatomen in het vetzuur en d is het aantal dubbele bindingen. Δ ^x de positie van de dubbele binding, waarbij de dubbele binding zich op de xe koolstof-koolstofbinding, vanaf de carbonzuureindgroep.

Protocol

1. Bacteriële Culturen

1. Bereid een grasveld van de bacterie (Bacillus cereus-stam ATCC 14579) door het verspreiden van een 100 pl overnachtkweek van de stam geïncubeerd bij 30 ° C in LB (Luria-Bertani medium), over het oppervlak van een plaat van LB-agarmedium. Incubeer de plaat overnacht bij 30 ° C.

2. ECL: Equivalent Chain Lengte

1. Bereken ECL als volgt: met:
   i, de opgeloste stof van belang;
   n het aantal koolstofatomen van de rechte keten verzadigd vetzuur methylester geëlueerd voordat opgeloste I;
   n + 1, het aantal koolstofatomen van de rechte keten verzadigd vetzuur methylester elueren na opgeloste I;
   Rti, Rtn, Rt (n + 1) de retentietijd FAME toppen boven beschreven.
   OPMERKING: Haal de retentietijd rechte keten verzadigde vetzuren methylesters door injectie van een mengsel van standaarden (BEEN MIJ).

3. FAME Voorbereiding en Analyse

1. Om lipide vetzuren, oogst bacteriële cellen te verkrijgen door het afschrapen van kolonies van de agar plaat en de overdracht van 40 mg (vers gewicht, gelijk aan 10 ⁹ levensvatbare cellen) van bacteriën in een 10 ml glazen buis met schroefdop en PTFE afdichtingen.
2. Voer transveresteringsreactie via de ester koppeling methode ^14,15 hieronder beschreven.
   1. Voeg 5 ml 0,2 M KOH in methanol aan de verse bacteriële cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Deze reactie omvat alkalische methanolyse, het breken van de esterbinding in het lipide en het produceren van vetzuurmethylesters.
   2. Voeg 1 ml van 1 M azijnzuur om de pH te verlagen tot 7,0. Controleer de pH met een pH-teststrips.
   3. Voeg 3 ml hexaan te extraheren FAME.
   4. Transfer supernatant (organische fase) naar schone buizen en geconcentreerd door verdampen bij kamertemperatuur onder een continue stikstofstroom tot ongeveer 200 pi vindenextract. Breng het monster in een GC flacon met insert.
   5. Injecteren extracten in een gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) systeem.

4. GC / MS Voorwaarden

1. Injecteer FAME monsters in een GC-MS instrument uitgerust met een capillaire kolom ZB-WAX (lengte 30 m, diameter 0,25 mm, filmdikte 0,25 pm).
2. Stel de injectiepoort (in splitless modus) temperatuur tot 250 ° C. Gebruik helium als draaggas, met een lineaire snelheid van 37 cm / sec. Houd de oventemperatuur bij 50 ° C gedurende 1 min, toenemen tot 190 ° C met een snelheid van 20 ° C / min, en verder toenemen tot een eindtemperatuur van 230 ° C met een snelheid van 2 ° C / min.
3. Voor de MS, noteer de massa spectra door electron ionisatie (EI) bij 70 eV, en stel de overname van de totale ionenstroom tussen de 50 en 400 atomaire massa eenheden (ame) (2 scans / sec).
4. Wanneer dat nodig is, te injecteren DMOX en picolinyl derivaten onder dezelfde omstandigheden, behalvet de oven temperatuurprogramma als volgt:
   DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min tot 210 ° C en 2 ° C / min tot 240 ° C (5 min);
   Picolinyl: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min tot 220 ° C en 2 ° C / min tot 250 ° C (20 min).

5. picolinyl Ester Bereiden uit FAME ¹⁶

1. Damp het FAME extract uit deel 3 met een stikstofstroom (ten minste 10 mg droog materiaal) en los op in 1 ml droge dichloormethaan.
2. Bereid een 1,0 M oplossing van kalium-ter-t-butoxide in tetrahydrofuran.
3. Voeg de FAME extract en 0,2 ml 3-pyridinemethanol tot 0,1 ml oplossing bereid in stap 5.2.
4. Verwarm de oplossing bij 40 ° C gedurende 30 min in een afgesloten buisje.
5. Na afkoelen tot kamertemperatuur, voeg gezuiverd gedeïoniseerd water (2 ml, zie Materialen tabel) en hexaan (4 ml). Meng met een vortex, laat fase te scheiden, en het verzamelen van de organische fase.
6. Dry door toevoeging van watervrij natriumsulfaat totdat de organische fase is volkomen duidelijk. Deze hoeveelheid in een schone buis. verdampen dan naar 200 ui. Breng het monster in een GC flacon met insert.

6. DMOX Bereiden uit FAME ¹⁷

1. Damp het FAME extract uit deel 3 met een stikstofstroom (ten minste 10 mg droog materiaal).
2. De FAME droge extract, voeg 250 mg 2-amino-2-methyl-1-propanol. Spoel het vat met stikstof, voeg een stopper, en plaats deze in een verwarmings-blok 's nachts bij 190 ° C.
3. Na afkoelen tot kamertemperatuur, voeg 3 ml dichloormethaan aan de buis en 5 ml gezuiverd gedeïoniseerd water (zie tabel Materials).
4. Schud voor fasescheiding en verwijder de waterige fase.
5. Was de organische fase met 5 ml water. Schud voor fasescheiding en verwijder de waterige fase.
6. Drogen toevoeging watervrij natriumsulfaat totdat de organische fase volkomen helder endeze hoeveelheid in een schone buis. Verdamp onder een stikstofstroom, totdat de volume van 200 pl. Breng het monster in een GC flacon met insert.

Resultaten

De strategie van FA identificatie van bacteriële cellen is weergegeven in figuur 1. Elke stap geeft aanvullende spectrale informatie of informatie over chromatografische. Stap 1 bestaat uit voorlopige FA-identificatie door een standaardoplossing. Stap 2 zorgt voor de interpretatie van FAME EI spectra en de ECL, teneinde de producten voorlopig identificatie. Stap 3 identificeert de exacte vertakking locatie in vertakte-FA's. Tot slot, stap 4 identificeert de precieze ...

Discussie

De FA chromatogramprofielen getoond in Tabel 1 komen overeen met B. cereus ATCC 14579 gekweekt op een agarplaat oppervlak. Soortgelijke profielen werden verkregen wanneer de bacterie in beluchte vloeibare medium werd gekweekt bij dezelfde temperatuur ^8. Voor bacteriën gekweekt in vloeibare media, is de bacteriële biomassa door centrifugeren van het kweekmedium en kan worden gewassen volgens de eerder beschreven protocollen afhankelijk van de groeiomstandigheden ^8,19. De id...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GC/MS	Shimadzu	QP2010
capillary column ZB WAX	Phenomenex	7HG-G007-11	30 m x 0.25 mm x 0.25 µm
Methanol Lichrosolv	VWR	1.06018.2500
potassium hydroxide	Aldrich	P1767
THF	Hipersolv Chromanorm	28559.320
Dichloromethane	Hipersolv Chromanorm	23373.320
Hexane	Hipersolv Chromanorm	24575.320
3-pyridinemethanol	Aldrich	P6-680-7
potassium tertiobutoxide	Aldrich	156671
2-amino-2-methyl-1-propanol		A-9879
MilliQ Academic	Millipore	ZMQS50001
Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix	Sigma-Aldrich	47080-U Supelco